专利名称：：降低血压的寡肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及对IPP的生产。
背景技术：
：高血压是人类中相对常见的疾病状态，其代表着对心血管疾病、肾衰竭和中风的流行风险因素。大量药物产品(例如，钙阻滞剂(blocker)、beta阻滞剂、利尿剂、alpha阻滞剂、中央alpha拮抗剂、血管紧张素II拮抗剂和ACE抑制剂)的有效性，展示出高血压的基础生理机制是多方面的。针对高血压的生理机制，尤其是肾素-血管紧张素机制己引起了很多科学关注。在该机制中，血管紧张素由肝分泌，由肽酶肾素切割，以产生不具有生物活性的十肽血管紧张素I。随着血管紧张素I经过肺毛细血管，另一种被称为血管紧张素转化酶(下文中称为ACE)的肽酶通过去除血管紧张素I的最后两个残基(His-Leu)作用于血管紧张素I，形成八肽血管紧张素II。血管紧张素II八肽展示出强大的血管收缩活性，因此提高了血压。ACE抑制导致血管紧张素II水平降低，从而预防了血管收缩，因此预防了高血压。除切割血管紧张素I之外，ACE还可水解缓激肽，这是也能参与血压调控的一种九肽。在后一种机制中，ACE抑制导致缓激肽水平增加，这能促进血管舒张，也能降低血压。抑制ACE因此通过至少两种单独的途径导致血压降低。还已知，八肽血管紧张素II刺激醛固酮通过肾上腺皮质释放。醛固酮的目标器官是肾，在那里醛固酮促进肾小管对钠的再吸收增加。通过这第三种机制，对ACE的抑制能降低血压，但是在这种情况下，是通过消除钠的再吸收来实现的。因为其多种生理学作用，对ACE蛋白水解活性的抑制是降低血压的有效方法。该观念导致产生了大量有效的药物降血压产品，例如卡托普利(captopril)和依那普利(enalapril)(Ondetti，M.A.etal.，1977，Science，WashingtonDC，196，441-444)。因为高血压是相对常见的疾病状态，用具有温和活性的天然成分来控制这种现代生活方式造成的不想要的结果将是有利的。特别是能被加入到食物或饮料产品中的温和活性天然成分，因为此类产品能有规律地被消耗。或者，此类温和活性的天然成分可被包括进膳食补充剂。最近数十年来，已经发现，发酵奶中存在的特定的肽具有ACE抑制能力，能在高血压患者中诱导血压降低。近来，大量体外试验和一些动物试验己证明了从多种蛋白来源获得的不同的肽的ACE抑制作用。虽然体外ACE抑制检验已揭示出了许多不同的肽序列，但是必须强调，ACE抑制肽需要在血液中循环以施加体内影响。这暗示，有效的ACE抑制肽应当能抵抗肠胃蛋白水解消化系统的降解，并应当在随后的肠道壁上转运期间保持完整。对多种ACE抑制肽的结构-功能研究已暗示它们通常在其C-末端序列具有Pro-Pro、Ala-Pro或Ala-Hyp(Maruyama，S.andSuzuki，H.，1982；AgricBiolChem.，46(5)1393-1394)。该发现被下述事实部分解释ACE是不能切割涉及脯氨酸的肽键的肽基二肽酶(EC3.4.15.1)。因此，不能从具有Xaa-Pro-Pro结构的三肽除去二肽Pro-Pro，因为Xaa-Pro键不能被切割开。因此能想到，如果具有Xaa-Pro-Pro结构的三肽以相对高的浓度存在，其将抑制ACE活性。因为不仅ACE而且几乎所有蛋白水解酶对于切割Xaa-Pro或Pro-Pro键都有困难，肽的羧基末端存在(多个)脯氨酸残基会产生相对来说具有蛋白抗性的分子这个观点几乎就是不言而喻的。类似地，含有代替脯氨酸的羟脯氨酸(Hyp)的肽相对而言是抗蛋白的。由此可以推断出，在其羧基末端携带有一个或多个(羟)脯氨酸残基的肽可能在胃肠道中避免被蛋白水解。这些结论将帮助我们理解特定ACE抑制肽显著的体内降血压作用它们不仅达到了ACE抑制的结构需求，并且还抵抗肠胃蛋白水解消化系统的降解在随后肠道壁上转运过程中保持完整。已经报道了三肽Leu-Pro-Pro(JP02036127)、Val-Pro-Pro(EP0583074)和Ile-Pro-Pro(J.DairySci.，78777-7831995)的强大ACE抑制活性。起初对所有ACE抑制肽基于它们对ACE活性的体外影响进行分析，三肽Ile-Pro-Pro(下文中称为IPP)、Val-Pro-Pro(下文中称为VPP)和Leu-Pro-Pro(下文中称为LPP)被选出，因为它们具有强大的ACE抑制作用，导致相对低的IC50值。后来，VPP以及IPP三肽的假定抗高血压作用可在自发高血压大鼠中得到验证(Nakamuraetal.，J.DairySci.，7812531257(1995))。在这些实验中，抑制性三肽是从乳酸细菌发酵的奶中获得的。在奶发酵期间，想要的肽是通过生长中的乳酸细菌产生的蛋白酶产生的。这种发酵手段的缺点在于乳酸细菌是活的生物体，对其而言分泌的酶的类型和量都难于控制。ACE抑制肽的生产由此难于再现，而且也不太可能产生酶的最优组以确保所需肽的最大产量。此外，需要的发酵时间相对较长，这与低产量一起暗示了对于生物活性肽而言不利的成本结构。此外，发酵的产物较不适合被直接加入到a.o.固体食物中，并且会产生严格的感官限制。此类发酵奶制品的差的美味程度，以及从此类发酵培养液中回收ACE抑制肽过程中遇到的许多加工困难已被描述于US6,428,812中。尽管有这些缺点，发酵奶制品已被作为口服血管减压剂投入实践应用。电渗析、中空纤维膜渗析或色谱方法之后从发酵奶制品中浓缩ACE抑制肽，已经使其能以浓缩膳食补充剂的形式(例如，片剂或锭剂)出售。发酵生产途径的上述缺点在a.o.专利申请WO01/68115和EP1231279中被认识到。在后一申请中，描述了纯粹的酶促工艺，以从奶的酪蛋白中回收Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro。该申请要求保护一种用于生产这些三肽的方法，所述方法通过用蛋白酶和肽酶通过中间产物肽对含有奶的酪蛋白的物质进行消化来实现。这些酶温育的每一种可能持续12小时长，并且在有利于微生物污染物生长的条件下进行。在与肽酶温育之前，中间产物肽优选被纯化，高最终浓度的ACE抑制肽仅在对中间产物肽进行额外的色谱纯化步骤之后获得。考虑到上述多种不利之处，人们需要更为简单并且微生物学上更可信赖的酶促途径，来产生具有高产率和可再现的抗高血压肽的无味产品。
发明内容本发明涉及一种方法，用于生产包含来自蛋白来源的IPP的组合物，其中，从蛋白产生的IPP与VPP的比例为至少5∶1，优选至少10∶1，更优选至少20∶1(wt/wt)，所述方法优选包含使用脯氨酸特异性内切蛋白酶或脯氨酰寡肽酶。本发明还涉及不具有氨基肽酶活性的脯氨酰寡肽酶或脯氨酸特异性内切蛋白酶的用途。脯氨酸特异性内切蛋白酶优选能水解大的蛋白分子，例如多肽或蛋白自身。根据本发明的方法通常温育时间少于24小时，优选温育时间小于10小时，更优选小于4小时。温育温度通常高于30℃，优选高于40℃，更优选高于50℃。优选地，在脯氨酸末端进行切割的蛋白酶，例如脯氨酸特异性内切蛋白酶，不含任何污染性的内切蛋白酶活性。优选地，在脯氨酸末端进行切割的蛋白酶，例如脯氨酸特异性内切蛋白酶，不含污染性羧基肽酶活性。优选地，在脯氨酸末端进行切割的蛋白酶，例如脯氨酸特异性内切蛋白酶，不含污染性氨基肽酶活性。不含污染性内切蛋白酶活性的脯氨酰寡肽酶或脯氨酸特异性内切蛋白酶是优选具有小于1的Endo/Prol特异性活性比的酶制剂，更优选小于0.01。不含污染性羧基肽酶活性的脯氨酰寡肽酶或脯氨酸特异性内切蛋白酶是优选具有小于10的CPD/Pro特异性活性比的酶制剂，更优选小于1。不含污染性氨基肽酶活性的脯氨酰寡肽酶或脯氨酸特异性内切蛋白酶是优选具有小于1的AP/Pro特异性活性比的酶制剂，更优选小于0.1。在生产IPP期间，LPP也有利地形成。本发明的另一方面是从水解蛋白纯化或分离肽的方法，优选地，所述蛋白是非天冬氨酸蛋白酶水解的，更优选地，是丝氨酸蛋白酶水解的。该水解蛋白能在选定的pH条件下沉淀。纯化或分离方法包括将pH改变为所述水解蛋白得以沉淀的pH，并且将沉淀的蛋白与溶液中的肽分离。因此，本发明涉及一种方法，用于制备包含可溶肽(优选地，IPP)的组合物，所述方法包括将通过对合适的蛋白来源水解产生的组合物的pH改变为使得水解蛋白的一部分变为不可溶的pH，以及将所述不可溶的部分与可溶肽分离，以产生包含可溶肽的组合物。本发明还涉及通过对蛋白水解产生的肽组合物，其具有至少5∶1的IPP对VPP比，优选地，至少10∶1，更优选地，至少20∶1，所述组合物优选包含LPP，或者，本发明涉及一种组合物，其中包含根据本发明的可溶肽，所述组合物用作为营养药物，优选地作为药剂。本发明还涉及这些肽组合物用于生产促进健康或者预防和/或治疗疾病用的营养药物(优选地，药剂)的用途，或者用于生产用于治疗或预防高血压(highbloodpressure，也作hypertension)、心力衰竭、前糖尿病或糖尿病、肥胖、葡萄糖耐量受损或压力的营养药物(优选地，药剂)的用途。优选地，本发明的肽组合物以膳食补充剂的形式，以个人护理应用(包括以水剂、凝胶或乳剂的形式局部应用)的形式，或者作为食物、饮料、饲料或宠物食品成分来使用。发明详述根据已有技术，有效的ACE抑制肽可能在所述肽的羧基末端包括一个或两个脯氨酸残基。同样的结构要求还适用于具有增加的抗蛋白水解降解的抗性的肽，由此增加了完整的肽最终达到血流的可能性。为获得在其羧基末端具有至少一个但是优选多个脯氨酸残基的肽，使用能在脯氨酸残基羧基末端进行切割的蛋白酶能提供感兴趣的选择。所谓的脯氨酰寡肽酶(EC3.4.21.26)具有偏向于在脯氨酸残基羧基侧对肽进行切割的独特的可能性。在从哺乳动物以及微生物来源分离的所有被足够分析的脯氨酸特异性蛋白酶中，已经鉴定出了独特的肽酶结构域，其把大的肽排除在酶的活性位点之外。事实上，这些酶不能降解含有超过大约30个氨基酸残基的肽，使得这些酶现在被称为“脯氨酸寡肽酶”(Fulopetal.Cell，vol.94，161-170，July24，1998)。结果，这些脯氨酰寡肽酶在能施加其水解作用前需要用其它内切蛋白酶进行的前水解。但是，如WO02/45523所述，甚至脯氨酰寡肽酶与此类其它内切蛋白酶的组合导致产生了下述水解产物，其特征为具有羧基末端脯氨酸残基的肽的比例显著增加。因为这个原因，此类水解产物形成了优秀的起始点，用于分离具有外ACE抑制作用以及增加的对肠胃蛋白水解降解的抗性的肽。尽管存在这些潜在的好处，我们不知道具体地使用脯氨酸特异性内切蛋白酶用于回收ACE抑制肽的应用，更不用说对IPP的选择性生产。本发明涉及一种方法，用于生产包含来自蛋白来源的IPP的组合物，其中，从蛋白产生的IPP对VPP的重量比为至少5∶1，优选至少10∶1，更优选至少20∶1，所述方法包括使用具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性或脯氨酰寡肽酶活性的酶活性以及能水解-I-P-P-序列氨基末端侧的键的酶活性。有利地，具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性或脯氨酰寡肽酶活性的酶活性以及能水解-I-P-P-序列氨基末端侧的键的活性存在于一种酶中，优选地，该酶是脯氨酸特异性内切蛋白酶或脯氨酰寡肽酶，更优选地，该酶是脯氨酸特异性内切蛋白酶。此外，本发明涉及一种方法，用于制备包含可溶肽(优选地，IPP)的组合物，所述方法包括将水解条件的pH改变为使所述水解蛋白的一部分变为不可溶的pH，以及将不可溶部分与可溶肽分离，得到包含可溶肽的组合物。用于分离步骤的温度优选在0至20℃之间，更优选在1至10℃之间。本发明还涉及制备食物产品、饮料产品或膳食补充剂的方法，所述方法包含生产包含前述IPP的组合物，并且将该含有IPP的组合物加入到食物产品、饮料产品或膳食健康产品中。此外，本发明涉及一种方法，用于生产包含可溶肽的组合物，所述组合物是通过下述步骤生产的-首先，用脯氨酸特异性内切蛋白酶将蛋白水解至5-30％的DH，-可选地，进行第二种酶处理，优选地，用蛋白酶来进行，以及-之后，将水解蛋白的不可溶部分与可溶部分在选定的pH条件下分离，优选在酸性pH条件下，更优选在3.5至6之间的pH下，最优选在4至5之间的pH下，以产生包含可溶肽的组合物。本发明因此提供了可通过后一种方法获得的组合物，并且，所述组合物包含可溶的肽，其中，所述肽的至少70wt％，优选至少80wt％，最优选至少90wt％在3.5至6之间的pH，优选4至5之间的pH，最优选pH＝4时是可溶的(在4℃测量的)，并且，其中，可溶肽中没有任何一种肽以大于可溶肽40wt％的量存在，优选地，可溶肽中没有任何一种肽以大于可溶肽30wt％的量存在，最优选可溶肽中没有任何一种肽以大于可溶肽20wt％的量存在。后一种方法和后一种组合物是下一种观点的结果，可获得具有高含量可溶肽的组合物，其中，因为使用了脯氨酸特异性内切蛋白酶，其也含有高含量的具有羧基末端脯氨酸的肽。如上所述，首先用脯氨酸特异性内切蛋白酶对蛋白进行水解。在随后通过额外的(第二种)蛋白酶对该水解蛋白进行水解的情况下，第二种酶将对具有羧基末端脯氨酸的肽进行进一步水解。优选地，第二种酶处理通过纯且选择性的酶来进行。该第二种酶优选是氨基肽酶(例如，CorolaseLAP，见实施例12和13)或内切蛋白酶，最优选使用氨基肽酶。在实施例12和13中显示，基于最高的IPP选择性，额外的IPP和VPP从酪蛋白形成。该第二种酶的选择一直与所用的蛋白相关。以这种方式，可能可以制造出量体裁衣般合适的组合物，其包含来自所用蛋白的可溶肽。该第二种酶处理可优选在脯氨酸特异性内切蛋白酶水解之后进行，但是另一种选择是第二种酶处理与脯氨酸特异性内切蛋白酶水解同时进行。根据本发明的另一种实施方式，该第二种酶处理可在酸沉淀步骤之后发生。在这种情况下，通过该第二种酶对可溶肽组合物进行进一步水解，以再次得到含有可溶肽的组合物。优选地，可溶肽中的至少10摩尔％，更优选至少20摩尔％，进一步更优选至少30摩尔％具有羧基末端脯氨酸。在专利申请WO02/45523中，描述了该摩尔％可如何被测定。本发明涉及作为营养药物(优选是药剂)的含有本发明的肽的组合物。本发明还涉及含有本发明的肽的组合物作为营养药物(优选是药剂)的用途，涉及含有本发明的肽的组合物用于生产营养药物(优选是药剂)的用途，涉及含有本发明的肽的组合物用于促进健康和/或治疗疾病的用途，涉及含有本发明的肽的组合物用于生产营养药物(优选是药剂)的用途，涉及含有本发明的肽的组合物用于治疗心血管疾病(例如高血压和心力衰竭)的用途，涉及含有本发明的肽的组合物用于治疗前糖尿病或糖尿病的用途，涉及含有本发明的肽的组合物治疗或预防肥胖的用途，涉及含有本发明的肽的组合物用于提高血浆胰岛素或者用于提高针对血浆胰岛素敏感性的用途，涉及含有本发明的肽的组合物用于提高2型糖尿病或前糖尿病患者血浆胰岛素或者用于提高他们针对血浆胰岛素的敏感性的用途，涉及含有本发明的肽的组合物用于降低2型糖尿病或前糖尿病患者血液中餐后葡萄糖浓度的用途，涉及含有本发明的肽的组合物用于提高2型糖尿病或前糖尿病患者血液中餐后胰岛素分泌的用途，涉及下述含有本发明的肽的组合物的用途，其中所述含有本发明的肽的组合物以膳食补充剂形式存在，涉及含有本发明的肽的组合物用于生产功能性食物产品的用途，所述食物产品用于对压力作用进行药物治疗，涉及含有本发明的肽的组合物在局部应用中的用途(优选在个人护理应用中)，以及涉及含有本发明的肽的组合物在饲料和宠物食品中的用途。此外，本发明涉及一种方法，用于治疗1型和2型糖尿病，以及用于在具有前糖尿病或葡萄糖耐量受损(IGT)的个体中预防2型糖尿病，所述方法包括向需要此类治疗的个体施予含有本发明的肽的组合物，还涉及一种方法，用于对遭受高血压或心力衰竭的人群进行治疗或者对高血压和心力衰竭加以预防，所述方法包括向需要此类治疗的个体施予含有本发明的肽的组合物，因此展示出降低血压的作用。对ACE的抑制导致降低的血管收缩，提高的血管舒张，改进的盐和水排泄，其进而导致了降低的外周血管抗性和血压，以及改进的局部血流。因此，本发明的包含肽的水解产物特别有效于预防和治疗可受ACE抑制影响的疾病，其包括但不限于高血压、心力衰竭、心绞痛、心肌梗塞、中风、外周动脉阻塞疾病、血管硬化、肾病、肾功能不全、勃起障碍、内皮功能不全、左心室肥大、糖尿病血管病变、水肿和高醛甾酮症。组合物还可用于预防和治疗肠胃疾病(腹泻、肠道激惹综合征)、炎症、糖尿病、肥胖、痴呆、癫痫、老年痴呆和Meriere’s症。此外，组合物可提高认知功能和记忆力(包括Alzheimer’s症)、饱腹感、限制缺血性损伤以及预防旁路手术或血管成形术后动脉再阻塞。糖尿病是广泛发作的慢性疾病，其迄今为止没有治愈方法。糖尿病的发作和流行指数增长，其在发达国家和发展中国家成为了最为常见的疾病之一。糖尿病是多种致病因素导致的复杂疾病，其特征在于与胰岛素分泌和/或胰岛素抵抗缺陷相关的碳水化合物、蛋白和脂肪代谢受损。这导致升高的空腹和餐后血糖浓度，如果未被治疗将导致并发症。该疾病有两主要的类，胰岛素依赖型糖尿病(IDDM，T1DM)和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM，T2DM)。T1DM＝“Type1DiabetesMellitus”(1型糖尿病)。T2DM＝“Type2DiabetesMellitus”(2型糖尿病)。T1DM和T2DM糖尿病与高血糖、高血胆固醇和高血脂相关。在T1DM和T2DM中，绝对的胰岛素缺陷和对胰岛素的不敏感性分别导致肝脏、肌肉和脂肪组织对葡萄糖利用的降低，以及血糖水平的增加。未受控制的高血糖与增加的且过早的死亡率相关，这是由于对微血管和大血管疾病(包括肾病、神经疾病、视网膜病、高血压、中风和心脏病)的风险增加造成的。进来的证据显示，严格的血糖控制是在T1DM和T2DM中预防这些并发症的主要因素。因此，通过药物或治疗方法进行优化血糖控制是治疗糖尿病的重要手段。对T2DM的治疗最初涉及膳食和生活方式改变，当这些手段不能保持足够的血糖控制时，用口服降血糖试剂和/或外源胰岛素来对患者进行治疗。目前用于治疗T2DM的口服药物试剂包括促进胰岛素分泌的那些(磺脲类试剂)、促进胰岛素在肝脏中的作用的那些(双胍类试剂)、胰岛素增敏剂(噻唑烷酮类)和作用于抑制葡萄糖吸收的试剂(α-葡糖苷酶抑制剂)。但是，由于高血糖的逐渐恶化，目前可获得的试剂通常不能长期保持足够的血糖控制。能保持目标血糖水平的患者比例随着时间显著降低，这使得施予额外/替代性的药物试剂成为必需。此外，药物可能具有不想要的副作用，并且与高的初级或次级失败率相关。最后，使用降血糖药物可能有用于控制血糖水平，但是可能不能预防糖尿病的所有并发症。因此，目前针对所有类型的糖尿病的治疗方法无法获得理想的血糖正常化和预防糖尿病并发症的效果。因此，虽然在对T1DM和T2DM的治疗中疗法的选择基本基于施予胰岛素和口服降血糖药物，但人们需要安全有效的、具有最小化的副作用的营养补充剂来治疗和预防糖尿病。很多患者都对能最小化高剂量药物伴随的副作用、并能产生额外的临床益处的替代性疗法感兴趣。具有糖尿病的患者对于被认为是“天然的”、具有温和抗糖尿病作用并且没有大的副作用的治疗有特殊兴趣，其可被用作为辅助治疗。T2DM是逐渐发展的、慢性疾病，其通常不会被认识到，直到显著的损伤己发生于负责产生胰岛素的胰腺细胞(Langerhans岛的β-细胞)上。因此，人们对于开发下述膳食补充剂具有日益增加的兴趣，所述补充剂可用于在风险人群中，尤其是具有发展T2DM的高风险的年长人群中预防β-细胞损伤，以及因此预防明显的T2DM进程。对胰腺β-细胞的保护可通过降低血糖和/或脂类水平来获得，因为葡萄糖和脂类会对β-细胞产生伤害。血糖水平的降低可通过不同机制获得，例如通过提高胰岛素敏感度和/或通过降低肝脏葡萄糖生产来获得。降低血脂水平也可以通过不同机制获得，例如，通过提高脂类氧化和/或脂类贮备来获得。用于保护胰腺β-细胞的另一可能策略将是降低氧化胁迫(oxidativestress)。氧化胁迫还导致β-细胞损伤，以及随后的胰岛素分泌减少以及明显的T2DM的进程。因此，T2DM是在多个器官位点共存的缺陷导致的复杂疾病肌肉和脂肪组织中对胰岛素作用的抗性，有缺陷的胰腺胰岛素分泌，未受限制的肝脏葡萄糖生产。这些缺陷通常与脂类异常和内皮功能不全相关。在T2DM中存在多种病原生理性损害的情况下，组合疗法就是有吸引力的对其进行管理的手段。本发明涉及新颖的营养药物组合物，其中包含本发明的含有肽的组合物。包含本发明的含有肽的组合物的营养药物组合物还可包含未被水解的蛋白和碳水化合物作为活性成分，用于治疗或预防糖尿病或与葡萄糖耐量受训相关的其它状况，例如综合征X。在另一方面，本发明涉及此类组合物作为营养补充剂用于所述治疗或预防的用途，例如，作为多种维生素制剂的补充剂，所述制剂包含维持正常代谢功能所必需的、但是体内无法合成的维生素和矿物质。在又一个方面，本发明涉及一种方法，用于治疗1型和2型糖尿病，以及用于在具有前糖尿病或者葡萄糖耐量受损(IGT)或肥胖的个体中预防2型糖尿病，所述方法包括向需要此类治疗的个体施予本发明的含有肽的组合物和蛋白水解产物或未水解蛋白和/或碳水化合物。本发明的组合物特别可用于治疗T1DM和T2DM，以及用于在具有前糖尿病或葡萄糖耐量受损(IGT)的个体中预防T2DM。我们发现，含有本发明的肽的组合物可被用于2型糖尿病或前糖尿病，优选地，用于降低餐后葡萄糖浓度或用于增加餐后血液中胰岛素分泌。包含肽以及可选地碳水化合物的组合物刺激胰岛素分泌，增加葡萄糖被安排到胰岛素敏感的目标组织，例如脂肪组织，骨骼肌和肝脏，因此，在对糖尿病的治疗中提供协同作用。通常认识到，压力相关的疾病，以及压力对于身体的负面作用在很多人群产生显著影响。近年来，压力的作用和其对于多种疾病和症状的发展的作用，已在医学和科学界得到了更加广泛的认可。消费者现在越来越认识到这些潜在的问题，并且对于减少或预防压力对他们健康造成的可能负面影响越来越感兴趣。本发明的另一个目的是提供一种食物产品或可被包含进食物产品的成分，其适用于帮助身体处理压力的作用。还有一个目的是提供一种食物产品，其中包含含有本发明的肽的组合物，所述食物产品能提供健康方面的好处，例如帮助身体处理压力的负面作用。术语“营养药物”在本文中指在营养学应用和药学领域都有用。因此，新的营养药物组合物可作为食物和饮料的补充剂，也可作为药物制剂和药剂用于肠道或非肠道应用，其可以是固体制剂，例如胶囊或片剂，或者液体制剂，例如溶液或悬浮液。从前述可以看出，术语“营养药物组合物”还包含其中包含含有本发明的肽的组合物以及可选地碳水化合物的食物和饮料，以及补充剂组分，例如，膳食补充剂，其中包含前述活性成分。术语“膳食补充剂”在本文中指用嘴摄取的产品，其中含有“膳食成分”以补充膳食。这些产品中的“膳食成分”可以包括维生素、矿物质、草本物质或其它植物性药材、氨基酸以及酶、器官组织、腺体和代谢物等物质。膳食补充剂还可以是提取物或浓缩物，其可以以很多形式存在，例如片剂、胶囊、软凝胶、凝胶胶囊、液体或粉末。它们还可以是其它形式的，例如条状，但是如果它们是的话，膳食补充剂标签上的信息将通常不表示该产品作为传统食物或者餐食或膳食的唯一项目。多种维生素和矿物质补充剂可被加入到本发明的营养药物组合物中，以获得足够量的、一些膳食中遗漏的必要营养物。多种维生素和矿物质补充剂还可用于疾病预防和保护，用于抵抗由于生活模式和糖尿病中一些时候观察到的不足够的膳食模式造成的缺陷和营养损失。此外，氧化胁迫还己被牵连于胰岛素抵抗的发展中。反应活性氧种类可通过扰乱胰岛素受体信号级联来损伤胰岛素刺激的葡萄糖吸收。用抗氧化剂，例如α-生育酚(维生素E)、抗坏血酸(维生素C)对氧化胁迫的控制在对糖尿病的治疗中可以是有价值的。因此，对多种维生素补充剂的摄取可被加入到上文提到的活性物质中，以保持良好平衡的营养。此外，含有本发明的肽的组合物与矿物质(例如，镁(Mg2+)、钙(Ca2+)和/或钾(K+))的组合可用于促进健康以及预防和/或治疗包括但不限于心血管疾病和糖尿病等的疾病。在本发明的一个优选的方面，本发明的营养药物组合物含有含有本发明的肽的组合物。IPP适合以向被施予的个体提供每千克体重大约0.001g至每kg体重大约1g的每日剂量存在于根据本发明的组合物中。食物或饮料适合含有每份大约0.05g至每份大约50g的IPP。如果营养药物组合物是药物制剂，此类制剂可含有每剂量单位(例如，每胶囊或片剂)大约0.001g至大约1g的量的IPP，或者对液体制剂而言，每份每日剂量大约0.035g至每份每日剂量大约70g。含有本发明的肽的组合物适合在根据本发明的组合物中以向被施予的个体提供每千克体重大约0.01g至每kg体重大约3g的每日剂量存在。食物或饮料适合含有每份大约0.1g至每份大约100g的蛋白水解产物。如果营养药物组合物是药物制剂，此类制剂可含有每剂量单位(例如，每胶囊或片剂)大约0.01g至大约5g的量的含肽组合物，或者对液体制剂而言，每份每日剂量大约0.7g至每份每日剂量大约210g。在本发明的又一个优选的方面，组合物包含上面特别指出的本发明的肽以及可选地，碳水化合物。碳水化合物适合以向被施予的个体提供每千克体重大约0.01g至每kg体重大约7g的每日剂量存在于根据本发明的组合物中。食物或饮料适合含有每份大约0.5g至每份大约200g的碳水化合物。如果营养药物组合物是药物制剂，此类制剂可含有每剂量单位(例如，每胶囊或片剂)大约0.05g至大约10g的量的含肽组合物，或者对液体制剂而言，每份每日剂量大约0.7g至每份每日剂量大约490g。剂量范围(对70kg的人而言)IPP0.005-70g/天蛋白水解产物0.07-210g/天未水解的蛋白0.07-210g/天碳水化合物0.1-490g/天本发明的一个目的是提供可食用材料，其可用于向消耗其的个体提供健康方面的好处。另一个目的是提供可以以经分离的形式或被包括进食物产品的形式被方便地摄取的上述可食用材料。本发明的又一个目的是提供一种食物产品或包含在其中的成分，它们适用于体重控制疗程。本发明的又一个目的是提供一种食物产品或包含在其中的成分，它们适用于帮助保持心血管健康，例如，通过ACE抑制。本发明的又一个目的是提供一种食物产品或包含在其中的成分，它们具有可被接受的稳定性和/或感官性质，特别是好的味道，例如不存在或者只存在可被接受的水平的苦味。又一个目的是提供一种食物产品，其具有高浓度的提供健康方面好处的成分，例如，辅助预防肥胖/体重控制和/或帮助保持心血管健康。令人惊奇地，根据本发明，通过含有本发明的肽的组合物用于制备消耗时能提供健康方面的好处的食物产品的用途，来获得这些目的中的一个或多个。根据第一个方面，本发明提供了含有本发明的肽用于生产功能性食物产品的用途，所述食物产品用于预防肥胖或体重控制。根据第二个方面，本发明提供了含有本发明的肽用于生产功能性食物产品的用途，所述食物产品用于心血管健康保持。根据本发明，心血管健康保持包含对血管紧张素转化(ACE)酶的抑制和/或对血糖水平的控制，这是尤其优选的。根据第三个方面，本发明提供了一种功能性食物产品，其能对其消费者提供健康方面的好处，所述健康方面的好处选自预防肥胖、体重控制和心血管健康保持，并且所述食物产品包含含有本发明的肽的组合物。根据本发明的含有肽的组合物的另一个好处是含有该肽的组合物可方便地加入到食物产品中，以产生功能性食物产品，而不会不可接受地影响其稳定性和/或感官性质。根据本发明“提供健康方面好处的试剂”是能提供健康方面的好处的物质，其是摄取时对于健康的某一方面具有正面影响的物质，或者能帮助保持良好健康的一方面，良好健康的这些方面是预防肥胖、体重控制和心血管健康保持。“健康方面的好处”指对于健康的一方面具有正面影响或者帮助保持良好健康的一方面。根据本发明的“功能性食物产品”被定义为适合人类消耗的食物产品(为避免疑问，还包括饮料)，其中，本发明的含肽组合物以有效量被用作为使该食物产品消耗者获得显著的健康方面好处的成分。术语“包含”在本文中使用时不限于表示任何随后指出的成分，其还包含没有特别指出的、具有主要或次要功能重要性的成分。换句话说，列出的步骤、成分或选项并不一定是排他性的。“包括”或“具有”使用之处，这些术语与上文定义的“包含”等价。“肽”或“寡肽”在本文中被定义为通过肽键相连的至少两个氨基酸的链。术语“肽”和“寡肽”被认为是同义的(如通常所认为的)，在上下文需要的情况下，每种术语可互换使用。“多肽”在本文中被定义为含有多于30个氨基酸残基的链。根据通常的实践，本文中的所有(寡)肽和多肽结构式或序列都是按照从左到右的方向从氨基末端向羧基末端书写的。本文中使用的氨基酸的单字母编号是本领域通常已知的，可在Sambrook，etal.(MolecularCloningALaboratoryManual，2nd，ed.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborlaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989)中找到。来自IUMB的、用于对所有酶进行分类和命名的国际承认的体系包括蛋白酶。更新的针对蛋白酶EC编号的IUMB文本可在互联网站点http://www.chem.qmw/ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/11/找到。在该系统中，通过其催化单一反应的事实来定义酶。这具有如下重要的涵义若干种不同的蛋白都被定义为同一种酶，能催化超过一种反应的蛋白被处理为超过一种酶。该系统将蛋白酶分类为内切和外切蛋白酶。内切蛋白酶是水解内部肽键的那些，外切蛋白酶水解与末端氨基相邻的肽键(“氨基肽酶”)或末端羧基和倒数第二个氨基酸之间的肽键(“羧基肽酶”)。内切蛋白酶基于催化机制被分为亚组。存在如下亚组丝氨酸内切蛋白酶(EC3.4.21)、半胱氨酸内切蛋白酶(EC3.4.22)、天冬氨酸内切蛋白酶(Ec3.4.23)、金属内切蛋白酶(EC3.4.24)和苏氨酸内切蛋白酶(EC3.4.25)。氨基肽酶在组3.4.11中。亚组分类基于去除20种不同氨基酸的相对效率。具有窄和宽特异性的氨基肽酶可被区分开。氨基肽酶可顺序性地从蛋白和肽底物上移除单个氨基末端氨基酸。具有窄特异性的氨基肽酶展示出对P1位置上的氨基酸残基类型(从底物肽释放的)的强烈偏好。宽特异性的氨基肽酶能释放N末端或P1位置上的一系列不同氨基酸(根据Schechter’s命名Schechter，I.andBerger，A.1967.BiochemBiophysResCommun27157-162)。羧基肽酶可顺序性地从蛋白和肽底物移除单个羧基末端氨基酸。与内切蛋白酶的情况相当，羧基肽酶可基于催化机制被分为亚组。丝氨酸类型的羧基肽酶在EC3.4.16组中，金属羧基肽酶在EC3.4.17组中，半胱氨酸类型的羧基肽酶在EC3.4.18组中。针对蛋白酶的EC列表的值用于提供针对多种蛋白酶活性类型的标准术语命名，尤其是对每种蛋白酶指定独特的命名编号和推荐名称。在EP1231279中，描述了一种纯粹的酶促方法，用于从奶的酪蛋白中回收三肽VPP和IPP。后一申请要求保护一种方法，所述方法用于通过用蛋白酶和肽酶通过所谓的“中间产物肽”对含有奶的酪蛋白的物质进行消化来生产三肽，所述“中间产物肽”选自含有序列-V-P-P-但除了该序列中的这些之外不再含Pro的肽，以及含有序列-I-P-P-但除了该序列中的这些之外不再含Pro的肽构成的组。如EP1231279的实施例中所述，该方法涉及两步方法。首先，产生包含VPP或IPP的中间产物肽。这是通过用酪蛋白与合适的蛋白酶温育来实现的。根据实施例中的一种，在37摄氏度进行12小时的时间。然后，通过将该第一水解产物加热至100摄氏度3分钟来使所用的蛋白酶失活，再次冷却后，加入另一种酶制剂(事实上，具有外蛋白水解活性的制剂)。再在37摄氏度与该另种酶制剂温育12小时后，可展示出三肽VPP和IPP的存在。为获得更高产量的这些ACE抑制肽，EP1231279进一步提出在暴露给外蛋白水解活性之前对中间产物肽进行纯化和浓缩。EP1231279还暗示，在获得中间产物肽之后，以及在中间产物肽与肽酶在流程中接触之前，可选地，可进行多种操作，例如，通过例如在5000至20000rpm离心3至10分钟来除去未反应的蛋白。所以，以工业方式而非笨拙的两步酶促工艺来获得想要的三肽。因为每次酶促温育可能在4.5至7.0的pH以及25至50摄氏度的温度下进行长达12小时，明显该流程从微生物的角度来讲是不可接受的。长的温育时间组合25至50℃的低温育温度，可能容易导致含有蛋白的溶液被感染。WO02/45524描述了可从Aspergillusniger获得的一种脯氨酸特异性内切蛋白酶。A.niger来源的酶偏好于在脯氨酸的羧基进行切割，但是也在羟脯氨酸的羧基末端进行切割，以及以较低效率在丙氨酸的羧基末端进行切割。WO02/45524还教导，该A.niger来源的酶和来自其它微生物或哺乳动物来源的已知脯氨酰寡肽酶之间不存在明显的同源性。与已知脯氨酰寡肽酶相反，A.niger酶具有酸性pH最优值。虽然已知的脯氨酰以及A.niger来源的酶是所谓的丝氨酸蛋白酶，我们在此(实施例1)展示，A.niger酶属于完全不同的亚族。分泌的A.酶看起来是丝氨酸肽酶的S28家族的成员，而非大多数胞质脯氨酰寡肽酶被分入的S9家族的成员(Rawling，N.D.andBarrett，A.J.；Biochim.Biophys.Acta1298(1996)1-3)。在实施例2中，我们展示了A.niger来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶的pH和温度最优值。在实施例3中，我们展示了本发明的方法中使用的A.niger来源的酶制剂是高度纯的，这意味着除了纯的脯氨酸特异性内切蛋白酶固有的内蛋白水解活性之外没有附着任何显著的内蛋白水解活性。我们还展示出根据本发明使用的我们的A.niger来源的酶制剂不含任何外蛋白水解副活性，更特别地，氨基肽分解副活性。EP1231279中描述的所有阳性鉴定的蛋白酶样品都是展示出不同蛋白水解活性的不同酶的复杂混合物。本领域技术人员将理解，EP1231279所描述的方法随着内蛋白水解活性与一种或多种外蛋白水解酶活性的组合而变化。此类外蛋白水解活性在用于本发明方法中的A.niger来源的酶制剂中是不存在的。反之亦然，根据本发明的方法中使用的酶在EP1231279中描述的复杂蛋白酶样品中也不存在。关于该酶在非重组Aspergillus菌株中基本上不存在的观点的实验证明可在WO02/45524中找到。因为本发明的方法可能仅用脯氨酸特异性内切蛋白每，最优温育条件(例如温度、pH等)可以容易地选择，而不必如应用两种或多种酶时那样必须固定为亚最优条件。在选择反应条件时具有更多自由度使得可以更为容易地针对可能的其它标准加以选择。例如，现在选出对于微生物感染更不敏感的条件以及相对随后的蛋白沉淀步骤来优化pH条件就容易得多。在实施例4中，我们展示，Aspergillus酶并非寡肽酶，其是真正的内肽酶，能水解完整蛋白、大的肽以及较小的肽分子，而无须辅助的内切蛋白酶。这种新的惊人发现开启了使用A.niger酶来制备下述水解产物的可能性，所述水解产物中具有羧基末端脯氨酸残基的肽以空前的高含量存在，这是因为不需要任何辅助性的内切蛋白酶。此类新的水解产物可从来自植物或来自动物来源的不同蛋白质起始材料来制备。此类起始材料的例子是乳清蛋白、乳清beta-乳球蛋白、乳清alpha乳白蛋白、酪蛋白、明胶、鱼或卵蛋白、马铃薯蛋白、小麦和玉米麦麸、大豆和豌豆蛋白、水稻蛋白以及羽扁豆蛋白。当然，起始蛋白应当至少具有-I-P-P-序列。优选地，该蛋白还在其蛋白序列中包含-L-p-p-序列。如上文所解释的，该蛋白可能在其蛋白中具有-V-P-P-序列。可以从具有高含量脯氨酸以及羟脯氨酸的底物，例如明胶，产生下述水解产物，其具有空前高含量的、具有羧基末端脯氨酸或羟脯氨酸残基的肽。因为A.niger酶(例如已知得脯氨酰寡肽酶)不能切割Pro-Pro或Pro-Hyp、Hyp-Pro或Hyp-Hyp键，该手段将还产生含有空前高含量的下述肽的水解产物，所述肽具有两个、三个或者甚至更多个羧基末端脯氨酸或羟脯氨酸残基。明显地，蛋白质起始材料的本质和脯氨酸含量制定了产生此类肽的可能性。优选的底物是含有多于6％脯氨酸的底物(即，每100克蛋白中该氨基酸超过6克)，例如酪蛋白、明胶、小麦和玉米麦麸。考虑到携带此类羧基末端氨基酸序列的肽预期具有在胃肠道水解活性中存活的公平机会，通过与A.niger来源的脯氨酰内切蛋白酶一起温育提供了优秀的起始材料，用于分离已知具有生物活性的肽以及用于鉴定出新的具有生物活性的肽。因为已知钠在高血压中有着重要的作用，用于生产ACE抑制肽的优选底物是这些蛋白的钙盐和钾盐，而非钠盐。A.niger来源的脯氨酰内切蛋白酶的pH最优值为大约4.3(见图1)。因为该pH最优值较低，因此将牛奶酪蛋白酸盐与A.niger来源的脯氨酰内切蛋白酶温育并非不言而喻。如果pH降低至低于6.0，牛奶酪蛋白酸盐将沉淀，并且在此pH值下，A.niger酶仅具有有限的活性。但是，我们在实施例5中展示，甚至在该相当不利的条件下，用A.niger来源的脯氨酰内切蛋白酶仍能产生若干ACE抑制肽。根据本发明，ACE抑制三肽IPP和LPP以分别相当于酪蛋白中理论存在的量的10％和大约60％的产率产生。根据实施例5中提供的解释，IPP的产率产生自下述事实IPP仅可由kappa酪蛋白释放。如果考虑到这点，获得的是大约40％的产率。优选地，酸沉淀的酪蛋白被用作为本发明方法中的底物。相当惊人地，尽管VPP前体VVVPP以类似LPP的产率产生(即，理论存在值的大约60％)，但是并没有VPP产生。优选地，蛋白序列中存在的-L-P-P-序列中的至少20％，更优选至少30％，进一步更优选至少40％，最优选至少60％被转化为肽LPP。优选地，蛋白序列中存在的-I-P-P-序列中的至少20％，更优选至少30％，进一步更优选至少40％，最优选至少60％被转化为肽IPP。脯氨酸特异性蛋白酶优选能水解大的蛋白分子，例如底物蛋白自身。这些结果是用酪蛋白酸盐与A.niger来源的内切蛋白酶在一步法酶促工艺中进行温育来获得的。含有蛋白的水溶液很容易受微生物感染的影响，尤其是在高于5.0的pH和50摄氏度或更低的温度下保持数小时的情况下。特别地，在上述延长温育步骤中可产生微生物毒素，其可能在后续加热步骤中存活，并且形成对食品级工艺的潜在威胁。与EP1231279中描述的条件不同，根据本发明的方法优选使用高于50摄氏度的温育温度。组合一步法酶促工艺，其中酶温育进行小于24小时的时间，优选小于8小时，更优选小于4小时，根据本发明的方法提供了微生物稳定性被提高的优点。牛奶酪蛋白包括大量不同蛋白，包括beta酪蛋白和kappa酪蛋白。根据已知的氨基序列，beta酪蛋白包含ACE抑制三肽IPP(Ile-Pro-Pro)、VPP(ValPro-Pro)和LPP(Leu-Pro-Pro)。kappa酪蛋白仅包含IPP。在实施例5中，我们展示，用A.niger来源的脯氨酰内切蛋白酶与酪蛋白酸钾一起温育，以高产率产生了已知的ACE抑制肽IPP和LPP。使用本发明的酶-底物比例，组合高温度条件，在3小时的温育期间完成IPP和LPP的切割。相当惊人地，没有展示出显著数量的三肽VPP的伴随生产。A.niger来源的酶不含任何可被测量到的氨基肽酶活性这个事实强烈暗示形成的IPP释放自kappa酪蛋白中存在的-A107-I108-P109-P110-序列。我们猜测，IPP的肽键羧基末端被A.niger来源的脯氨酰内切蛋白酶的主活性所切割，而对前面的Ala-Ile键的切割是通过其Ala-特异性副活性来完成的。因此，本发明提供了一种方法，用于从蛋白来源产生IPP，其中产生的IPP对VPP的比例为至少5，优选至少10，更优选至少20，所述方法包括使用具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性的酶和能水解IPP氨基末端的键的酶。优选地，能水解-I-P-P-氨基末端的键的酶同时不能水解-V-P-P-的氨基末端的键，或者对此仅有低活性。虽然针对本发明的方法提到了两种酶活性，也可以在本发明的方法中使用同时具有两种活性(分别为氨酸特异性内切蛋白酶活性和水解-I-P-P-氨基末端的键的活性)的酶，其例子是如本文所述的、优选从A.niger来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶。因为根据本发明选用的水解方法，将形成比现有技术的方法中更少量的水溶性肽。在这些水溶性肽中，IPP以及可选地，LPP以主要含量存在。这在需要高浓度IPP以及可选地LPP化合物并且没有许多其它化合物(通常为活性更低的化合物)的情况下尤其重要。根据本发明的方法，蛋白中存在的-A-I-P-P-或-A-L-P-P-中的优选至少20％，更优选至少30％，最优选至少40％分别转化为IPP或LPP。此外，根据本发明的方法，蛋白中存在的-P-L-P-P-或-P-I-P-P-中的优选至少20％，更优选至少30％，进一步更优选至少40％，最优选至少50％分别转化为LPP或IPP。在实施例6中，我们展示了通过新的惊人纯化步骤产生的对IPP的5倍纯化作用。在该方法中，水解产物在55摄氏度、pH6.0下的短暂酶温育期间形成，然后再被加热至高于80摄氏度的温度以杀死所有污染性的微生物，以及使A.niger来源的脯氨酰内切肽酶失活。随后，对水解产物进行酸化，使pH降低至4.5或者至少低于5.0。该pH值不能被用于失活A.niger来源的脯氨酰内切肽酶(因为其代表着针对该酶的最优条件)，在该pH值下，来自酪蛋白酸盐的所有大的肽沉淀，从而仅有小的肽保留在溶液中。因为沉淀的酪蛋白酸盐可通过倾析或过滤步骤或低速(即低于5000rpm)离心被容易地除去，水相含有相对存在的蛋白来说高比例的生物活性肽。根据Kjeldahl数据，通过低速离心步骤除去了酪蛋白酸盐蛋白中的80至70％，这表明了对ACE抑制肽的四至五倍的纯化。我们已经发现，该纯化原理可被有利地应用来获得从非酪蛋白的蛋白质材料来源获得的生物活性肽。根据本发明，不仅可分离并纯化酶促产生的水解产物，还可分离并纯化合适的微生物发酵得到的蛋白。在接近底物将要沉淀、而酶仍然具有活性的pH值的pH下温育酶和底物，将允许该纯化步骤发生。由于A.niger来源的脯氨酰内切蛋白酶的低pH最优值，可以考虑在pH1.5至6.5的范围内进行底物沉淀。考虑到它们特殊的沉淀行为，高于pH3.5的麦麸沉淀、高于pH3.5但低于pH6.0的乳清蛋白沉淀、高于pH3.5但低于pH5.0的卵白沉淀形成了水解蛋白得以沉淀的条件的例子，沉淀的蛋白可与水解蛋白或肽分离。水解产物的该可溶部分也被包括在水解产物的措辞中。该酸性可溶水解产物是通过下述方法形成的根据本发明对蛋白进行水解，接着调整酸性条件使得不可溶的水解部分能与可溶的肽分离。这种分离可以例如通过对不可溶部分进行沉淀或离心来实现。对于麦麸水解产物而言，酸性分离条件优选为pH＝4，对乳清水解产物而言，酸性条件为优选pH＝4.5，对酪蛋白水解产物而言，酸性条件为优选pH＝4.5，对卵白而言，酸性条件为优选pH＝5.0。通常，对于分离而言的优选酸性条件为pH＝4.5。水解产物表示通过对蛋白水解形成的产物(或者，简称为蛋白水解产物或水解蛋白)，酸性可溶水解产物是蛋白水解产物的可溶部分，其在本文中还被描述为含有可溶肽的组合物或包含可溶肽的组合物)或蛋白水解产物与酸性可溶水解产物的混合物。在营养药物应用和食物和饮料应用中，有利地使用本发明的水解产物。蛋白水解产物、酸性可溶水解产物及其混合物可用于营养药物应用、食物应用或饮料。优选地，酸性可溶水解产物用于营养药物应用、食物应用或饮料，因为存在高含量的活性肽。虽然在奶酪制作工艺中使用了类似的原理以分离酪蛋白凝乳与乳清蛋白，但是在该奶酪制作工艺中，仅使用了天冬氨酸内切蛋白酶(EC3.4.23)。该酶的组(EC3.4.23)包括公知的奶酪制作酶，例如凝乳酶和多种胃蛋白酶，例如哺乳动物胃蛋白酶以及多种微生物胃蛋白酶，例如曲霉胃蛋白酶(aspergillopepsin)和粘膜胃蛋白酶(mucorpepsin)。在本发明的应用中，奶酪制作工艺中的凝乳和乳清不被定义为水解产物。此外，在本发明的水解方法中，有利地，不使用天冬氨酸内切蛋白酶(EC3.4.23)。此外，如前文所讨论的，根据本发明的纯化步骤对于非天冬氨酸内切蛋白酶产生的水解产物来说并非已知的。奶酪制作工艺或凝乳/乳清分离工艺被排除在本发明的纯化方法之外，因此本发明的纯化方法用于获得可溶的肽，并且具有如下前提条件该方法并非奶酪制作工艺或凝乳/乳清分离工艺的一部分。虽然该纯化步骤与奶酪制作工艺表面上具有相似性，但它们是完全不同的。在奶酪制作中，凝乳形成是由酶促步骤(“凝乳酶凝乳(renneting)”)或酸化步骤起始的。但是，凝乳酶凝乳工艺的进行不依赖于酸化，而酸化导致的奶酪凝乳结块的进行不依赖于酶。在另一种纯化方法中，根据本发明的方法，使用水可混溶的溶剂，例如，乙醇、丙酮、丙醇-1、丙醇-2、甲醇或其混合物，从水解蛋白中方便高效地回收肽。在该手段中，优选地，在选定的pH条件下将蛋白水解产物与30-60％(v/v)的水可混溶溶剂小心地混合，该pH条件能使得较大的蛋白沉淀，而小的肽，例如IPP保留在溶液中。分离(例如倾析、过滤或低速离心)之后，可以以经纯化的状态回收含有生物活性肽的上清液。可选地，用额外的酶去处理该得到的含肽组合物(或含有可溶肽的组合物)，例如，以增加活性ACE抑制肽的水平(见实施例12和13)，或者肽组合物可与选择性粘附剂(binder)接触，所述粘附剂例如活性碳、来自AmberliteXADrange(Rohm)的色谱树脂或Pharmacia提供的丁基琼脂糖树脂。随后的蒸发以及可选的喷雾干燥步骤将产生用于获得食品级高生物活性糊浆或粉末的经济途径。对酪蛋白酸盐进行消化后，获得白色无嗅粉末，其具有高浓度的ACE抑制肽，富含IPP和LPP。如果适当稀释至正确的三肽浓度，即可获得具有优秀口感的通用起始材料，其适合用于为所有种类的食物和饮料提供ACE抑制性质。如果需要的话，可通过随后的纯化来提高对生物活性成分的浓缩，其中利用肽IPP和LPP的疏水特征。优选的纯化方法包括微滤(nanofiltration)、萃取(例如用己烷或丁醇)接着蒸发/沉淀，或将获得的酸化水解产物与粘附剂(例如活性碳或来自AmberliteXADrange(Roehm)的色谱树脂)接触。Pharmacia提供的丁基琼脂糖树脂也可使用。ACE抑制肽与此类材料的解吸附可用有机溶剂，例如甲醇/乙醇混合物或用丙醇来进行。在额外(例如色谱)纯化步骤之前或之后获得的肽可被用于加入到食物或饮料产品中，所述产品是常规消耗的。此类产品的例子是植物黄油、涂抹酱、多种奶制品(例如，黄油或酸奶)或含奶或乳清的饮料，优选是基于酸奶或奶的产品，例如酸奶和奶。在其它饮料，例如果汁饮料或大豆饮料中，也可使用本发明的水解产物。另一种选择是在健康产品，例如水果条、蛋白条、能量棒、基于谷物的产品(例如早餐谷物)中使用水解产物。本发明的另一方面涉及可通过本文在前所述的方法或工艺获得的食物产品、饮料产品或膳食补充剂，所述用于制备食物或饮料产品的方法包括如下步骤从蛋白来源生产含有IPP的组合物，其中，从蛋白产生的IPP对VPP的重量比为至少5∶1，优选至少10∶1，更优选至少20∶1，所述方法包括使用脯氨酸特异性内切蛋白酶；以及(b)将所述含有IPP的组合物加入到食物产品、饮料产品或膳食补充剂中。优选地，根据本发明的所述食物产品、饮料产品或膳食补充剂包含0.05至10wt％，更优选0.1至5wt％，最优选0.2至4wt％的所述含IPP组合物或蛋白水解产物。还优选地，根据本发明的食物或饮料产品或膳食补充剂包含每100克产品0.05至50mg的IPP，更优选地，0.1至40mg，最优选地，0.2至30mg。还优选地，在本发明的食物或饮料产品或膳食补充剂中，IPP对VPP的重量比为5∶1至100∶1，更优选地，5∶1至48∶1。还优选地，根据本发明的食物产品、饮料产品或膳食补充剂包含IPP和LPP，其中，IPP对LPP的重量比为1∶10至1∶1，更优选地，1.5∶7.1至4.8∶7.1。优选地，食物或饮料产品或膳食补充剂选自由植物黄油、涂抹酱、黄油、奶制品或含乳清饮料构成的组，优选地，基于酸奶或奶的产品，例如酸奶或奶，其中，所述食物或饮料产品或膳食补充剂包含如上所述的量的水解产物或如上所述的量的IPP。尤其优选的是上文所述用于减轻人类高血压的食物或饮料产品或膳食补充剂。对于食物或饮料或膳食补充剂而言，优选份大小为例如每份5-350克，例如，5至150克。优选地，每天的份数量为1-10份，例如2-5份。虽然此类组合物典型地被施予人类，它们还可以施予动物(优选地，哺乳动物)，以减轻高血压。此外，获得的产品中高含量的ACE抑制剂或其它生物活性肽使得这些产品非常有用于加入到丸剂、片剂或高度浓缩溶液或糊状或粉末形式存在的膳食补充剂中。确保ACE抑制肽或其它生物活性肽持续释放的缓释膳食补充剂是人们特别感兴趣的。根据本发明的ACE抑制肽或其它生物活性肽可作为干燥粉末配制于例如丸剂、片剂、颗粒或小袋或胶囊中。或者，根据本发明的酶可作为液体被配制于例如糖浆或胶囊中。用于多种制剂的、含有根据本发明的酶的组合物还可包括至少一种下述组的化合物，所述组由生理上可接受的载体、佐剂、赋形剂、稳定剂、缓冲剂和稀释剂构成，这些术语按照它们普通的含义使用，用来表示辅助包装、运送、吸收、稳定的物质，或者在使用佐剂的情况下，表示用来增强酶的生理作用的物质。可与根据本发明的酶在粉末形式中组合使用的多种化合物的相关背景可在″PharmaceuticalDosageForms″，secondedition，Volumes1，2and3，ISBN0-8247-8044-2MarcelDekker，Inc中找到。虽然根据本发明配制为干燥粉末的ACE抑制肽可储藏相当长的时间，但应通过选用合适的包装，例如铝箔，来避免与水或潮湿空气接触。相对新的口服应用形式是使用多种类型的明胶胶囊或基于明胶的片剂。考虑到天然ACE抑制肽与抵抗高血压的相关性，本发明的新的经济有效的途径提供了用于温和降血压食品或者甚至兽用产品的有吸引力的起点。因为本发明的途径还包括惊人简单的纯化步骤，还增大了降血压的经浓缩膳食补充剂的可能性。根据本发明的方法可使用任何脯氨酸特异性寡蛋白酶或内切蛋白酶来实现。根据本发明或根据本发明使用的脯氨酸特异性寡肽酶表示属于EC3.4.21.26的酶。根据本发明或根据本发明使用的脯氨酸特异性内切蛋白酶表示WO02/45525的权利要求1-5、11和13中提到的多肽。因此，该脯氨酸特异性内切蛋白酶是具有脯氨酸特异性内蛋白水解活性的多肽，其选自下述多肽构成的组(a)一种具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQIDNO2的1至526位氨基酸或其片段具有至少40％的氨基酸序列相同性；(b)一种多肽，其由下述多核苷酸编码，所述多核苷酸能在低严谨度条件下与(i)SEQIDNO1的核酸序列，或其在60个，优选100个核苷酸上至少80％或90％相同的片段，更优选200个核苷酸上至少90％相同的片段，或(ii)与SEQIDNO1的核酸序列互补的核酸序列杂交。SEQIDNO1和SEQIDNO2如WO02/45524所示。优选地，所述多肽以经分离的形式存在。根据本发明使用的优选多肽包含SEQIDNO2的氨基酸序列或具有下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有与SEQIDNO2的1-526位氨基酸序列至少50％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，更优选至少80％，进一步更优选至少90％，最优选至少95％，进一步最优选至少大约97％的相同性。优选地，多肽由下述多核苷酸编码，所述多核苷酸能在低严谨度条件下，更优选地，中等严谨度条件下，最优选高严谨度条件下，与(i)SEQIDNO1的核酸序列或其片段，或(ii)与SEQIDNO1的核酸序列互补的核酸序列杂交。术语“能杂交”指，本发明的目标多核苷酸能与用作为探针的核酸(例如，SEQIDNO1所示的核苷酸序列，或其片段，或SEQIDNO1的互补序列)以显著高于背景的水平杂交。本发明还包括编码本发明脯氨酸特异性内切蛋白酶的多核苷酸，以及与其互补的核苷酸序列。核苷酸序列可以是RNA或DNA，包括基因组DNA、合成DNA或cDNA。优选地，核苷酸序列是DNA，最优选地，基因组DNA序列。典型地，本发明的多核苷酸包含能在选择性条件下与SEQIDNO1的编码序列或编码序列的互补序列杂交的核苷酸连续序列。此类核苷酸可根据本领域公知的方法合成。本发明的多核苷酸可以显著高于背景的水平与SEQIDNO1的编码序列或编码序列的互补序列杂交。因为cDNA文库中存在其它cDNA，可能出现背景杂交。本发明的多核苷酸与SEQIDNO1的编码序列或编码序列的互补序列之间的相互作用产生的信号水平典型地为其它多核苷酸与SEQIDNO1之间相互作用强度的至少10倍，优选至少20倍，更优选至少50倍，进一步更优选至少100倍。相互作用的强度可例如通过对探针进行放射标记(例如用32P)来测量。典型地，选择性杂交可使用低严谨度条件(0.3M氯化钠以及0.03M柠檬酸钠，大约40℃)、中等严谨度条件(例如，0.3M氯化钠以及0.03M柠檬酸钠，大约50℃)或高严谨度条件(例如，0.3M氯化钠以及0.03M柠檬酸钠，大约60℃)来获得。UWGCGPackage提供了BESTFIT程序，其可以用来计算相同性(例如采用其缺省设置)。PILEUP和BLASTN算法可以用来计算序列相同性或对序列进行排列(lineup)(例如鉴定等同或对应的序列，例如使用其缺省设置)。用以开展BLAST分析的软件可以通过NationalCenterforBiotechnologyInformation(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)为公众所获得。该算法包括通过确定被查询的序列中的长度为W的短字(shortword)，首先确定出高分数序列对(highscoringsequencepair，HSP)，所述的短字与数据库序列中同样长度的字进行比对时匹配或能达到为正值的某阈值分数T。T被称为相邻字分数阈值(neighbourhoodwordscorethreshold)。这些最初的相邻字命中(wordhit)作为种子对搜索进行初始化，以找到含有它们的HSP。所述的字命中在每条序列的两个方向上都延伸，直到累积比对分数(cumulativealignmentscore)能够增加。当累积比对分数从其获得的最大值降低了数量X；由于一个或多个分数为负的残基比对的积累，所述累积分数到了零或以下；或到达了序列的任意末端之时，所述字配对在每个方向上的延伸就被中断。BLAST算法的参数W、T和X确定了所述比对的敏感性和速度。所述的BLAST程序缺省使用的字长度(wordlength，W)为11，BLOSUM62分数矩阵比对(BLOSUM62scoringmatrixalignments，B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，缺省比较两条链。BLAST算法进行了两条序列间相似性的统计分析。由BLAST算法提供的一种对相似性的测量是最小总和概率(smallestsumprobability(P(N)))，它提供了对两段核苷酸或氨基酸序列间的匹配将偶然发生的概率的指示。例如，如果第一条序列与第二条序列进行比较时的最小总和概率小于1左右，优选小于0.1左右，更优选小于0.01左右，以及最优选小于0.001左右，则该序列就被认为与另一条相似。Aspergillus属的菌株具有食品级状态，从这些微生物获得的酶已知能形成无可质疑的食品级来源。根据另一种优选的实施方式，酶通过其生产细菌分泌，而并非非分泌的所谓胞质酶。以这种方式，可无需昂贵的纯化步骤，就从细胞培养液中回收得到基本纯净状态的酶。优选地，酶具有与其底物在主要pH和温度条件下的高度亲和性。图1A.niger来源的脯氨酰内切蛋白酶的pH最优值的示意2A.niger来源的脯氨酰内切蛋白酶的特异性情况图3完整卵清蛋白(ovalbumine)和合成27肽与经色谱纯化的A。niger来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶温育之后的SDS-PAGE。图4在合成底物F-pNA、Q-pNA和V-pNA上，pH6.0时，对含有三种商业可获得的氨基肽酶的酶制剂的测得的相对活性。材料和方法材料可食用酪蛋白酸钾(88％)从DMVInternational，TheNetherlands获得。合成的发色肽从PepscanSystemsB.V.TheNetherlands或从Bachem，Switzerland获得。Flavourzyme1000LBatchHPN00218从Novozymes(Denmark)获得，SumizymeFP从ShinNihon(Japan)获得，CorolaseLAPCh.4123从ABEnzymes(UK)获得。来自A.niger的脯氨酸特异性内切蛋白酶。按照WO02/45524所述，对来自Aspergillusniger的脯氨酸特异性内切蛋白酶进行过量生产。在pH4.6的柠檬酸/磷酸二钠缓冲液中，于37摄氏度，在合成肽Z-Gly-Pro-pNA上检测酶活性。在405nm处通过分光光度方法监测反应产物。一个单位被定义为在上述检测条件下每分钟释放出1μmol对硝基酰苯胺(p-nitroanilide)的酶的量。对A.niger来源的内切蛋白酶进行色谱纯化从过量生产的A.niger菌株获得的培养液被用于对蛋白酶的色谱纯化，以去除任何污染性的内或外蛋白水解活性。为达到此目的，首先对发酵培养液进行离心，以去除真菌生物质，然后将上清液经过大量过滤器，所述过滤器具有逐渐减小的孔径，以去除所有细胞片段。最后，在20毫摩尔/升乙酸钠(pH5.1)中对获得的超滤物稀释10倍，上样到Q-SepharoseFF柱上。使用在20毫摩尔/升乙酸钠(pH5.1)中的0-0.4摩尔/升的NaCl梯度来洗脱蛋白。收集并汇合展示出针对Z-Gly-Pro-pNA切割活性的峰片断，这按照WorldJournalofMicrobiology&Biotechnology11，209-2125(1995)所述的方法来进行，但试验条件略有修改。考虑到A.niger来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶的酸性pH最优值，酶试验在37℃、pH4.6下于柠檬酸/二磷酸缓冲液中进行。汇合活性片段之后接着进行离心，最终产生了下述制剂，其在SDS-PAGE上仅显示出单一条带，在HP-SEC上显示出一个峰。通过疏水相互作用色谱进行的进一步分析验证了获得的酶制剂的纯度。LC/MS/MS分析使用偶联到P4000泵(ThermoElectron，Breda，theNetherlands)上的离子阱质谱仪(ThermoElectron，Breda，theNetherlands)的HPLC被用于对目标肽进行定量，包括根据本发明的方法产生的酶促蛋白水解产物中的肽IPP(M＝325.2)、LPP(M＝325.2)、VPP(M＝311.2)、VVVPP(M＝509.3)和VVVPPF(M＝656.4)。使用Inertsil3ODS3，3μm，150*2.1mm柱(VarianBelgium，Belgium)组合MilliQ水中的0.1％甲酸(Millipore，Bedford，MA，USA；溶液A)和乙腈中的0.1％甲酸(溶液B)梯度用于洗脱，来分离形成的肽。梯度起始自100％的溶液A，保持5分钟，10分钟内线性增加至5％溶液B，接着在30分钟内线性增加至45％溶液B，紧接着立刻回到起始条件，保持15分钟以稳定。所使用的注射体积为50微升，流速为每分钟200微升，柱温保持为55℃。注射样品的蛋白浓度为大约50微克/毫升。关于各种肽的详细信息通过使用针对目标肽的专门MS/MS来获得，其中使用大约30％的最优碰撞能。对各种肽的定量使用内部校正来进行，其中使用全部异亮氨酸被N15、C13标记的IPP(M＝332.2)，这通过使用在MS/MS模式中针对被分析的所有相关肽观察到的最为丰富的片段离子来进行。使用的所有肽都通过Pepscan(Lelystand，TheNetherlands)合成。三肽LPP(M＝325.2)被用于在MS模式中针对最优敏感度进行微调，在MS/MS模式中针对最优片段化进行微调，其展示出5μg/ml的恒定注入率，在MS模式中产生质子化分子，在MS/MS模式中产生大约30％的最优碰撞能，产生B-和Y-离子系列。在LC/MS/MS之前，在环境温度和13000rpm下对酶促蛋白水解产物进行10分钟离心，经过0.22μm过滤器进行过滤，用去矿物质水(经过Millipore水过滤设备过滤得的)(MilliQ水)对上清液进行1∶100的稀释。水解程度使用快速OPA测试(Nielsen，P.M.；Petersen，D.；Dambmann，C.Improvedmethodfordeterminingfoodproteindegreeofhydrolysis.JournalofFoodScience2001，66，642-646)，对用多种蛋白水解混合物进行温育期间获得的水解程度(DH)进行监测。Kjeldahl氮通过FlowInjection分析来测量总Kjeldahl氮。使用装备有TKNMethodCassette5000-040、Pentinum4计算机(带SOFIA软件)和Tecator5027Autosampler的TecatorFIASTAR5000FlowInjectionSystem，在590nm处对从含蛋白质溶液中释放出的氨进行定量。将对应于该方法动力学范围(0.5-20mgN/l)的样品量与95-97％的硫酸一起放置于消化管中，对Kjeltab于200摄氏度下30分钟，接着360摄氏度下90分钟的消化程序进行处理。注射后，在FIASTAR5000系统中测量氮峰，由其可推导出测量的蛋白的量。营养药物产品根据本发明的营养药物产品可以是任何食物类型。除食物产品外，它们可以以合适的量包含常见的食物成分，例如香料、糖、水果、矿物质、维生素、稳定剂、增稠剂等。优选地，营养药物产品包含50-200mmol/kgK+和/或15-60mmol/kgCa2+和/或6-25mmol/kgMg2+，更优选地，100-150mmol/kgK+和/或30-50mmol/kgCa2+和/或10-25mmol/kgMg2+，最优选地，110-135mmol/kgK+和/或35-45mmol/kgCa2+和/或13-20mmol/kgMg2+。包括进根据本发明的营养药物产品时，这些阳离子具有进一步降低血压的有利作用。有利地，营养药物产品包含一种或多种B族维生素。已知B族维生素叶酸参与高半胱氨酸(人类膳食中的氨基酸)代谢。数年来，已将高半胱氨酸的高水平关联到心血管疾病的高发病率。人们认为，降低高半胱氨酸可降低心血管疾病发病的风险。已知维生素B6和B12干扰嘌呤和硫胺生物合成，参与用于生产甲硫氨酸的高半胱氨酸甲基化过程中的甲基合成，以及参与若干种生长过程。已知维生素B6(盐酸吡哆醇)是维生素补充剂。维生素B12(cyanobalamin)促进神经系统健康，其涉及对血红细胞的生产。还已知其能作为食物补充剂中的维生素。因其对降低心血管疾病风险有组合性的积极作用，优选地，根据本发明的产品包含维生素B6和维生素B12和叶酸。营养药物产品中B族维生素的量可由本领域技术人员根据本文给出的这些B族维生素的日常量来计算叶酸200-800μg/天，优选地，200-400μg/天；维生素B60.2-2mg/天，优选地，0.5-1mg/天；以及维生素B120.5-4μg/天，优选地，1-2μg/天。优选地，营养药物产品包含3至25wt％的固醇，更优选地，7至15wt％的固醇。包括进固醇的好处在于其将导致人类血液中LDL-胆固醇水平的降低，这将使得心血管风险降低。提到固醇的时候，其包括饱和氢化固醇(stanol)以及固醇/氢化固醇的酯化衍生物或它们任何的混合物。在本申请中，提到固醇酯的时候，其也包括它们的饱和衍生物(氢化固醇酯)以及固醇酯和氢化固醇酯的组合。固醇或植物固醇(phytosterol，也作plantsterol或vegetablesterol)可被分为三组4-去甲基固醇、4-单甲基固醇和4，4’-二甲基固醇。在油中，它们主要作为游离固醇或脂肪酸的固醇酯存在，虽然固醇葡糖苷和酰化固醇葡糖苷也是存在的。有三种主要的植物固醇，即beta-谷固醇、豆固醇和菜油固醇。关于这些成分含义的示意图在″InfluenceofProcessingonSterolsofEdibleVegetableOils″，S.P.Kochhar；Prog.LipidRes.22pp.161-188中给出。分别的5alpha-饱和的衍生物，例如氢化谷固醇、氢化菜油固醇和氢化麦角固醇和它们的衍生物，在本申请文件中被称为氢化固醇。优选地，(可选被酯化的)固醇或氢化固醇选自包含β-谷固醇、β-氢化谷固醇、菜油固醇、氢化菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、氢化菜籽固醇或其混合物的组。可选地，固醇或氢化固醇至少部分被脂肪酸酯化。优选地，固醇或氢化固醇被一种或多种C2-22脂肪酸酯化。就本发明的目的而言，术语C2-22脂肪酸表示包含C2-22主链和至少一个酸基团的任何分子。C2-22主链可部分被取代，或者可以存在侧链，虽然这在本文上下文中并不是优选的。但优选地，C2-22脂肪酸是线性分子，其包含一个或两个酸基团作为末尾基团。最优选的是如天然油中存在的那些一样的线性C8-22脂肪酸脂肪酸。任何此类脂肪酸的合适例子是乙酸、丙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸。其它合适的酸例如柠檬酸、乳酸、草酸和马来酸。最优选的是肉豆蔻酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、二十二碳酸、油酸、芥子酸、二十二碳烯酸、反式油酸(elaidicacid)、亚油酸和亚麻酸。如果需要的话，可使用脂肪酸的混合物用于对固醇或氢化固醇进行酯化。例如，可以使用天然存在的脂肪或油作为脂肪酸的来源，通过酯交换反应进行酯化。上述作用于增加心血管健康的营养药物成分、K+、Ca2+和Mg2+、B族维生素(叶酸、B6、B12)和固醇在本文中被合称为心脏健康成分。实施例1从A.niger获得的酶代表一类新的脯氨酸特异性酶可以从WO02/45524提供的A.niger来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶的完全编码序列测定526个氨基酸的蛋白序列。通过对数据库，例如SwissProt、PIR和trEMBL进行BLAST搜索来验证酶的新颖性。令我们吃惊地，在该A.niger酶和已知脯氨酰寡肽酶之间没有探测到明显的同源性。但是对氨基酸序列的更为接近的检查揭示了与Pro-X羧基肽酶(EC3.4.16.2)、二肽基氨基肽酶I(EC3.4.14.2)和胸腺特异性丝氨酸蛋白酶之间低却显著的同源性。所有这些酶已被分进丝氨酸肽酶SC组的S28家族(HandbookofProteolyticEnzymes；BarrettA.J.；RawlingsN.D.；WoessnerJ.F.，Eds.；AcademicPress，London，UK，1998，369-415)。此外，活性位点丝氨酸周围的GxSYxG构象在这些酶和A.niger来源的内切蛋白酶中是保守的。此外，S28家族的成员具有酸性pH最优值，具有在脯氨酸残基的羧基末端侧进行切割的特异性，并且是用类似A.niger来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶的信号序列和前肽合成的。此外，A.niger酶的大小类似于S28家族的成员。因此，A.niger脯氨酸特异性内切蛋白酶看起来是丝氨酸蛋白酶S28家族的成员，而非大多数胞质脯氨酰寡肽酶(包括从Flavobacteriummeningosepticum获得的酶)被归入的S9家族的成员。在这些结构和生理特征的基础上，我们已推断出，A.niger酶属于丝氨酸蛋白酶SC组的S28家族，而非S9家族。将A.niger来源的酶与属于S9家族的脯氨酰寡肽酶区分开的另外的特征是下述事实与属于后一家族的胞质脯氨酰内切蛋白酶不同，新鉴定出的A.niger酶被分泌进生长培养基。实施例2从A.niger获得的脯氨酸特异性内切蛋白酶的DH和混度最优值为建立A.niger来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶的pH最优值，制备具有不同pH值的缓冲液。用0.05mol/l乙酸钠和0.02MCaCl2来制备pH4.0-4.5-4.8-5.0-5.5和6.0的缓冲液；用含有0.02MCaCl2的0.05MTris/HCl缓冲液来制备pH7.0和8.0的缓冲液。分别使用乙酸和HCl调节pH值。发色合成肽Z-Gly-Pro-pNA被用作为底物。如果X-pNA肽键被切割的话，“pNA”(对硝基酰苯胺)底物会导致颜色改变。在水浴中将缓冲溶液、底物溶液和脯氨酰内切蛋白酶预稀释液(活性为0.1U/mL)加热至恰好37.0℃。混合后，接着在405nm处于37.0℃分光光度监测下进行3.5分钟的反应，每0.5分钟测量一次。从表1所示的结果可以清楚看出，A.niger来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶具有大约4的pH最优值。此外还建立了脯氨酰内切蛋白酶的温度最优值。为达到此目的，在不同司温度下，用CaseineResorufine(RocheDiagnostics，Alrnere，TheNetherlands)作为底物，在含有0.02mol/lCaCl2的0.1mol/l乙酸钠中于pH5.0对经过纯化的酶制剂进行2小时温育，通过在574nm处的测量来对酶活加以定量。根据获得的结果，来自A.niger的脯氨酸特异性内切蛋白酶具有大约50摄氏度的温度最优值。实施例3A.niger来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶的特导性针对发色肽底物的集合体，对从含有多个拷贝的表达盒(见WO02/45524)的A.niger菌株获得的粗制酶样品和经过色谱纯化的酶样品进行检验，以建立被编码的内切蛋白酶的特异性。在AAXpNA底物上对该酶的内蛋白水解活性加以检验，其中，“X”代表不同的天然氨基酸残基。在含有20CaCl2的0.1M乙酸缓冲液(pH4.0)中对AAX-pNA底物的贮液(150mmol/l)进行100X稀释。于405nm处在TECANGeniosMTPReader(Salzburg，Vienna)中于40摄氏度进行的10分钟动力学测量记录了光学密度的增加。在Excel中对产生的数据进行进一步处理，产生图2所示的图。从结果可以清楚看出，A.niger来源的内切蛋白酶对于脯氨酰肽键具有高度特异性，其对丙氨酰键具有副活性。粗制的和经过色谱纯化的制剂显示了相似的活性情况。实施例4A.niger来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶可以水解大的蛋白以及小的肽，其因此是真正的内切蛋白酶由于特殊的结构特征，属于丝氨酸蛋白酶SC组的S9家族的脯氨酰寡肽酶不能消化大于30个氨基酸的肽。该限制对于应当尽可能迅速高效地水解不同蛋白的酶来说是明显的缺点。为检查A.niger来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶是否展示出与底物分子大小相关的同样的局限性，我们将来自A.niger的经色谱纯化脯氨酰内切肽酶与小的合成肽和大的卵清蛋白分子一起温育，以研究这些底物分子的降解动力学。所用的合成肽是序列NH2-FRASDNDRVIDPGKVETLTIRRLHIPR-COOH的27肽，其是Pepscan公司(Lelystad，TheNetherlands)的赠品。如其氨基酸序列所显示的，该肽含有2个脯氨酸残基，一个在中间一个在肽的非常末端。所用的完整卵清蛋白分子(PierceImject，含有20mg冻干物质的小管)由385个氨基酸构成，其分子量为42750Da。该分子含有14个脯氨酸残基，其中一个位于该分子C末端最后一位，不能被脯氨酸特异性内切蛋白酶所切割。在50℃用经纯化的A.niger来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶与卵清蛋白和寡肽分别进行温育。在若干次时间间隔点取样，使用SDS-PAGE进行分析。用含有20mMCaCl2的0.1M乙酸缓冲液(pH4)对具有4.5单位/ml活性的经色谱纯化的A.niger来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶进行100倍稀释。将卵清蛋白溶解于乙酸缓冲液(pH4)中，至浓度为1mg/ml(22μM)。将27肽溶解于同样的缓冲液中，达到0.48mg/ml的浓度(152μM)。卵清蛋白和27肽溶液的摩尔浓度被选为使得两种溶液含有相同摩尔浓度的可切割脯氨酸残基。卵清蛋白含有13个可能的脯氨酸切割位点，而27肽仅有两个。两种底物溶液各取0.5ml，与10μl(0.45毫U)酶溶液在Eppendorf热混合仪中于50℃进行温育。在若干时间间隔点，从温育混合物中取10μl样品，保持在20℃，直到进行SDS-PAGE。用于SDS-PAGE和染色的所有材料都购自Invitrogen(Breda，TheNetherlands)。根据厂商说明书，使用LDS缓冲液来制备样品，根据厂商说明书，使用MES-SDS缓冲体系，在12％Bis-Tris凝胶上进行分离。使用SimplyBlueSafeStain(CollodialCoomassieG250)进行染色。从图3中可见，在最初4.75小时的温育中，卵清蛋白被Aspergillus来源的酶切割为大约35-36kD的离散条带(第3道)。延长的温育期间导致进一步破碎为多种分子量的更小产物(第7道)。此外，27肽与酶的温育导致迅速降解，这可从第4、6和8道中稍暗淡且更模糊的条带来判断。因为27肽以与大得多的卵清蛋白分子同样的速度破裂，因此可以推断出，与属于S9家族的已知脯氨酰寡肽酶不同，较之大得多的蛋白，A.niger来源的脯氨选特异性内切蛋白酶对小尺寸肽没有特别偏好。该观察证实A.niger来源的酶代表真实的内切蛋白酶，以及水解不同类型蛋白的优选的酶。该发现导致了下述实施例阐述的该酶的惊人用途。实施例5将酪蛋白酸钾与来自A.niger的脯氨酸特异性内切蛋白酶一起温育迅速产生IPP和LPP而不产生VPP在本实验中，过量生产的、基本上纯的来自A.niger的脯氨酸特异性内切蛋白酶与酪蛋白酸钾一起温育，以检验ACE抑制肽IPP、VPP以及LPP的释放。所用的内切蛋白酶基本上纯，这表明，除了纯的脯氨酸特异性内切蛋白酶所固有的内蛋白水解活性(即，对脯氨酸和丙氨酸残基的羧基末端切割)之外不存在其它显著的蛋白水解活性(见实施例7)。为尽可能限制作为摄取ACE抑制肽造成的钠摄取，用酪蛋白酸钾作为该温育中的底物。将酪蛋白酸盐悬浮于65摄氏度水中，浓度为10％(w/w)蛋白，之后用磷酸将pH调节为6.0。然后将悬浮液冷却至55摄氏度，将A.niger来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶以4单位/克蛋白的浓度加入(关于单位的定义，见材料和方法一节)。在持续搅拌下，对该混合物进行24小时的温育。在该期间不进行进一步的pH调节。1、2、3、4、8和24小时的温育之后取样。通过将样品迅速加热至90摄氏度5分钟，对每份样品终止酶活性。冷却后，使用磷酸将每份样品的pH迅速降低至4.5，之后在Hereaus台式离心机中于3000rpm对悬浮液离心5分钟。完全澄清的上清液被用于LC/MS/MS分析，以对上清液中的肽VPP、IPP、LPP、VVVPP和VVVPPF进行定量(见材料和方法一节)。牛奶酪蛋白包括数种不同蛋白，包括beta酪蛋白和kappa酪蛋白。根据已知的氨基酸序列，beta酪蛋白包含ACE抑制三肽IPP、VPP和LPP。在beta酪蛋白中，IPP被含有于序列-P71-O72-N73-I74-P75-P76-中，VPP被含有于序列-P81-V82-V83-V84-P85-P86-中，LPP被含有于序列-P150-L151-P152-P153-中。kappa酪蛋白以大约是beta酪蛋白浓度的50％的摩尔浓度存在于酸沉淀的酪蛋白酸盐制剂中，其仅包含IPP。kappa酪蛋白中，IPP被含有于序列-A107-I108-P109-P110-中。酪蛋白的其它蛋白成分不含IPP、VPP或LPP。表1和表2显示了酸化和经离心上清液中存在的肽的浓度，其是由LC/MS/MS定量的。这些表中展示的多种肽的浓度是相对加入到温育混合物中的每克酪蛋白酸钾而言计算的。如表1所示，1小时的温育后IPP达到其最大浓度。IPP浓度不会在其上进一步增加。五肽VVVPP的形成展示出了与IPP产生相同的动力学。如理论所预期的，VVVPP的摩尔产率与LPP肽的摩尔产率相似。LPP和VVVPP的产率达到理论可行的大约60％。LPP的最大浓度在仅3小时温育后即达到这个事实暗示对beta酪蛋白分子特定部分的切割可能略微更困难。与VVVPP相反，六肽VVVPPF完全不形成。该观察表示，脯氨酸特异性内切蛋白酶高效切割-P-F-键，由此产生VVVPP。三肽IPP立即形成，但是其摩尔产率不高于VVVPP或LPP最大摩尔产率的大约三分之一。因为在beta酪蛋白和kappa酪蛋白中都含有IPP三肽，该结果是预料不到的。对于该观察而言，可能的解释是脯氨酸特异性内切蛋白酶能产生IPP，但是只能从酪蛋白酸盐的kappa酪蛋白部分产生。考虑到kappa酪蛋白的相关氨基酸序列，这表明-A107-I108-肽键被该酶的丙氨酸特异性活性切割开。如果这是真的，释放的IPP的量达到存在于kappa酪蛋白中的量的大约40％，但是不超过理论上存在于beta加kappa酪蛋白中存在的IPP的量的大约10％。该针对IPP释放的切割机制还解释了VPP为何不能从其前体分子VVVPP形成简单地，需要的内蛋白水解(或氨基肽酶)活性不存在于所使用的A.niger来源的酶制剂中。表1基于加入的每克蛋白计算得到的、酸化上清液中的摩尔肽含量表2以mg/g加入的蛋白计算的、酸化上清液中的肽浓度实施例6并入酸性酪蛋白沉淀步骤导致了对ACE抑制肽的5倍浓缩如实施例5所述，以10％(w/w)蛋白浓度存在的酪蛋白酸钾被用于与A.niger来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶在pH6.0下温育。数次不同温育周期后，加热样品，终止其它酶活性，之后将pH降低至4.5，以最小化酪蛋白溶解度。通过低速离心除去不可溶酪蛋白分子。在表1和表2中，我们已经提供了基于10％蛋白的起始浓度计算的ACE抑制肽的浓度。但是，作为酸化和随后离心步骤的结果，已经除去了大部分加入的蛋白。为将酸化上清液的这些减少的蛋白含量考虑进来，进行氮(Kjeldehl)分析。根据后者数据，发现不同上清液含有下述蛋白水平。表3酸化上清液的蛋白含量考虑到这些数据，我们重新计算了每种上清液中存在的ACE抑制肽的浓度，但是这是使用它们真实的蛋白含量。这些重新计算的结果示于表4。表4以存在的每克蛋白计算得到的、酸化上清液中的肽浓度对表2和表4的比较清楚地显示，简单酸化步骤之后接着进行工业上可行的倾析、过滤或低速离心步骤，导致特定的ACE抑制肽浓度的5倍增加。后面的实验显示可通过在倾析、过滤或低速离心之前对酸化悬浮液进行过夜贮藏来提高酸沉淀步骤的效率。实施例7对ACE抑制肽生产中污染性的酶活性加以定量根据本发明，ACE抑制肽可在简单的一步法中获得，这通过对合适的蛋白底物和脯氨酸特异性内切蛋白酶一起温育来实现。随后对水溶性ACE抑制肽的富集由通过酸化沉淀较大分子量的蛋白片段来完成。后一酸富集方法的效率依赖于对底物分子非常有选择性的切割。存在的蛋白水解活性越多，则由此形成的水溶性肽就越多，因此会降低ACE抑制肽的富集因子。例如，在与底物温育期间，额外的非脯氨酸或非丙氨酸特异性内切蛋白酶的存在导致更多非生物活性肽的可溶，由此稀释了IPP和LPP在最终浓缩物中的相对浓度。此外，污染性外切蛋白酶(例如羧基肽酶或氨基肽酶)的存在导致游离氨基酸的释放。这些额外的游离氨基酸也会稀释ACE抑制肽的相对浓度，此外，作为增加的Maillard反应的结果，给予培养液不好的味道。为最小化所有这些不想要的副反应，优选使用基本上纯的脯氨酸特异性内切蛋白酶。基本上纯指在所用的培养条件下，污染性内切蛋白酶以及污染性外切蛋白酶的活性是最小化的或者优选不存在。下述检验流程被用来对此类污染性活性加以定量。该检验流程的基础是通过数种选择性发色肽的集合形成的。在所有这些发色肽中，“Z”代表苄氧羰基和“pNA”代表发色团对硝基酰苯胺。因为仅脯氨酸特异性寡和内切蛋白酶能从N末端被“Z”基团封闭的肽释放出有色的pNA，因此肽Z-AAAP-pNA被用于对想要的脯氨酸特异性内蛋白水解活性加以定量。因为很多内切蛋白酶能从Z-AAAF-pNA和Z-AAAR-pNA释放pNA，因此这两种肽被用于对污染性的、非脯氨酸特异性内蛋白水解活性加以定量。因为肽QNIPP和VVVPP向IPP和VPP的分别转化需要能有效除去Gln(Q)和Val(V)残基的氨基肽酶，因此Q-pNA和V-pNA被用于对此类污染性氨基肽酶活性加以定量。因为很多羧基肽酶能从肽释放Phe(F)和Arg(R)残基，因此含有这些残基的肽备选用来对污染性羧基肽酶活性加以定量。但是，对于测量羧基肽酶而言没有合适的发色基团，从而不得不开发出使用合成肽Z-AF和Z-AR的替代方法。该替代方法下文提供。所有发色肽都从Pepscan(Lelystad，TheNetherlands)获得。肽Z-AF和Z-AR购自Bachem(Switserland)。所有温育都在40℃进行。为阐述该方法，对可通过商业途径获得的酶制剂Flavourzyme1000L(BatchHPN00218，从Novozymes(Denmark)获得)、来自ShinNihon(Japan)的SumizymeFP和来自ABEnzymes(UK)的CorolaseLAP(Ch.4123)加以检验，并与来自A.niger的脯氨酸特异性内切蛋白酶相比较。检验的商业酶制剂被稀释，以产生最优的温育条件，但在最终数据的表述中要将其重新计算为商业产品的浓度(见表5)。测量污染性氨基肽酶活性将100％DMSO中的150mmol/lV-pNA和Q-pNA贮液在0.1MBisTris缓冲液(pH6)中稀释80倍，制作以1∶1的比例含有V-pNA和Q-pNA的3.75mmol/lV-pNA+Q-pNA底物溶液。将该氨基肽酶底物溶液按200μl一份移取入微滴定板(MTP)的各个孔中。预先在40℃于TecanGeniosMTP(Salzburg，Vienna)中温育MTP，在Magellan4软件下运行。通过加入50μl合适的酶溶液来起始反应，使得温育在3mM的底物浓度下发生。典型地，使用1∶50稀释的液体酶样品Flavourzyme、CorolaseLAP和脯氨酸特异性内切蛋白酶。关于干的SumizymeFP产品，使用1％溶液。通过TecanGeniosMTP显影在405nm处对黄颜色加以测量，这是作为对氨基酸-pNA键进行切割的结果，接着进行至少20个动力学循环(大约10分钟)。该软件产生作为OD405/分钟获得的数据。测量脯氨酸特异性酶活性该测量基本与氨基肽酶试验一样来进行，但是在该试验中，Z-AAAP-pNA被用作为唯一底物，其终浓度为3mmol/l。通过将pH6缓冲液中的悬浮液加热至50-55℃来溶解该底物，得到室温下清澈的溶液。测量在40℃进行。典型地，使用1∶50稀释的液体酶样品Flavourzyme、CorolaseLAP。SumizymeFP以1％溶液来使用。典型地，脯氨酸特异性内切蛋白酶以1∶5000稀释来使用。软件产生以OD405/分钟表示的数据。测量污染性非脯氨酸特异性内切蛋白酶活性该测量也按照与对氨基肽酶试验的描述基本一样的方式来进行，但是，在该检验中，1∶1比例以及3mmol/l终浓度的Z-AAAF-pNA和Z-AAAR-pNA被用作为底物。底物Z-AAAF-pNA在所用的pH6.0的检验条件下极少可溶，但是有枯草杆菌蛋白酶的检验温育却能使得底物迅速溶解，伴随pNA释放。测量在40℃进行。但是，为了弥补该弱的可溶性，对MTP读数器加以程序调整，使其在动力学循环之间摇动。软件仍产生以OD405/分钟表示的数据。测量污染性羧基肽酶活性因为不可获得敏感的发色肽用于测量羧基肽酶活性，因此使用基于Boehringer方案的方法，来对羧基肽酶C加以定量。将乙醇中的150mmol/lZ-A-F和Z-A-R贮液在0.1MBisTris缓冲液(pH6)中稀释80倍，制作以1∶1的比例含有Z-A-F和Z-A-R的3.75mmol/lZ-A-F+Z-A-R底物溶液。取200μl该底物溶液，移入eppendorf管，在40℃预先温育。通过加入50μl合适的酶稀释液来起始反应。典型地，关于Flavourzyme和CorolaseLAP和脯氨酸特异性内切蛋白酶，使用1∶50的稀释液。关于SumizymFP，使用1％的溶液。5分钟之后，通过加入250μl茚三酮(ninhydrine)试剂来终止反应。茚三酮试剂由溶解于15mlDMSO中的60mg还原茚三酮(hydrindantin)和400mg茚三酮(Merck)制成，向其中加入5ml4.0mol/l的乙酸锂缓冲液(pH5.2)。4.0mol/l的乙酸锂缓冲液是通过溶解LiOH(Sigma)之后用冰醋酸(Merck)将pH调节至pH5.2来制得的。终止反应之后，在95℃对每份样品加热15分钟，以促进颜色形成，随后用纯的乙醇稀释10倍。在Uvikon分光光度计中于578mn对形成的颜色加以测量。以与活性样品同样的方式制作空白对照，但是茚三酮试剂和酶的加入被颠倒进行。为对羧基肽酶活性产生的游离氨基酸加以定量，氨基酸L-苯丙氨酸被用于产生校正曲线。以与样品同样的方式，对在缓冲液(pH6)中含有0.1875、0.375、0.75、1.5和3.0mol/lL-苯丙氨酸(Sigma)的溶液进行处理，即，小管中250μl。从获得的OD578值，在Excel中构建曲线。使用该曲线来计算含有Z-A-F和Z-A-R底物的样品中存在的游离氨基酸的浓度。从获得的值，可以计算出羧基肽酶活性，其表示为相对每份检验的酶的含量每分钟的微摩尔。计算活性比例为建立用于本发明方法的多种酶制剂的适宜性，对相关酶活性的系数(quotient)加以计算。在基于MTP读数器的试验中，通过相对时间上的pNA释放来分析酶活性，即作为ΔOD405/分钟。通过MTP读数器获得的酶活的系数是通过简单地除以针对酶的同样数量获得的ΔOD/分钟值来计算的。但是，在羧基肽酶试验的情况下，产生的OD不能直接与基于MTP-pNA的试验产生的ΔOD/分钟加以比较。此时首先要将测得的OD转化为每分钟释放的氨基酸(μmol/分钟)。为达到此目的，在MTP读数器中产生校正曲线，其中，纯pNA(Sigma)稀释为0.25、0.125、0.0625、0.0312和0.015mmol/l，每个孔测量250μl。在Excel中从获得的数据构建校正曲线。从该校正曲线将ΔOD/分钟转化为μmol/分钟，使得基于pNA的测量可与基于茚三酮的测量相比较。在上述检验中产生的数据的基础上，针对想要的脯氨酸特异性和污染性内切蛋白酶、氨基肽酶和羧基肽酶活性对所用的多种酶制剂进行分析。每种酶制剂中存在的想要的脯氨酸特异性活性显示于表5“脯氨酸特异性活性”一栏中。关于污染性氨基肽酶活性(氨基肽酶/脯氨酸特异性活性)和污染性羧基肽酶(羧基肽酶/脯氨酸特异性活性)和内蛋白水解活性(内蛋白水解/脯氨酸特异性活性)的数据相对存在的脯氨酸特异性活性显示。在每种酶制剂中存在的相对于污染性羧基肽酶的污染性氨基肽酶的活性以(氨基肽酶/羧基肽酶)显示。明显地，检验的商业酶制剂没有哪种含有任何显著的脯氨酸特异性寡或内蛋白水解活性。此外，检验的所有商业酶制剂都含污染性内和外蛋白水解活性。表5对多种酶制剂中污染性蛋白水解活性的定量*Sumizyme是在1％溶液中测量的，Flavourzyme和Corolase作为1∶50的稀释液测量。从A.niger获得的脯氨酸特异性活性作为l∶5000稀释液来测量。然后将数据换算为提供的产品中存在的活性。A.可通过传统配方流程，使用下述成分来制备药物组合物实施例8软明胶胶囊使用下述成分，通过传统流程来制备软明胶胶囊活性成分蛋白水解产物0.3g其它成分甘油、水、明胶、植物油实施例9硬明胶胶囊使用下述成分，通过传统流程来制备硬明胶胶囊活性成分蛋白水解产物0.7g其它成分填料数量足够的乳糖或纤维素或纤维素衍生物润滑剂如果需要的话，硬脂酸镁(0.5％)实施例10片剂使用下述成分，通过传统流程来制备片剂活性成分蛋白水解产物0.3g，未水解蛋白0.4g其它成分微晶纤维素、二氧化硅(SiO2)、硬脂酸镁、交联羧甲基纤维素钠。B.可以使用下列组分按照传统工序来制备食物产品实施例11有30％果汁的软饮典型份量240ml活性成分蛋白水解产物和作为碳源的麦芽糊精被加入到该食物产品中蛋白水解产物1.5-15g/每份麦芽糊精3-30g/每份I.用下述成分制备软饮复合物果汁浓缩物和水溶性香料[g]1.1橙汁浓缩物60.3℃白利糖度(Brix)，5.15％酸度657.99柠檬浓缩物43.5℃白利糖度，32.7％酸度95.96水溶性橙味香料13.43水溶性杏味香料6.71水26.461.2颜料β-胡萝卜素10％CWS0.89水67.651.3酸和抗氧化剂抗坏血酸4.11无水柠檬酸0.69水43.181.4稳定剂果胶0.20安息香酸钠2.74水65.601.5油溶性香料油溶性橙味香料0.34蒸馏得到的甜橙油0.341.6活性成分活性成分(这指上文提到的活性成分蛋白水解产物和麦芽糊精)以上文提到的浓度存在。果汁浓缩物和水溶性香料在没有空气掺入的条件下混合起来。颜料溶于去离子水中。抗坏血酸和柠檬酸溶于水中。安息香酸钠溶于水中。搅拌下加入果胶，煮沸令其溶解。冷却所述溶液。油溶性香料和甜橙油预先混合起来。1.6中提到的活性成分被干燥地混合起来，然后优选搅拌添加到果汁浓缩物混合物(1.1)中。为制备所述的软饮复合物，3.1.1至3.1.6的所有部分都被混合到一起，然后用Turrax再用高压均质机(p1＝200bar，P2＝50bar)对其进行均质。II.用下述成分来制备瓶装糖浆软饮复合物74.50水50.00糖浆，60℃白利糖度150.00所述瓶装糖浆的成分被混合到一起。用水将所述瓶装糖浆稀释到1L，成为现成可用的饮料。变化可以对所述饮料进行巴氏消毒来代替使用安息香酸钠。所述饮料还可经过碳酸化。实施例12不同商业酶制剂的氨基肽水解活性在beta酪蛋白中，IPP被含有于序列-P71-Q72-N73-174-P75-P76-中，VPP被含有于序列-P81-V82-V83-V84-P85-P86-中，LPP被含有于序列-P150-L151-P152-P153-中。在酪蛋白的其它蛋白组分中，仅kappa酪蛋白包括含有IPP的序列。从脯氨酸特异性内切蛋白酶的特异性，可以推断出，将beta酪蛋白与A.niger来源的酶一起温育，将形成Q72-N73-I74-P75-P76-、V82-V83-V84-P85-P86-和L151-P152-P153-。与LPP相反，形成的两种五肽仅展示出低的ACE抑制活性。例如，EP0583074报道，VVVPP的IC50值为873微摩尔/l，而截短的VPP分子则具有9微摩尔/1的IC50值。所以明显地，为产生酪蛋白水解产物的完全ACE抑制能力，在与脯氨酸特异性内切蛋白酶温育期间形成的VVVPP和QNIPP必须被分别转化为三肽VPP和IPP。因为氨基肽酶随后可从肽的N末端除去氨基酸，因此需要能高效释放VPP序列前的两个缬氨酸(“V”)残基以及IPP序列前的谷氨酰胺(“Q”)和天冬酰胺(“N”)残基的氨基肽水解酶活性。因为己知XPP三肽中存在的X-P和P-P肽键能抵抗酶促切割，此类氨基肽水解活性就可能将这两种五肽转变为想要的VPP和IPP三肽。针对它们的氨基肽水解活性，对三种商业酶制剂进行了检验Flavourzyme1000LBatchHPN00218(Novozymes，Denmark)、SumizymeFP(ShinNihon，Japan)和CorolaseLAPCh.4123(ABEnzymes，UK)。已知Flavourzyme和SumizymeFP是复合酶制剂，其中除了非特异性的内蛋白水解和羧基肽水解活性之外还含有数种氨基肽水解酶活性。CorolaseLAP展示出相对纯的、克隆并且过量表达的来自Aspergillus的亮氨酸氨基肽酶活性。使用发色底物F-pNA(对照)、Q-pNA和V-pNA对这三种商业制剂中存在的氨基肽水解活性加以检验。为达到此目的，将DMSO中150mMX-pNA的贮液在Bis-Tris缓冲液(pH6)中稀释100x。向微滴定板中每个孔装入200μl经过缓冲的底物溶液，在40℃于TecanGeniosMTP读数器(受Magellan4软件的控制)中预先温育。通过加入50μl合适的酶溶液来起始反应(SumizymeFP粉末在使用之前以100mg/ml的浓度溶解于Bis-Tris缓冲液(pH6)中)。接着在405nm监视10分钟黄色pNA的释放。软件计算OD/分钟。将每种酶制剂针对多种底物的活性相对它们针对F-pNA的活性进行标准化。获得的数据显示于图4中。明显地，所有三种酶制剂都展示出了针对F-pNA的最高活性，但是Q-pNA和V-pNA也形成了这些酶的底物。这些结果表明，如果与脯氨酸特异性内切蛋白酶组合，商业制剂中的每一种都应当能形成想要的ACE抑制三肽IPP、VPP以及LPP，因为氨基肽酶的活性能将脯氨酸特异性蛋白酶形成的肽QNIPP和VVVPP分别转化为IPP和VPP。在实施例13所述的实验中检验了该假设。实施例13用来自A.niger的脯氨酸特异性内切蛋白酶与不同氨基肽水解酶制剂来温育酪蛋白酸盐，产生高产率的IPP、LPP和VPP在本实施例中，我们研究了将来自A.niger的脯氨酸特异性蛋白酶与氨基肽水解活性在同一温育步骤中组合使用对于多种ACE抑制肽形成的作用。为达到此目的，制备酪蛋白酸盐溶液，这是通过将50克酪蛋白酸钠溶解于506克70摄氏度水中，产生含有81克蛋白/1的溶液来实现的。将该溶液冷却至50摄氏度，之后使用磷酸将pH降低至6.0(在20℃测量的)，之后加入多种酶组合。向所有样品(每份10ml)中加入脯氨酸特异性蛋白酶，达到每克蛋白4个单位的浓度(关于单位的定义，参见材料和方法一节)。样品A1仅含该脯氨酸特异性蛋白酶。样品B1含有脯氨酸特异性蛋白酶加38微升的下述溶液，其中含有稀释于5克水中的1140mg经浓缩Flavourzyme液体。在样品B2中，脯氨酸特异性蛋白酶与8微升的该Flavourzyme溶液组合。在样品C1中，脯氨酸特异性蛋白酶与100微升的CorolaseLAP液体组合。在样品C2中，脯氨酸特异性蛋白酶与10微升经过10倍稀释的CorolaseLAP液体样品组合。在所有5份样品中，温育被允许在50摄氏度进行6小时。通过将混合物加热至90摄氏度5分钟来终止酶促反应。在Eppendorf离心管中离心10分钟之后获得的澄清的上清液被收集起来，冷冻放置，直到进行LC/MS/MS分析。LC/MS/MS分析之后获得的数据展示于表5中。如前所述，对样品A1的温育条件(仅用脯氨酸特异性蛋白酶)高效地产生了LPP以及VVVPP，但是没有显著数量的VPP。肽VVVPPF的不存在表明脯氨酸特异性蛋白酶在所用的条件下能高效切割脯氨酸残基的羧基末端。在样品A1中，IPP的产率大致为VVVPP产率的三分之一。但是，将脯氨酸特异性蛋白酶与Flavourzyme(样品B1或B2)或与CorolaseLAP(样品C1)组合，对于IPP产率有着明显的激发作用。在样品C2(具有低浓度的CorolaseLAP)中，IPP的产率没有增加，这大概是因为氨基肽酶的浓度不足以转化脯氨酸特异性蛋白酶形成的所有QNIPP。因为1克酪蛋白理论上能产生6.9mg(21.1微摩尔)的IPP(丛beta酪蛋白加kappa酪蛋白产生)，样品B1和C1中存在的IPP水平分别占到最大可获得产率的70％和55％。与我们的期望一致，增加的氨基肽水解活性导致了VVVPP浓度的降低以及VPP浓度的增加。少量中间产物肽VVPP在样品B2和C2中可被探测到这个事实表明，在这些样品中，氨基肽水解活性不足以将脯氨酸特异性蛋白酶形成的VVVPP完全转化为VPP。因为1克酪蛋白理论上能产生4.58mg(14.7微摩尔)的VPP，在样品B1、B2和C1中，达到了最大的VPP产率。总而言之，本实验清楚地表明，脯氨酸特异性蛋白酶与合适的氨基肽水解活性的组合可高效产生高浓度的ACE抑制肽。脯氨酸特异性蛋白酶与氨基肽酶的组合最好在用脯氨酸特异性酶进行的温育之后进行。取决于特定的工艺要求，用额外的酶进行的温育可在使用低pH条件或水可混溶溶剂进行纯化之前或之后发生。此外，温育可用能除去具有ACE抑制作用的氨基酸序列之前的不想要的氨基酸残基的氨基肽酶活性来进行，或者其可以用合适的内蛋白水解活性来进行。此类内蛋白水解活性的合适例子由木瓜蛋白酶(其可作为Collupulin从DSMFoodSpecialities，Delft，TheNetherlands获得)所代表，其能有效切割Asn(N)和Val(V)残基的羧基末端。如果用额外的酶进行的温育在酸化或乙醇沉淀步骤之前进行，那么该温育最好用相对纯的氨基肽酶，例如CoralaseLAP来进行(见实施例7)。表6以mg/(g加入的蛋白)计算的上清液中肽浓度权利要求1.一种方法，用于生产包含来自蛋白的IPP的组合物，其中，从所述蛋白产生的IPP与VPP的重量比为至少5∶1，优选至少10∶1，更优选至少20∶1(wt/wt)，所述方法包含使用具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性或脯氨酰寡肽酶活性的酶活性和能水解-I-P-P-序列氨基末端侧的键的酶活性。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性或脯氨酰寡肽酶活性的酶活性和所述能水解-I-P-P-序列氨基末端侧的键的酶活性存在于一种酶中，优选地，该酶是脯氨酸特异性内切蛋白酶或脯氨酰寡肽酶，更优选地，该酶是脯氨酸特异性内切蛋白酶。3.如权利要求1至3中任意一项所述的方法，其中，所述脯氨酸特异性内切蛋白酶不含氨基肽酶活性和/或羧基肽酶活性。4.如权利要求1或2所述的方法，其中，温育时间小于24小时，优选小于10小时，更优选小于4小时。5.如前述任意一项权利要求所述的方法，其中，温育温度高于30℃，优选高于40℃，更优选高于50℃。6.如前述任意一项权利要求所述的方法，其中，还产生LPP。7.如前述任意一项权利要求所述的方法，其中，使用奶蛋白，优选使用酪蛋白。8.如权利要求7所述的方法，其中，所述蛋白序列中存在的-A-I-P-P-和/或-P-I-P-P-序列至少30％转化为肽IPP。9.如权利要求6所述的方法，其中，所述蛋白序列中存在的-P-L-P-P-和/或-A-L-P-P-序列至少40％转化为肽LPP。10.一种方法，用于制备包含可溶肽，优选地包含IPP的组合物，所述方法包括将通过用合适的蛋白来源水解产生的、优选通过权利要求1至9中任意一项所述的方法产生的组合物的pH改变为使水解蛋白的一部分变为不可溶的pH，以及将所述不可溶的部分与可溶肽分离，得到包含可溶肽的组合物。11.一种方法，用于制备包含可溶肽的组合物，所述组合物是通过下述步骤生产的-首先，用脯氨酸特异性内切蛋白酶将蛋白水解至5至30％的DH，-可选地，进行第二种酶处理，以及-之后，将水解蛋白的不可溶部分与可溶部分在选定的pH条件下分离，优选在酸性pH条件下，更优选在3.5至6之间的pH下，最优选在4至5之间的pH下，以产生包含可溶肽的组合物。12.一种组合物，所述组合物包含可溶肽，其中，所述肽的至少70wt％，优选至少80wt％，最优选至少90wt％在3.5至6之间的pH，优选4至5之间的pH下是可溶的，并且，其中，所述可溶肽中没有任何一种肽以大于所述可溶肽40wt％的量存在，优选地，所述可溶肽中没有任何一种肽以大于所述可溶肽30wt％的量存在，最优选地，所述可溶肽中没有任何一种肽以大于所述可溶肽20wt％的量存在，并且所述组合物可通过权利要求11所述的方法获得。13.脯氨酸特异性内切蛋白酶用于从蛋白生产IPP的用途，其中，产生的IPP(重量)是产生的VPP的至少五倍。14.一种组合物，所述组合物是通过蛋白水解产生的，所述组合物包含IPP，其中，所述组合物中IPP对VPP的重量比为至少5∶1，优选至少10∶1，更优选至少20∶1。15.如权利要求14所述的组合物，其还包含LPP。16.如权利要求14或15所述的组合物，其作为营养药物存在，优选作为药剂存在。17.如权利要求12至16中任意一项所述的组合物，其是由权利要求1至10中任意一项所述的方法产生的。18.如权利要求12和14-17中任意一项所述的组合物或根据权利要求1至11中任意一项所述的方法产生的组合物作为营养药物，优选地作为药剂的用途，所述用途是用于生产促进健康或者预防和/或治疗疾病用的营养药物，优选地，药剂，或者用于生产用于治疗或预防疾病，例如高血压、心力衰竭、前糖尿病或糖尿病、肥胖、葡萄糖耐量受损或压力的营养药物，优选地，药剂。19.如权利要求18所述的用途，其中所述组合物以膳食补充剂的形式存在，以个人护理应用的形式存在，所述应用包括以水剂、凝胶或乳剂的形式存在的局部应用，或者作为食物、饲料或宠物食品成分存在。20.如权利要求12和14至17中任意一项所述的组合物的用途，用于生产功能性食物产品，所述食物产品用于预防肥胖或用于体重控制。21.如权利要求12和14至17中任意一项所述的组合物的用途，用于生产功能性食物产品，所述食物产品用于心血管健康保持。22.如权利要求21所述的用途，其中所述心血管健康保持包含抑制血管紧张素转化酶。23.如权利要求21所述的用途，其中所述心血管健康保持包含控制血胆固醇水平。24.功能性食物产品，其能对其消费者提供健康方面的好处，所述健康方面的好处选自预防肥胖、体重控制和心血管健康保持，所述食物产品包含如权利要求12和14至17中任意一项所述的组合物。25.如权利要求24所述的功能性食物产品，其中，所述心血管健康保持方面的好处包含抑制血管紧张素转化酶和/或控制血胆固醇水平。26.如权利要求24或25任意一项所述的功能性食物产品，其包含50-200mmol/kg的K+和/或15-60mmol/kg的Ca2+和/或6-25mmol/kg的Mg2+。27.如权利要求26所述的功能性食物产品，其包含110-135mmol/kg的K+和/或35-45mmol/kg的Ca2+和/或13-20mmol/kg的Mg2+。28.如权利要求24至27任意一项所述的功能性食物产品，其包含一种或多种B族微生物。29.如权利要求28所述的功能性食物产品，其包含叶酸、维生素B6和维生素B12。30.如权利要求24至29任意一项所述的功能性食物产品，其包含3至25wt％的固醇，更优选地，7至15wt％的固醇。31.一种方法，用于生产食物产品、饮料产品或膳食补充剂，所述方法包括(a)根据权利要求1至9中任意一项所述的方法来生产包含IPP的组合物；(b)将所述含有IPP的组合物加入到食物产品、饮料产品或膳食补充剂中。32.如权利要求31所述的方法，其中，在步骤a中，使用奶蛋白，优选使用酪蛋白。33.如权利要求32所述的方法，其中在步骤a中，所述蛋白序列中存在的-A-I-P-P-或-P-I-P-P-序列至少10％，更优选至少30％被转化为肽IPP。34.如权利要求32所述的方法，其中在步骤a中，所述蛋白序列中存在的-P-L-P-P-或-A-L-P-P-序列至少10％，更优选至少40％被转化为肽LPP。35.如权利要求31所述的方法，还包括步骤c)，以纯化来自水解蛋白的肽，所述蛋白优选地被非天冬氨酸蛋白酶水解，更优选被丝氨酸蛋白酶水解，所述水解蛋白能在选定的pH条件下沉淀，所述步骤包括将pH改变为能使所述水解蛋白沉淀的pH，以及将沉淀的蛋白与所述水解蛋白分离。36.如权利要求35所述的方法，其中步骤c在步骤a)之后并在步骤b)之前发生。37.如权利要求31所述的方法，其中，所述食物产品、饮料产品或膳食补充剂选自由植物黄油、涂抹酱、黄油、奶制品或含乳清饮料构成的组，优选地，基于酸奶或奶的产品，例如酸奶或奶。38.可通过权利要求31至37中一项或多项所述的方法获得的食物产品、饮料产品或膳食补充剂。39.如权利要求38所述的食物产品、饮料产品或膳食补充剂，其包含0.05至10wt％，更优选0.1至5wt％，最优选0.2至4wt％的所述含有IPP的组合物。40.如权利要求38或39所述的食物产品、饮料产品或膳食补充剂，其包含相对每100克产品而言0.05至50mg的IPP，更优选0.1至40mg，最优选0.2至30mg。41.如权利要求38至40中一项或多项所述的食物产品、饮料产品或膳食补充剂，其中，IPP对VPP的重量比为5∶1至100∶1，更优选5∶1至48∶1。42.如权利要求38至41中一项或多项所述的食物产品、饮料产品或膳食补充剂，其包括IPP和LPP，其中，IPP对LPP的重量比为1∶10至1∶1，更优选为1.5∶7.1至4.8∶7.1。43.如权利要求38至42中一项或多项所述的食物产品、饮料产品或膳食补充剂，用于缓解人类的高血压。全文摘要本发明描述了一种方法，用于从蛋白来源生产IPP，其中，从蛋白生产的IPP和VPP的比例至少为5，优选至少为10，更优选至少20，所述方法包括使用脯氨酸特异性内切蛋白酶。文档编号A61K38/06GK1997750SQ200580023491公开日2007年7月11日申请日期2005年7月12日优先权日2004年7月12日发明者路泊·埃登斯,安德烈·利纳尔杜斯·鲁斯·德,罗伯特斯·安东尼厄斯·马金德尔特·霍文·范德,飞利浦斯·安东尼厄斯·帝恩申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司