针对肿瘤坏死因子的抗体及其用途的制作方法

专利名称：针对肿瘤坏死因子的抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及针对抗原肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factoralpha)(以下简称TNFα)的抗体，以及此类抗体的用途。更具体地，本发明涉及针对抗原TNFα的完全人源单克隆抗体以及此类抗体的用途。本发明还涉及可以表达此类抗体的杂交瘤或其他细胞系。此类抗体可用于诊断和治疗与TNFα的活性和/或过量产生有关的疾病。
背景技术：
TNFα已证明涉及传染性疾病、免疫紊乱、自身免疫病理、移植物抗宿主疾病(GVHD)、瘤形成(neoplasia)/癌症和与癌症有关的恶病质。参见Feldman M.，2002 Nat.Rev.Immunol.，2364。具体而言，TNFα水平在革兰氏阴性败血症(sepsism)、内毒素休克(参见Michie等，1989 Br.J.Surg.76670)、克罗恩氏病和类风湿性关节炎中受到显著诱导。TNFα涉及到如此广泛的适应症，表明开发针对这种炎症细胞因子的特异生物疗法的重要性。
几位研究人员报道了针对TNFα的单克隆抗体的特性，所述抗体在体外中和TNFα的活性。参见Liang CM等，1986，Biochem.Biophys Res.Commun.，137847，和Meager A等，1987 Hybridoma6305。这些抗体中的一部分被用作绘制人类TNFα表位图谱，开发酶免疫测定，帮助重组TNFα的纯化。参见Fendly BM等，1987Hybridoma，6359；Hirai M等，1987 J.Immunol Methods，9657；Moller A等，1990 Cytokine，2162；Bringman TS和Aggarwal BB，1987，Hybridoma，6489。遗憾的是，由于这些研究中所生成的抗体来源于非人类物种并且缺乏对TNFα的特异性，所以不能用作治疗人类患者的治疗性中和TNFα的抗体。
TNFα的中和抗血清或单克隆抗体已在非人类哺乳动物体中显示出功效即消除不利的病理生理事件，并在实验性内毒素血症中致死测试之后防止死亡。这些效果已在啮齿动物和非人类灵长类模型系统中得到证实。参见Beutler B等，1985 Science，229869；Tracey KJ等，1987 Nature，330662；Mathison JC等，1988 J.Clin.Invest.，811925；Shimamoto Y等，1988，Immunol.Lett.，17311；Opal SM等，1990，J.Infect.Dis.，1611148；Silva AT等，1990，J.Infect.Dis.，162454；Hinshaw LB等，1990，Circ.Shock，30279。
目前存在几种形式的中和抗体，Feldman对此作了综述。参见Feldman M，2002，Nat.Rev.Immunol.，2364。如综述中所述，已花费了大量的精力来构建中和抗体，该中和抗体可以产生用于人类长期给药的治疗适用的抗体。目前，抗体/TNFR融合(fclg/TNFR)蛋白(Enbrel)已经显示出一定的实用性，但缺点是在血清中的半衰期短，导致频繁给药(例如，每周两次)。长期治疗用的针对TNFα的中和治疗性抗体只要其本身不具有免疫原性，就会克服半哀期的问题(每3～4周注射一次)。另有人试图构建具有如下所需特性的TNFα的中和抗体即免疫原性低或无免疫原性，并具有其内源对应物(counterpart)特有的半衰期，但未获得成功。所述抗体的例子包括鼠/人嵌合体如英夫利昔单抗(Infliximab，cA2或Remicade)，以及人源化抗体CDP571或阿达木单抗(Adalimumab，D2E7或Humira)。这些代表了为构建与其人类对应物极为相似的中和治疗抗体所作的努力。
遗憾的是，由于所述药物固有的潜在免疫原性、较短的半衰期和/或对TNFα较弱的亲合力/亲和力，它们的全部潜能或许并没有实现。这些嵌合抗体引起的宿主免疫应答能够导致将抗体从循环中清除，使得重复给药由于缺少功效而不适于治疗。这些问题最终降低了患者的治疗效果。使用例如上述抗体或其片段还可能在扩增(scale-up)和制造过程中遇到其他问题。
因此，由于以上原因，本领域需要为临床指示群体(clinicallyindicated population)中的患者提供其它选择，所述临床指示群体中TNFα是引起某一特定疾病病理生理学的原因。用于长期给药的完全人源、高亲和力、中和单克隆抗体，或其片段，提供非免疫原性治疗方案所需的特性，其半衰期适用于频率较低的给药。

发明内容
本发明的实施方案涉及与肿瘤坏死因子-α特异性结合的人源单克隆抗体，该抗体具有氨基酸序列为“Ser Tyr Asp Met His”的重链互补决定区1(CDR1)。这里所述的抗体还可以包括氨基酸序列为“Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser ValLys Gly”的重链互补决定区2(CDR2)，氨基酸序列为“Glu ValGlu Ser Ala Met Gly Gly Phe Tyr Tyr Asn Gly Met Asp Val”的重链互补决定区3(CDR3)，包括SEQ ID NO70所示的氨基酸序列的重链氨基酸，以及包括SEQ ID NO74所示的氨基酸序列的重链氨基酸。
其它的实施方案包括人源单克隆抗体，该抗体具有氨基酸序列为“Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ile Asp Leu Gly”的轻链互补决定区1(CDR1)。此处所述抗体还可以包括氨基酸序列为“Ala Ala SerThr Leu Gln Ser”的轻链互补决定区2(CDR2)，氨基酸序列为“LeuGln His Lys Ser Tyr Pro Leu Thr”的轻链互补决定区3(CDR3)，包括如SEQ ID NO72所示的氨基酸序列的轻链氨基酸。
其他实施方案中，本发明提供与肿瘤坏死因子-α特异性结合的人源单克隆抗体，并且包括氨基酸序列为“Arg Ala Ser Gln GlyIle Arg Ile Asp Leu Gly”的轻链互补决定区1(CDR1)，氨基酸序列为“Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser”的轻链互补决定区2(CDR2)，氨基酸序列为“Leu Gln His Lys Ser Tyr Pro Leu Thr”的轻链互补决定区3(CDR3)。
另外的实施方案包括人源单克隆抗体，该抗体具有氨基酸序列为“Ser Tyr Asp Met His”的重链互补决定区1(CDR1)，氨基酸序列为“Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp SerVal Lys Gly”的重链互补决定区2(CDR2)，氨基酸序列为“GluVal Glu Ser Ala Met Gly Gly Phe Tyr Tyr Asn Gly Met Asp Val”的重链互补决定区3(CDR3)。
其他实施方案中，本发明包括与肿瘤坏死因子-α特异性结合的人源单克隆抗体，并且包括VH3-33重链基因，或其保守性变体。此处所述抗体还可以包括A30VK1轻链基因。
本发明另外的实施方案包括与肿瘤坏死因子-α特异性结合的人源单克隆抗体，其中所述抗体包括与典范类(canonical class)1相对应的重链互补决定区1(CDR1)。本发明提供的抗体还可以包括与典范类3相对应的重链互补决定区2(CDR2)，与典范类2相对应的轻链互补决定区1(CDR1)，与典范类1相对应的轻链互补决定区2(CDR2)，以及与典范类1相对应的轻链互补决定区3(CDR3)。
其他实施方案中，本发明提供与肿瘤坏死因子-α特异性结合的人源单克隆抗体，并且包括氨基酸序列为“Arg Asn Tyr Met Ser”的重链互补决定区1(CDR1)。抗体可以进一步包括氨基酸序列为“Val Ile Tyr Ser Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val LysGly”的重链互补决定区2(CDR2)，氨基酸序列为“Gly Glu GlyGly Phe Asp Tyr”的重链互补决定区3(CDR3)，以及氨基酸序列如SEQ ID NO50所示的重链氨基酸。
本发明另外的实施方案中，人源单克隆抗体可以包括氨基酸序列为“Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala”的轻链互补决定区1(CDR1)，氨基酸序列为“Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr”的轻链互补决定区2(CDR2)，氨基酸序列为“Gln Gln Tyr Asn TyrTrp Trp Thr”的轻链互补决定区3(CDR3)，以及包括如SEQ IDNO52所示的氨基酸序列的轻链氨基酸。
在另外的实施方案中，本发明包括与肿瘤坏死因子-α特异性结合的人源单克隆抗体，并且具有氨基酸序列为“Arg Ala Ser GlnSer Val Ser Ser Asn Leu Ala”的轻链互补决定区1(CDR1)，氨基酸序列为“Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr”的轻链互补决定区2(CDR2)，氨基酸序列为“Gln Gln Tyr Asn Tyr Trp Trp Thr”的轻链互补决定区3(CDR3)，氨基酸序列为“Arg Asn Tyr Met Ser”的重链互补决定区1(CDR1)，氨基酸序列为“Val Ile Tyr Ser GlyAsp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly”的重链互补决定区2(CDR2)，以及氨基酸序列为“Gly Glu Gly Gly Phe Asp Tyr”的重链互补决定区3(CDR3)。
在其他实施方案中，本发明提供与肿瘤坏死因子-α特异性结合的人源单克隆抗体，并且具有VH3-53重链基因，或其保守性变体。此处所述抗体还可以包括L2VK3轻链基因。
另外的实施方案中，本发明包括与肿瘤坏死因子-α特异性结合的人源单克隆抗体，其中所述抗体包括与典范类1相对应的重链互补决定区1(CDR1)。这里的抗体还可以包括与典范类1相对应的重链互补决定区2(CDR2)，与典范类2相对应的轻链互补决定区1(CDR1)，与典范类1相对应的轻链互补决定区2(CDR2)，以及与典范类3相对应的轻链互补决定区3(CDR3)。
本发明还提供检测患者样品中肿瘤坏死因子-α(TNFα)水平的方法，该方法包括将抗TNFα的抗体与患者的生物样品接触，检测所述样品中所述抗体与TNFα的结合水平。在更具体的实施方案中，生物样品为血液。
在另外的实施方案中，本发明提供一种组合物，该组合物包括一种抗体或其功能片段，以及可药用的载体。
本发明更进一步的实施方案包括有效治疗患有肿瘤疾病动物的方法，包括选择需要治疗肿瘤疾病的动物，向所述动物给药治疗有效剂量的与肿瘤坏死因子-α(TNFα)特异性结合的完全人源单克隆抗体。
可治疗的肿瘤疾病包括乳癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成胶质细胞瘤、胃癌、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌和前列腺癌。
本发明另外的方法涉及有效治疗免疫介导的炎性疾病。这些方法包括，选择需要治疗炎性疾病的动物，向所述动物给药治疗有效剂量的完全人源单克隆抗体，其中所述抗体与肿瘤坏死因子-α(TNFα)特异性结合。可治疗的免疫介导的炎性疾病包括类风湿性关节炎、血管球性肾炎、动脉粥样硬化、牛皮癣、再狭窄(restenosis)、自身免疫性疾病、克罗恩氏病、移植物抗宿主反应、败血症休克、恶病质、厌食、强直性脊柱炎和多发性硬化。
本发明另外的实施方案包括在动物中抑制肿瘤坏死因子-α(TNFα)诱导的凋亡的方法。这些方法包括，选择需要治疗TNFα诱导的凋亡的动物，向所述动物给药治疗有效剂量的完全人源单克隆抗体，其中所述抗体与TNFα特异性结合。
本发明另外的实施方案包括抗体在制备治疗动物肿瘤疾病药物中的用途，其中所述单克隆抗体与肿瘤坏死因子(TNFα)特异性结合。可治疗的肿瘤疾病可包括乳癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成胶质细胞瘤、胃癌、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌和前列腺癌。
本发明抗体另外的用途有制备有效治疗动物免疫介导的炎性疾病的药物，其中所述单克隆抗体与肿瘤坏死因子(TNFα)特异性结合。可治疗的免疫介导的炎性疾病包括类风湿性关节炎、血管球性肾炎、动脉粥样硬化、牛皮癣、再狭窄、自身免疫病、克罗恩氏病、移植物抗宿主反应、败血症休克、恶病质、厌食和多发性硬化。
在另外的实施方案中，此处所述抗体可以用于制备有效治疗动物中肿瘤坏死因子诱导的凋亡的药物，其中所述单克隆抗体与肿瘤坏死因子(TNFα)特异性结合。
此处所述的本发明实施方案涉及与TNFα结合并且影响TNFα功能的单克隆抗体。其他实施方案涉及完全人源抗TNFα抗体和抗TNFα抗体制剂，从治疗角度看具有如下所需性能，包括与TNFα的强结合亲和力，在体外和体内中和TNFα的能力，以及抑制TNFα诱导的凋亡的能力。
在一优选的实施方案中，此处所述抗体以很高的亲和力(Kd)与TNFα结合。例如，人、兔、鼠、嵌合的或人源化的抗体与TNFα结合的Kd值能小于，但不限于，10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13或10-14M，或者其中的任何数量级或数值。此处所述兔源抗体R014，测定的亲和力在10-13(fM)数量级内。抗体299V.1和299V.2显示的亲和力在10-13或低数值的10-12(M)数量级内。亲和力和/或亲合力量度可以使用KinExA_和/或BIACORE_测定，如本发明所述。
因此，此处所述的一个实施方案包括与TNFα结合的分离抗体，或抗体的片段。如本领域所公知的，抗体最好是例如单克隆、嵌合和/或完全人源抗体。本发明此处所述的实施方案还提供产生这些抗体的细胞。
本发明的另一实施方案是与TNFα结合的完全人源抗体，并且包括一重链氨基酸序列，该序列具有如表31-34所示序列之一的互补决定区(CDR)。需指出的是，CDR的测定可易于由本领域的普通技术人员实现。例如参见，Kabat等，Seq uences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242，马里兰州贝赛斯达 ，第1～3卷。
而另一实施方案是与TNFα结合的抗体，并且包括一轻链氨基酸序列，该序列具有包括如表32和34所示序列之一的CDR。在某些实施方案中，抗体为完全人源单克隆抗体。
再一实施方案是与TNFα结合的抗体，并且包括一重链氨基酸序列，该序列具有如表31和33所示的序列之一；同时包括一轻链氨基酸序列，该序列具有如表32和34所示的CDR序列之一。在某些实施方案中，抗体为完全人源单克隆抗体。
本发明的另一实施方案是与TNFα的其他家族成员，包括但不限于TNFβ，结合的完全人源抗体。再一实施方案是与本发明的完全人源抗体交叉竞争结合TNFα的抗体。
应该理解的是，本发明的实施方案不限于任何具体形式的抗体或者产生或生产方法。例如，抗TNFα抗体可以是全长抗体(比如，具有完好的人源Fc区)或者一个抗体片段(例如，Fab，Fab’或F(ab’)2)。另外，抗体可以由分泌此抗体的杂交瘤生产，或者由编码此抗体的单基因或多基因转化或转染的重组生成的细胞生产。
本发明的其他实施方案包括编码任何本文所述抗体的分离核酸分子，具有编码抗TNFα抗体的分离核酸分子的载体，或经任何此类核酸分子转化的宿主细胞。另外，本发明的一实施方案是通过在一定条件下培养宿主细胞来生产抗TNFα抗体的方法，此条件下核酸分子表达以产生抗体，然后回收此抗体。
再一实施方案包括通过使用人源TNFα或其片段，以及一个或多个直向同源序列或其片段使哺乳动物产生免疫，从而生产高亲和力抗体的方法。
其他实施方案是基于与TNFα特异性结合的分离抗体的产生和识别。TNFα在肿瘤性疾病中表达水平提高，比如在肿瘤和其他炎性疾病中。抑制TNFα的生物活性可以防止发炎和其他预期效应，包括TNFα诱导的凋亡。
本发明另一实施方案包括利用本文所述方法制备的抗体检测患者样品中TNFα水平来诊断疾病或病症的方法。在一实施方案中，患者样品为血液或血清。另外的实施方案中，提供了识别危险因子、诊断疾病和判断病期的方法，该方法涉及使用抗TNFα抗体识别TNFα的过量表达。
本发明的另一实施方案包括诊断细胞中与TNFα表达相关的病症的方法，具体先将细胞与抗TNFα的抗体接触，然后检测TNFα的存在。优选的疾病包括但不限于肿瘤性疾病，其包括但不限于肿瘤、癌症，比如乳癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、直肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌和膀胱癌。在另一实施方案中，抗TNFα的抗体可以用于诊断炎性疾病，包括但不限于动脉粥样硬化、再狭窄、自身免疫性疾病，免疫介导的炎性疾病(IMID)，包括但不限于类风湿性关节炎、牛皮癣、葡萄膜炎(例如儿童和血清阴性)、狼疮，以及由免疫复合物介导的其他疾病，比如天疱疮和肾小球肾炎、先天性甲状腺功能亢进(CH)、迟发型过敏反应(DTH)比如接触性过敏、肉样瘤病、贝堤特氏病、慢性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、成人史提尔氏病、原发性干燥症、硬皮病、巨细胞动脉炎、SAPHO综合症、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、肉样瘤病、骨髓发育不良症候群、Wegener综合症和其他血管炎、血液肿瘤、耳蜗前庭紊乱、巨噬细胞活化综合症、哮喘、间质性肺疾病、丙型肝炎、肺纤维症、诱导排卵、骨髓发育不良症候群、克罗恩氏病、移植物抗宿主反应、败血症休克、恶病质、厌食和多发性硬化。抗体可以诊断的其他疾病公开在颁给Salfeld等的美国专利6,090,382，颁给Barbanti等的美国专利5,436,154中。
在另一实施方案中，本发明包括一化验试剂盒，用来在哺乳动物组织或细胞中检测TNFα或TNFα家族成员以识别肿瘤疾病或炎性疾病。试剂盒包括可与TNFα结合的抗体，以及显示抗体与TNFα反应的装置，如果有TNFα存在的话。抗体优选单克隆抗体。在一实施方案中，与TNFα结合的抗体被标记。在另一实施方案中，抗体为未标记的一次抗体，试剂盒还包括检测此一次抗体的装置。在一实施方案中，此装置包括标记的二次抗体，即抗免疫球蛋白。抗体优选使用选自荧光染料、酶、放射性核素和不透辐射材料的标记物进行标记。
本发明的其他实施方案包括药物组合物，该组合物含有与可药用的载体或稀释剂混合的有效量的抗TNFα的抗体。在另一实施方案中，抗TNFα的抗体或其片段与治疗剂结合。治疗剂可以是，例如，一种毒素或一种放射性同位素。这些抗体优选用于治疗的疾病，包括例如肿瘤、癌症，比如乳癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、直肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌和膀胱癌，还有其他炎性疾病，包括但不限于动脉粥样硬化、再狭窄、自身免疫性疾病，免疫介导的炎性疾病(IMID)，包括但不限于类风湿性关节炎、牛皮癣、葡萄膜炎(例如儿童和血清阴性)、狼疮，以及由免疫复合物介导的其他疾病，比如天疱疮和肾小球肾炎、先天性甲状腺功能亢进(CH)、迟发型过敏反应(DTH)比如接触性过敏、肉样瘤病、贝堤特氏病、慢性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、成人史提尔氏病、原发性干燥症、硬皮病、巨细胞动脉炎、SAPHO综合症、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、肉样瘤病、骨髓发育不良症候群、Wegener综合症和其他血管炎、血液肿瘤、耳蜗前庭紊乱、巨噬细胞活化综合症、哮喘、间质性肺疾病、丙型肝炎、肺纤维症、诱导排卵、骨髓发育不良症候群、克罗恩氏病、移植物抗宿主反应、败血症休克、恶病质、厌食和多发性硬化。抗体可以治疗的其他疾病公开在颁给Salfeld等的美国专利6,090,382，颁给Barbanti等的美国专利5,436,154中。
另一实施方案包括通过向患者给药有效量的抗TNFα的抗体，治疗患者与TNFα表达有关的疾病或病症的方法。该方法可在体内进行，患者优选为人类患者。在优选的实施方案中，该方法涉及治疗肿瘤、癌症，比如乳癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、直肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌和膀胱癌。其他实施方案中，炎性疾病包括但不限于动脉粥样硬化、再狭窄、自身免疫性疾病，免疫介导的炎症性疾病(IMID)，包括但不限于类风湿性关节炎、牛皮癣、葡萄膜炎(例如儿童和血清阴性)、狼疮，以及由免疫复合物介导的其他疾病，比如天疱疮和肾小球肾炎、先天性甲状腺功能亢进(CH)、迟发型过敏反应(DTH)比如接触性过敏、肉样瘤病、贝堤特氏病、慢性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、成人史提尔氏病、原发性干燥症、硬皮病、巨细胞动脉炎、SAPHO综合症、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、肉样瘤病、骨髓发育不良症候群、Wegener综合症和其他血管炎、血液肿瘤、耳蜗前庭紊乱、巨噬细胞活化综合症、哮喘、间质性肺疾病、丙型肝炎、肺纤维症、诱导排卵、骨髓发育不良症候群、克罗恩氏病、移植物抗宿主反应、败血症休克、恶病质、厌食和多发性硬化。抗体可以治疗的其他疾病公开在颁给Salfeld等的美国专利6,090,382，颁给Barbanti等的美国专利5,436,154中。
在另一实施方案中，本发明提供一件产品，其中包括一个容器。该容器包括含有抗TNFα的抗体的组合物，以及药品说明书或标签，用以说明该组合物可用于治疗以TNFα的过量表达为特征的肿瘤疾病或炎性疾病。
在一些实施方案中，向患者给药抗TNFα的抗体后，再给药清除剂(clearing agent)以除去血液中过量的循环抗体。
在一些实施方案中，可以修饰抗TNFα的抗体以提高其固定补体和参与补体依赖的细胞毒性(CDC)的能力。在一实施方案中，可以通过例如氨基酸替换，修饰抗TNFα的抗体，以改变从身体中的清除效果。还有，另一些的氨基酸替换可以减慢抗体从身体中的清除。
另一实施方案是抗TNFα的抗体在制备治疗疾病，比如肿瘤疾病和炎性疾病的药物中的用途。在一实施方案中，肿瘤性疾病包括肿瘤和癌症，比如乳癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、直肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌和膀胱癌。在另一实施方案中，炎性疾病包括但不限于动脉粥样硬化、再狭窄、自体免疫性疾病，免疫介导的炎性疾病(IMID)，包括但不限于类风湿性关节炎、牛皮癣、葡萄膜炎(例如儿童和血清阴性)、狼疮，以及由免疫复合物介导的其他疾病，比如天疱疮和肾小球肾炎、先天性甲状腺功能亢进(CH)、迟发型过敏反应(DTH)比如接触性过敏、肉样瘤病、贝堤特氏病、慢性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、成人史提尔氏病、原发性干燥症、硬皮病、巨细胞动脉炎、SAPHO综合症、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、肉样瘤病、骨髓发育不良症候群、Wegener综合症和其他血管炎、血液肿瘤、耳蜗前庭紊乱、巨噬细胞活化综合症、哮喘、间质性肺疾病、丙型肝炎、肺纤维症、诱导排卵、骨髓发育不良症候群、克罗恩氏病、移植物抗宿主反应、败血症休克、恶病质、厌食和多发性硬化。抗体可以治疗的其他疾病公开在颁给Salfeld等的美国专利6,090,382，颁给Barbanti等的美国专利5,436,154中。


图1的柱状图说明了在人类WM266细胞中，由不同杂交瘤来源的人源抗TNFα结合抗体中和TNFα诱导的细胞凋亡的效果。该图使用半胱氨酸蛋白酶(caspase)活性作为TNFα诱导的凋亡的量度。
图2的散点图比较了一定浓度范围内B细胞培养上清液中的抗体和对照抗体(4.17IgG2)与抗TNFα限制性抗原结合的能力。三角形代表B细胞培养上清液克隆，方块代表Bar抗体(4.17IgG2)。对应点在Bar抗体曲线之上的B细胞培养上清液克隆被归作具有潜在高亲和力的一类。
图3是在人类MCF-7细胞中，对不同XENOMAX_B细胞培养上清液抑制TNFα诱导的细胞凋亡的效率进行比较的代表性柱状图。
图4所示的代表性散点图对人类MCF-7细胞上，XENOMAX_B细胞培养上清液中和TNFα诱导的凋亡的计算效能进行了比较。三角形代表B细胞培养上清液的效能，而方块代表Bar对照抗体3.2IgG2的效能。
图5是使用ELISA法将抗TNF试剂与大肠杆菌表达的可溶性人源TNF结合的线状图。
图6是使用ELISA法将抗TNF试剂与大肠杆菌表达的可溶性猕猴TNF结合和交叉反应的线状图。
图7所示的代表性线状图表示用来计算IC50值的中和抗TNFα抗体的滴定曲线的一个实例。抗TNFα试剂与100pg/ml TNFα在37℃下预温育1小时。中和作用使用MCF-7细胞进行，并且作为碘化丙锭和Heochst 33342染色的比例探测。
图8所述的代表线状图表示用来计算IC50值的中和抗TNFα试剂的滴定曲线的一个实例。抗TNFα抗体与100pg/ml TNFα在37℃下预温育18小时。中和作用使用MCF-7细胞进行，并且作为碘化丙锭和Heochst 33342染色的比例探测。
图9是显示抗TNFα中和的IC50平均值的柱状图。中和和IC50值的计算按照图8的说明进行。
图10是显示抗TNFα中和的IC50平均值的柱状图。中和实验在人类WM266细胞上进行，测定半胱氨酸蛋白酶活性作为TNFα诱导的凋亡的量度。抗体IC50值的计算按照图7的说明进行。
图11是使用ELISA法测量的抑制TNF诱导的IL-8的全血检测的线状图。滴定曲线用来计算IC50值。
图12是使用抗TNF试剂对TNFα诱导的肝衰竭的体内抑制作用的代表性线状图。通过测定血清酶丙氨酸转氨酶(ALT)的活性来确定TNFα和D-GalN诱导的肝损伤的程度。滴定曲线用来计算IC50值。
图13是使用抗TNF试剂对TNFα诱导的IL-6的体内抑制作用的代表性线状图，由ELISA法测定。滴定曲线用来计算IC50值。
具体实施例方式
本文所述发明的实施方案涉及与TNFα结合的单克隆抗体。在某些实施方案中，抗体与TNFα结合并且影响TNFα的功能。另外的实施方案提供完全人源抗TNFα抗体和抗TNFα抗体制品，该制品从治疗角度看具有如下所需性能，包括与TNFα的强结合亲和力，在体外中和TNFα的能力，在体内抑制TNFα诱导的肝损伤的能力，以及在体内抑制TNFα诱导产生IL-6的能力。
因此，本发明的实施方案包括与TNFα结合的分离抗体，或这些抗体的片段。如本领域所公知的，抗体最好是完全人源单克隆抗体。本发明的实施方案还提供了可产生这些抗体的细胞。
另外，本发明的实施方案提供利用这些抗体作为诊断工具或用于治疗疾病。例如，本发明的实施方案提供抑制TNFα表达的方法和抗体，所述TNFα表达与下列疾病有关传染病、免疫紊乱、自身免疫病、移植物抗宿主疾病(GVHD)、瘤形成、癌症有关的恶病质、革兰氏阴性败血症、内毒素性休克、克罗恩氏病和类风湿性关节炎。抗体优选用于治疗癌症，比如乳癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、直肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌和膀胱癌，还有其他炎性疾病，包括但不限于类风湿性关节炎、肾小球性肾炎、动脉粥样硬化、牛皮癣、器官移植、再狭窄和自身免疫病。与此治疗相关，提供了包括本文所述抗体在内的数种产品。另外，还提供了具有本文所述抗体的化验试剂盒，以识别肿瘤和炎性疾病。
另外，本文所述核酸、其片段和其变体可以用于，例如，非限制性的实例有，(a)指导作为重组或异源基因产物合成的相应编码的蛋白质、多肽、片段和变体的生物合成，(b)作为检测和定量本文公开的核酸的探针，(c)作为制备反义(antisense)分子等的序列模板。这些用途将在下文中详细叙述。
而且，本文所述蛋白质和多肽，及其片段和变体，可以用于如下方式包括，(a)用作免疫原以激发抗TNFα抗体的产生，(b)在所述抗体的免疫原性检测中用作捕捉抗原(capture antigen)，(c)作为筛选可以与本文所述的TNFα多肽结合的物质的靶，以及(d)用作TNFα特异性抗体的靶，使得用此抗体进行治疗可影响由所述靶介导的分子和/或细胞的功能。
与抗TNFα抗体有关的更多实施方案、特性等将在下面详细说明。
序列表典型的人源抗TNFα抗体的重链和轻链可变区核苷酸和氨基酸序列在序列表中提供，其内容总结在表1中。
表1









定义除非另有定义，本文所使用的科技术语的含义与本领域的普通技术人员通常理解的含义相同。另外，除非上下文另有要求，单数形式的术语包括其复数，复数形式的术语也包括其单数。一般地，本文所述细胞和组织培养、分子生物学、蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学，以及杂交有关的术语和技术，都是本技术领域公知的和通常使用的。重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养和转化(例如电穿孔、脂转染(lipofection))均使用标准技术。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书或本领域常规方法或本文所述的进行操作。上述技术和方法一般按照本领域所公知的，以及本说明书通篇引用和讨论的多篇一般和具体文献中记载的常规方法进行操作。参见例如Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))。本文记载的分析化学、有机合成化学、药物化学和制药化学有关的术语、实验室方法和技术均为本领域公知的和通常使用的。化学合成、化学分析、药品的制备、配方和递送以及患者治疗均使用标准技术。
根据本公开文本所使用的下列术语，除非另有说明，按照以下意思理解术语“TNFα”指细胞因子，肿瘤坏死因子-α(Pennica，D等，1984，Nature 312724-729)。本领域中，TNFα也被称为恶液质素(cachectin)。
当涉及抗体时，术语“中和”是指抗体消除或显著减少它所结合的靶抗原的效应物功能的能力。因此，“中和”抗TNFα的抗体能够消除或显著减少效应物功能，比如TNFα的活性。
本文使用的术语“分离多核苷酸”是指基因组、cDNA或合成源的多核苷酸，或其某种组合，依据其来源，“分离多核苷酸”(1)与“分离多核苷酸”天然存在于其中的另一个多核苷酸的全部或部分没有关联，(2)有效连接到与其无天然连接的另一多核苷酸，或者(3)不作为较大序列的一部分天然存在。
本文使用的术语“分离蛋白质”是指cDNA、重组RNA或合成来源的，或其某种形式的组合的蛋白质，依据其来源或起源，“分离蛋白质”(1)不与自然界中发现的蛋白质有关联，(2)不含有相同来源的其他蛋白质，如不含有鼠蛋白(murine protein)，(3)在另一不同物种的细胞中表达，或(4)在自然界中不存在。
本文使用的“多肽”作为一个通用术语，是指天然蛋白、片段或多肽序列的类似物。所以，天然蛋白、片段和类似物是多肽属的几种。根据本发明，优选的多肽包括人源重链免疫球蛋白分子和人源κ轻链免疫球蛋白分子，以及由包括重链免疫球蛋白分子，轻链免疫球蛋白分子，如κ轻链免疫球蛋白分子(反之亦然)，以及其片段和类似物相结合形成的抗体分子。
本文提到某对象时使用的术语“天然存在”是指该对象可以在自然界中发现的事实。例如，一段多肽或多核苷酸序列，存在于生物有机体(包括病毒)中，可以从天然源中分离，并且没有在实验室中经过人类或某他途径有意地修饰，这样的多肽或多核苷酸序列就是天然存在的。
本文使用的术语“有效连接”是指所述各元件的位置关系，可使它们以预期方式发挥功能。例如，一段控制序列“有效连接”到一段编码序列，其连接方式可以在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
本文使用的术语“控制序列”是指影响与之相连的编码序列的表达和加工所必须的多核苷酸序列。控制序列的性质因宿主有机体的不同而不同；原核生物中，控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；真核生物中，控制序列一般包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在至少包括其存在对表达和加工起重要作用的所有元件，并且还可以包括其存在是有益的附加元件，例如，前导序列和融合配偶体序列(fusion partner sequence)。
本文使用的术语“多核苷酸”是指长度为至少10个碱基的多聚体形式的核苷酸，它可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或修饰形式的所述两种核苷酸中的任一种。该术语包括单链和双链形式的DNA。
本文使用的术语“寡核苷酸”包括由天然存在的和非天然存在的寡核苷酸键连接起来的天然存在的和经过修饰的核苷酸。寡核苷酸是多核苷酸的亚组(subset)，通常包括不超过200个碱基的长度。寡核苷酸优选为10到60个碱基长度，最优选12、13、14、15、16、17、18、19、或20到40个碱基长度。寡核苷酸通常为单链，如用于探针；但寡核苷酸也可以为双链，如用于构建基因突变体。寡核苷酸可以为正义或反义寡核苷酸。
本文使用的术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文使用的术语“经过修饰的核苷酸”包括具有修饰或替代的糖基的核苷酸等。本文使用的术语“寡核苷酸键”包括如下寡核苷酸键，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoraniladate、磷酰胺酯(phosphoroamidate)等。参见例如，LaPlanche等Nucl.Acids Res.149081(1986)；Stec等，J.Am.Chem.Soc.1066077(1984)；Stein等Nucl.Acids Res.163209(1988)；Zon等Anti-Cancer Drug Design6539(1991)；Zon等Oligonucleotides and AnaloguesA PracticalApproach，87-108页(F.Eckstein编辑，Oxford University Press，英国牛津市(1991))；Stec等的美国专利5,151,510；Uhlmann和PeymanChemical Reviews 90543(1990)。如果需要，寡核苷酸可以包括检测标记。
本文使用的术语“选择性杂交”是指可检测到的特异性结合。多核苷酸、寡核苷酸和其片段与核酸链选择性杂交，其杂交和洗涤的条件应使可检测到的与非特异性核酸结合的可测量的量达到最小。如本领域所公知和本文所讨论的，可使用非常严格的条件获得选择性杂交的条件。一般地，多核苷酸、寡核苷酸、或抗体片段和所研究的核酸序列之间的核酸序列的同源性(homology)为至少80％，更一般地，优选将同源性提高到至少85％，90％，95％，99％和100％。
如果两段氨基酸序列部分或完全相同，那么它们是“同源的”。例如85％同源性表示当两段序列以最大匹配的方式比对时，有85％的氨基酸是相同的。最大匹配时允许存在间隔(匹配的两段序列中任一段上)；间隔长度优选5或更小，更优选2或更小。另一种优选情形，两条蛋白序列(或来源于蛋白的至少大约30氨基酸长度的多肽序列)使用带有突变数据矩阵、间隔罚分设置值等于或大于6的程序ALIGN时，如果它们的比对分数大于5(标准差单元)，本文中称之为同源。参见Dayhoff，M.O.，Atlas of Protein Sequenceand Structure，101-110页(第5卷，National Biomedical ResearchFoundation(1972))和该卷的增补本2，1-10页。当使用ALIGN程序对两段序列或其部分进行最优比对时，如果它们的氨基酸有多于或等于50％相同时，它们即为更优选的同源。
本文使用的术语“相应的”表示一段多核苷酸序列与基准多核苷酸序列的全部或部分同源(即相同，但没有严格的进化关系)，或者一段多肽序列与基准多肽序列相同。
与之不同的是，本文使用术语“互补的”表示其互补序列与基准多核苷酸序列的全部或部分同源。举例说明，核苷酸序列“TATAC”与基准序列“TATAC”相应，与基准序列“GTATA”互补。
下列术语用于描述两条或多条多核苷酸或氨基酸序列之间的序列关系“基准序列”“对比窗(comparison window)”“序列相同(sequence identity)”“序列相同百分率(percentage ofsequence identity)”和“基本相同(substantial identity)”。“基准序列”是用作序列比较基础的规定序列。基准序列可以是较长序列的亚组，比如序列表中所示全长cDNA或基因序列的片段，或者可以包括完整的cDNA或基因序列。一般地，基准序列至少在18核苷酸或6氨基酸长度，经常至少24核苷酸或8氨基酸长度，更经常至少48核苷酸或16氨基酸长度。既然两段多核苷酸或氨基酸序列中的各段都可以(1)包括一段在所述两分子之间相似的序列(即完整多核苷酸或氨基酸序列的一部分)，并且(2)还包括一段在两段多核苷酸或氨基酸序列之间不同的序列，两(或多)个分子之间的序列比较一般通过在“对比窗”内比较所述两个分子的序列进行，以便识别和比较部分区域的序列相似性。本文使用的“对比窗”是指至少大约18个连续的核苷酸或大约6个氨基酸这一概念上的片段，其中多核苷酸序列或氨基酸序列与基准序列上的至少大约18个连续的核苷酸或6个氨基酸序列相比较，并且其中与基准序列(它不包括插入或缺失)比较，多核苷酸序列在对比窗中的部分可以包括20％或更少的插入、缺失、替换等(如间隔)以使两段序列最优比对。用于与对比窗比对的序列的最优比对可以使用以下算法进行局部同源算法(local homology algorithm)，Smith和WatermanAdv.Appl.Math.2482(1981)，同源比对算法(homology alignmentalgorithm)，Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48443(1970)，寻求相似性方法(search for similarity method)，Pearson和LipmanProc.Natl.Acad.Sci.(美国)852444(1988)，这些算法的计算机实现(Wisconsin Genetics软件包版本7.0中的GAP、BEST FIT、FASTA和TFASTA，(Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)，GENEWORKSTM，或MACVECTOR_软件包)，或者人工比对(by inspection)，然后选择通过以上方法产生的最优比对(即在对比窗中产生最高同源百分率)。
术语“序列相同”是指两段多核苷酸或氨基酸序列在对比窗内相同(即基于单个核苷酸或单个氨基酸残基顺次比较)。术语“序列相同百分率”按照如下方法计算在对比窗内比较两段最优比对的序列，确定两段序列中出现相同的核酸碱基(如A、T、C、G、U或I)或氨基酸残基的位置的数量，得出匹配位置数，匹配位置数除以对比窗的总位置数(即对比窗的大小)，结果再乘以100即得到序列相同百分率。本文使用的术语“基本相同”表示多核苷酸或氨基酸序列的一种特性，其中多核苷酸或氨基酸包括一段至少85％序列相同的序列，优选至少90～95％序列相同，更优选至少99％序列相同，以上结果是在对比窗内至少18个核苷酸(6氨基酸)位置上，更经常至少24～48个核苷酸(8～16氨基酸)位置上与基准序列比较得出的，其中序列相同百分率是通过在对比窗内比较基准序列与某一序列计算得到的，该序列可以包括总计为基准序列的20％或以下的缺失或插入。基准序列可以是更长序列的亚组。
本文引用的20种常规氨基酸及其缩写遵循常规使用方式。参见Immunology--A Synthesis(第二版，E.S.Golub和D.R.Gren编辑，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))。20种常规氨基酸的立体异构体(如D-氨基酸)，非天然氨基酸如α-，α-双取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸，以及其他非常规氨基酸也可以是本发明的多肽的适宜组分。非常规氨基酸的例子包括4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸，以及其他类似氨基酸和亚氨基酸(如4-羟基脯氨酸)。本文所用的多肽表示方法中，左手方向为氨基末端方向，右手方向为羧基末端方向，与标准用法和惯例一致。
类似地，除非另有说明，单链多核苷酸序列的左手端为5′端；双链多核苷酸序列的左手方向为5′方向。新生RNA转录物5′到3′延伸的方向为转录方向；DNA链上序列和RNA相同，且在RNA转录物5′端5′的序列区称作“上游序列”；DNA链上序列和RNA相同的，且在RNA转录物3′端3′的序列区称作“下游序列”。
当涉及多肽时，术语“基本相同”是指两段多肽序列，当它们最优比对时，比如使用GAP或BESTFIT程序以默认间隔权重比对时，共有至少80％的序列相同，优选至少90％的序列相同，更优选至少95％的序列相同，最优选至少99％的序列相同。优选地，不相同的残基位置是由于保守性氨基酸替换引起的。保守性氨基酸替换是指侧链相似的残基之间的可替换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香侧链的一组氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸为半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守性氨基酸替换组为缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
如本文所讨论，抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中微小变异被认为包含在本发明之内，只要氨基酸序列的变异同本文所述的抗体或免疫球蛋白分子相比，保持至少75％序列相同，更优选至少80％、90％、95％，最优选99％序列相同。特别地，考虑保守性氨基酸替换。保守性替换是发生在具有相关侧链的同一氨基酸家族内的替换。正常编码的氨基酸一般分为以下几个家族(1)酸性＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)无极性＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；以及(4)无电荷极性＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优选的家族为丝氨酸与苏氨酸为脂肪族-羟基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺为含酰胺家族；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸为脂肪家族；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸为芳香家族。例如有理由相信，亮氨酸同异亮氨酸或缬氨酸、天冬氨酸同谷氨酸、苏氨酸同丝氨酸的单独替换，或者氨基酸同其结构相近的氨基酸的类似替换不会对所生成分子的结合功能或性质有较大影响，特别是替换没有涉及到框架位点内的氨基酸时。氨基酸改变是否产生功能性肽，可易于通过测试多肽衍生物的特异活性检测。本文对检测方法作详细描述。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可易于由本领域的普通技术人员制备。优选地，片段或类似物的氨基和羧基末端位于功能区的近边界处。可以通过比较公共或专有序列数据库中的核苷酸和/或氨基酸序列数据来识别结构和功能区域。优选地，使用计算机比较法来识别存在于结构和/或功能已知的其他蛋白中的序列基序(sequence motif)或预测的蛋白构象区域。识别出折叠成已知三维结构的蛋白序列的方法已经公知。Bowie等Science 253164(1991)。所以，以上例子说明，本领域技术人员可以识别用于确定与本文所述抗体一致的结构和功能区域的序列基序和结构构象。
优选的氨基酸替换是能够(1)降低蛋白分解敏感性，(2)降低氧化敏感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，以及(4)赋予或改变其类似物其他物理化学或功能性质的替换。类似物可以包括序列不同于天然存在的肽序列的各种突变蛋白质。例如，单个或多个氨基酸替换(优选保守性氨基酸替换)可以发生于天然存在的序列(优选在形成分子间接触的区域之外的多肽部分)中。保守性氨基酸替换应该基本不改变亲代序列(parentsequence)的结构特性(例如，替换氨基酸应该不会破坏亲代序列中存在的螺旋，或破坏亲代序列特征性的其他类型的二级结构)。本领域已识别的多肽二级和三级结构的例子记载在Proteins，Structuresand Molecular Principles(Creighton编辑，W.H.Freeman andCompany，纽约(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze编辑，Garland Publishing，纽约州纽约市(1991))；和Thornton等Nature 354105(1991)。
本文使用的术语“多肽片段”是指一段多肽，其氨基末端和/或羧基末端缺失，但其余氨基酸序列同起源于，例如，全长cDNA序列的天然存在的序列中的相应位置相同。片段通常有至少5、6、8或10氨基酸长度，优选至少14氨基酸长度，更优选至少20氨基酸长度，通常至少50氨基酸长度，以及更优选至少70氨基酸长度。本文使用的术语“类似物”是指包括至少25个氨基酸片段的多肽，其与导出(deduced)的氨基酸序列的一部分基本相同，并且至少具备下列性质之一(1)在适宜的结合条件下，与TNFα特异结合，(2)阻止与TNFα正确结合的能力，或(3)抑制TNFα活性的能力。通常，相对于天然存在的序列，多肽类似物包含保守性氨基酸替换(或插入或缺失)。类似物通常为至少20氨基酸长度，优选至少50氨基酸长度或更长，并且经常可与全长的天然存在的多肽长度相等。
肽类似物通常作为与其模板肽有相似性质的非肽药物在制药工业上使用。这些类型的非肽化合物被称为“肽模仿剂(peptide mimetics)”或“拟肽物(peptidomimetics)”。Fauchere，J.Adv.Drug Res.1529(1986)；Veber和Freidinger TINS 392页(1985)；和Evans等J.Med.Chem.301229(1987)。这些化合物通常借助计算机化的分子模型开发。与治疗有效的肽结构相似的肽模仿剂可用于产生等效的治疗或预防效果。一般地，拟肽物在结构上与范例多肽(paradigm polypeptide，即具有生化性质或药理活性的多肽)，例如人源抗体相似，但其一个或多个肽键可任选地由下列键替换，所述键选自--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH＝CH--(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和-CH2SO--，使用的方法已为本领域所公知。可以使用同型D-氨基酸系统地替换共同序列中一个或多个氨基酸(如D-赖氨酸代替L-赖氨酸)以生产更稳定的肽。另外，包含共同序列或基本相同的共同序列变异体的约束肽(constrained peptide)也可用本领域公知方法合成(Rizo和Gierasch Ann.Rev.Biochem.61387(1992))；例如，加入内半胱氨酸残基能够形成分子内二硫桥键，可使肽环化。
“抗体”或“抗体肽”是指完整的抗体，或与完整的抗体竞争特异结合的其结合片段。结合片段通过重组DNA技术，或通过酶或化学方法切割完整的抗体产生。结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和单链抗体。除了“双特异性”或“双功能”抗体外的抗体可理解为其各结合位点相同。过量的抗体使与反受体结合的受体数量减少至少大约20％、40％、60％或80％，更经常地在85％以上(根据体外竞争结合测试所得数据)时，抗体显著地抑制受体与反受体的结合。
术语“表位(epitope)”包括任何可与免疫球蛋白或T细胞受体特异结合的蛋白决定簇。表位决定簇通常由具有化学活性的分子表面基团组成，如氨基酸或糖基侧链，并且通常具有特异的三维结构特性，以及特异的电荷特性。当离解常数≤1μM，优选≤100nM，最优选≤10nM时，就可以说，抗体与抗原特异结合。
本文使用的术语“试剂”是指化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子、或生物材料制成的提取物。
有关TNFα多肽的“活性的”或“活性”是指具有天然TNFα多肽的生物或免疫活性的TNFα多肽部分。此处使用的“生物的”是指由天然TNFα多肽的活性引起的生物功能。优选的TNFα生物活性包括，例如，TNFα诱导的凋亡。
本文所述的“哺乳动物”为可以看作哺乳动物的任何动物。优选地，哺乳动物为人类。
使用酶，即木瓜蛋白酶(papain)消化抗体，可产生两相同的抗原结合片段即“Fab”片段，以及无抗原结合活性但可以结晶的“Fc”片段。使用酶，即胃蛋白酶消化抗体，会产生F(ab’)2片段，该片段中抗体分子的两臂保持相连，并且包括双抗原(two-antigen)结合位点。F(ab’)2片段可与抗原交联。
本文使用的“Fv”是指同时保留抗原识别和抗原结合位点的抗体的最小片段。
本文使用的“Fab”是指包含轻链恒定区和重链CH1区的抗体片段。
术语“mAb”是指单克隆抗体。
描述XENOMAX_抗体序列时采用如下方式编码“AB”指抗体，“TNFα”指抗体的结合特异性，“X”是指源自XENOMOUSE_，“G1”是指IgG1同种型或者“G2”是指IgG2同种型，最后三位数字是指抗体来源的单细胞编号，例如AB-TNFα-XG1-015。
术语“SC”是指单细胞，一个特定的源自XENOMAX_的抗体可表示为SC后跟三位数字，或者只有三位数字，表示抗体来源的单细胞编号。
描述杂交瘤细胞来源的抗体序列时采用如下方式编码“AB”指抗体，“TNFα”指抗体的结合特异性，“X”是指源自XENOMOUSE_，“G1”是指IgG1同种型或者“G2”是指IgG2同种型，“K”是指κ，“L”是指λ。最后三位数字是指抗体来源的克隆，例如AB-TNFα-XG2K-4.17。
本文使用的“脂质体”是指有助于递送药物的微小泡囊，所述药物可以包括本发明的TNFα多肽，或者哺乳动物的此TNFα多肽的抗体。
本文使用的“标记”或“标记的”是指为多肽添加可检测部分，例如，放射性同位素示踪、荧光标记、酶标记、化学发光标记或者生物素标记。放射性同位素或者放射性核素可以包括3H、14C，15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I，荧光标记可以包括罗丹明(rhodamine)、镧系荧光物质(lanthanide phosphor)或者FITC，酶标记可以包括辣根过氧物酶(horseradish peroxidase)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、萤光酶(luciferase)、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)。
本文使用的术语“治疗药剂或药物”是指正确给药至患者时产生所需治疗效果的化学化合物或组合物。本文使用的其他化学术语与本领域的常规用法一致，示例可以参见The McGraw-Hill Dictionary ofChemical Terms(Parker，S.编辑，McGraw-Hill，圣弗朗西斯科(1985))。
本文使用的“基本纯净”是指目标种类为存在的主要种类(即，以摩尔数计，它在组合物中的含量比其他任何一种都多)，优选地，基本纯化的组分是指其中目标种类占所存在的全部大分子种类的至少约50％(以摩尔数计)的组合物。一般地，基本纯净的组合物应占组合物中所存在的全部大分子种类的约80％以上，更优选85％、90％、95％、以及99％以上。最优选地，目标种类纯化到基本同质的程度(使用常规检测方法在组合物中检测不到杂质类)，此时组合物主要由单一大分子种类组成。
术语“患者”包括人类和兽类个体。
术语“SLAM_”是指“选择性淋巴细胞抗体方法(SelectedLymphocyte Antibody Method)”(Babcook等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，i937843-7848(1996)，和Schrader，美国专利5,627,052)。
术语“XENOMAX_”是指用于XENOMOUSE_动物时，使用“选择性淋巴细胞抗体方法”(Babcook等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，i937843-7848(1996))。
抗体结构已知基本的抗体结构单元包括一个四聚体。各四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(大约25kDa)和一条“重”链(大约50-70kDa)。各链的氨基末端部分包括由大约100到110或更多氨基酸组成的可变区，主要负责抗体识别。各链的羧基末端部分形成恒定区，主要负责效应物功能。来自人类的轻链可分为κ和λ轻链。重链可分为μ、δ、γ、α或ε，分别定义抗体的同种型IgM、IgD、IgA和IgE。在轻链和重链内部，可变区和恒定区由约12或更多氨基酸组成的“J”区连接，重链还包括约10或更多氨基酸组成的“D”区。大体参见，Fundamental Immunology第7章(Paul，W.编辑，第2版.Raven Press，纽约(1989)).各轻/重链对的可变区形成抗体的结合位点。
所以，完整的抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中之外，这两个结合位点是相同的。
所有链均显示出大体相同的结构，即相对保守的骨架区(FR)连接三个高变区，后者也被称为互补决定区或CDR。各对两条链上的CDR沿骨架区排列，使之可与特异表位结合。从N-末端到C-末端，轻链和重链都包括区域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。氨基酸在各区域上的分配与下列文献中的定义一致KabatSequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutesof Health，马里兰州贝赛斯达(1987 and 1991))，或Chothia & Lesk J.Mol.Biol.196901-917(1987)；Chothia等Nature 342878-883(1989)。
双特异性或双功能抗体是人工杂化的抗体，具有两不同的重/轻链对和两个不同的结合位点。双特异性抗体可通过多种方法制备，包括杂交瘤细胞的融合或Fab’片段的连接。参见，例如，Songsivilai & Lachmann Clin.Exp.Immunol.79315-321(1990)，Kostelny等J.Immunol.1481547-1553(1992)。相对于制备常规抗体，制备双特异性抗体的劳动强度更大，并且产量和纯度一般较低。只有单一结合位点的片段形式(如Fab，Fab’和Fv)中不存在双特异性抗体。
人源抗体和抗体的人源化人源抗体避免了与具有鼠源或大鼠源可变区和/或恒定区的抗体相关的一些问题。鼠源或大鼠源蛋白的存在导致抗体迅速清除，或使患者产生针对抗体的免疫应答。为了避免使用鼠源或大鼠源抗体，可将人源抗体功能引入啮齿动物中，使啮齿动物体产生完全人源抗体，以此即可获得完全人源抗体。
产生完全人源抗体的方法之一是使用小鼠XENOMOUSE_品系，其已被改造成包含245kb和190kb大小的人源重链基因座和κ轻链基因座的胚系结构片段。参见Green等Nature Genetics 713-21(1994)。XENOMOUSE_品系可从Abgenix，Inc.(Fremont，加利福尼亚州)获得。
XENOMOUSE_的生产在以下文献中有进一步的讨论和描述以下美国专利申请，包括1990年1月12日提交的No.07/466,008、1990年11月8日提交的No.07/610,515、1992年7月24日提交的No.07/919,297、1992年7月30日提交的No.07/922,649、1993年3月15日提交的No.08/031,801、1993年8月27日提交的No.08/112,848、1994年4月28日提交的No.08/234,145、1995年1月20日提交的No.08/376,279、1995年4月27日提交的No.08/430,938、1995年6月5日提交的No.08/464,584、1995年6月5日提交的No.08/464,582、1995年6月5日提交的No.08/463,191、1995年6月5日提交的No.08/462,837、1995年6月5日提交的No.08/486,853、1995年6月5日提交的No.08/486,857、1995年6月5日提交的No.08/486,859、1995年6月5日提交的No.08/462,513、1996年10月2日提交的No.08/724,752和1996年12月3日提交的No.08/759,620以及美国专利包括No.6,162,963、No.6,150,584、No.6,114,598、No.6,075,181和No.5,939,598和日本专利No.3 068 180 B2、No.3 068 506 B2和No.3 068507 B2。参见Mendez等Nature Genetics 15146-156(1997)和Green和Jakobovits J.Exp.Med.188483-495(1998)。另外参见1996年6月12日授权公开的欧洲专利EP 0 463 151 B1、1994年2月3日公开的国际专利申请WO 94/02602、1996年10月31日公开的国际专利申请WO 96/34096、1998年6月11日公开的WO 98/24893、2000年12月21日公开的WO 00/76310。以上引用的各专利、专利申请的公开内容。
在另一种方法中，其他人，包括GenPharm International，Inc.使用“微基因座(minilocus)”方法。在微基因座方法中，模拟外源Ig基因座是通过包含来自Ig基因座的片段(单个基因)实现的。这样，一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、一个μ恒定区、以及第二个恒定区(优选γ恒定区)形成一个构建体以插入动物体内。这种方法记载在颁给Surani等的美国专利5,545,807和颁给Lonberg和Kay的美国专利5,545,806、No.5,625,825、No.5,625,126、No.5,633,425、No.5,661,016、No.5,770,429、No.5,789,650、No.5,814,318、No.5,877,397、No.5,874,299和6,255,458，颁给Krimpenfort和Berns的美国专利5,591,669和6,023.010、颁给Berns等的美国专利5,612,205、No.5,721,367和No.5,789,215和颁给Choi和Dunn的美国专利5,643,763和GenPharm International的美国专利申请包括1990年8月29日提交的No.07/574,748、1990年8月31日提交的No.07/575,962、1991年12月17日提交的No.07/810,279、1992年3月18日提交的No.07/853,408、1992年6月23日提交的No.07/904,068、1992年12月16日提交的No.07/990,860、1993年4月26日提交的No.08/053,131、1993年7月22日提交的No.08/096,762、1993年11月18日提交的No.08/155,301、1993年12月3日提交的No.08/161,739、1993年12月10日提交的No.08/165,699、1994年3月9日提交的No.08/209,741。另外参见欧洲专利0 546 073B1、国际专利申请WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884和美国专利5,981,175。进一步参见Taylor等，1992，Chen等，1993，Tuaillon等，1993，Choi等，1993，Lonberg等，(1994)，Taylor等，(1994)，和Tuaillon等，(1995)，Fishwild等，(1996)。
Kirin也验证了从小鼠中产生人源抗体的方法，通过微细胞融合，大片段染色体或整条染色体被导入小鼠中。见欧洲专利申请No.773288和No.843 961。
人抗鼠抗体(HAMA)应答使业界开发出嵌合的或者其他形式的人源化的抗体。虽然嵌合抗体具有人源恒定区和鼠源可变区，但预期可观察到某种人抗嵌合抗体(HACA)应答，特别是在长期或多倍剂量使用抗体的情形下。所以，期望提供针对TNFα的完全人源抗体，以消除HAMA或HACA应答的影响和/或效果。
抗体疗法如本文所述，TNFα抗体的功能对其至少一部分作用模式来说显得非常重要。所谓功能，意思是，举例说明，TNFα抗体与TNFα作用时的活性。因此，就某方面来讲，有关产生抗体作为针对TNFα的治疗候选物就很期望抗体能够固定补体，参与CDC。有多种功能相同的同种型抗体，包括但不限于鼠源IgM，鼠源IgG2a，鼠源IgG2b，鼠源IgG3，人源IgM、人源IgG1和人源IgG3。应该注意的是，产生的抗体无需在一开始就具有某种同种型，而是抗体产生时可具有任何同种型，并于其后使用本领域公知的常规技术转换同种型。这些技术包括使用直接重组技术(direct recombinant technique，参见例如美国专利4,816,397)，细胞间融合技术(cell-cell fusion technique，参见例如美国专利5,916,771和No.6,207,418)，以及其他技术。
在细胞间融合技术中，制备具有任一所需同种型重链的一株骨髓瘤或其他细胞系并制备具有轻链的另一株骨髓瘤或其他细胞系。然后使这些细胞融合，便可分离出表达完整抗体的细胞系。
举例来说，本文讨论的TNFα抗体为人源抗TNFα的IgG2抗体。如果此抗体具有所需的同TNFα分子的结合能力，它就可以容易地转换同种型，生成人源IgM，人源IgG1，或人源IgG3同种型，同时仍然具有相同的可变区(它限定了抗体的特异性和部分亲和力)。这些分子即可固定补体，参与CDC。
因此，由于产生的候选抗体具有如上所讨论的所需“结构”属性，经过同种型转换，它们通常可具有至少某种目标“功能”属性。
其他疗法的设计和生成依据本发明，基于生成的和鉴定的与TNFα有关的抗体的活性，设计除抗体部分以外的其他治疗方式也比较容易。所述方式包括但不限于，高级抗体疗法，如双特异性抗体、免疫毒素和放射性同位素标记疗法，生成多肽疗法和基因疗法，特别是内抗体(intrabody)、反义疗法和小分子。
随着以补体固定为所需属性的高级抗体疗法的产生，通过使用例如双特异性抗体、免疫毒素，或放射性同位素标记药物，或许可以回避细胞杀伤对补体的依赖。
例如，就双特异性抗体而言，生成的双特异性抗体可以包括(i)连接在一起的两个抗体，一个对TNFα有特异性，另一个对第二种分子有特异性，(ii)单个抗体，其中一条链对TNFα有特异性，另有第二条链对第二种分子有特异性，(iii)单链抗体，同时对TNFα和另一种分子有特异性。这些双特异性抗体可以使用公知的技术制备；例如，有关(i)和(ii)，参见例如Fanger等Immunol Methods 472-81(1994)以及Wright和Harris，supra.，有关(iii)，参见例如Traunecker等Int.J.Cancer(增补本)751-52(1992)。各情况下，使第二特异性针对重链活化受体，包括但不限于，CD16或CD64(参见例如Deo等18127(1997))或CD89(参见例如Valerius等Blood 904485-4492(1997))。依据上述方法制备的双特异性抗体极有可能杀死表达TNFα的细胞。
关于免疫毒素，可以使用本领域公知的技术修饰抗体，使之用作免疫毒素。参见例如Vitetta Immunol Today 14252(1993)。另外参见美国专利5,194,594。有关放射性同位素标记的抗体的制备，也可使用本领域公知的技术容易地制备出此种经过修饰的抗体。参见例如Junghans等Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686(第二版，Chafner和Longo编辑，Lippincott Raven(1996))。另外参见美国专利4,681,581、No.4,735,210、No.5,101,827、No.5,102,990(RE 35,500)、No.5,648,471和No.5,697,902。各免疫毒素和放射性同位素标记的分子都有可能杀死表达TNFα的细胞。
抗体制备本文所述抗体，通过使用XENOMOUSE_技术制备，下文将有叙述。这些小鼠能够产生人源免疫球蛋白分子和抗体，而不能产生鼠源免疫球蛋白分子和抗体。实现此目标所采用的技术在本文背景技术部分所列的专利、专利申请和参考文献中已经公开。然而特别地，转基因生产小鼠及其产生的抗体的优选的实施方案公开在1996年12月3日提交的美国专利申请系列号08/759,620和1998年6月11日公开的国际专利申请WO 98/24893以及2000年12月21日公开的国际专利申请WO 00/76310。另外参见Mendez等Nature Genetics 15146-156(1997)。
通过使用此技术，已经制备了针对多种抗原的完全人源单克隆抗体。基本上，用目标抗原(如TNFα)使小鼠的XENOMOUSE_品系免疫，就可从小鼠中回收表达抗体的淋巴细胞(如B细胞)，将此回收的细胞系同骨髓型细胞系融合，即制备出无限生长的杂交瘤细胞系。这些杂交瘤细胞系经过筛选和选择，识别出可分泌对目标抗原有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。本文提供的方法制备的是可分泌针对TNFα的特异性抗体的多种杂交瘤细胞系。本文还提供此类细胞系产生的抗体的鉴定，包括这些抗体的重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列分析。
或者，如果不与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，那么，从经过免疫的小鼠XENOMOUSE_品系分离出的回收细胞，进一步筛选其针对初始抗原的反应性，初始抗原优选为TNFα蛋白。此筛选包括使用TNFα蛋白进行ELISA，用与目标抗原结合的已知抗体进行竞争实验，体外中和TNFα诱导的凋亡和在体外结合表达全长TNFα的瞬时转染的CHO细胞。然后使用TNFα特异性溶血蚀斑试验分离出分泌目标抗体的单个B细胞(Babcook等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，i937843-7848(1996))。用于裂解的靶细胞优选为包被有TNFα抗原的绵羊红细胞(SRBC)。在可分泌目标免疫球蛋白的B细胞培养物和补体存在的条件下，蚀斑的形成表明靶细胞有特异性的、TNFα介导的裂解。蚀斑中央可分离出单个抗原特异性浆细胞，并且从单个浆细胞中可分离出编码抗体特异性的遗传信息。使用逆转录酶PCR，可克隆出编码所分泌抗体的可变区的DNA。此克隆DNA可进一步插入合适的表达载体，优选载体盒(vector cassette)如pcDNA，更优选含有免疫球蛋白重链和轻链恒定区的pcDNA载体。然后将生成的载体转染到宿主细胞中，优选CHO细胞中，并在常规营养基中培养，营养基可改良为适于诱导启动子、选择转化体或扩增编码目标序列的基因。本文所述为分离可产生TNFα特异性抗体的多种单个浆细胞。然后分离出编码抗TNFα的抗体特异性的遗传物质，将其导入合适的表达载体，并将载体转染至宿主细胞中。
一般地，由以上提到的细胞系产生的抗体具有完全人源IgG1或IgG2重链和人源κ轻链。抗体具有高亲和力，当在固相和溶液相中测量时，其Kd值通常在约10-9到约10-13M之间。
应该注意的是，抗TNFα的抗体可以在除杂交瘤细胞系以外的其他细胞系中表达。编码特定抗体的序列可用于转化合适的哺乳动物宿主细胞。转化可以使用将多核苷酸导入宿主细胞的任何已知方法进行，包括例如，将多核苷酸包入病毒(或病毒载体)再用病毒(或载体)转导宿主细胞，或者使用本领域公知的转染方法，如以下文献中所示美国专利4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455。使用的转化方法取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法已为本领域所公知，包括葡聚糖(dextran)介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺(polybrene)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、在脂质体中封装多核苷酸、以及将DNA直接微注射至核中。
可作为表达宿主使用的哺乳动物细胞系已为本领域所公知，包括可由美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)获得的许多永生细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary，CHO)细胞、人宫颈癌传代细胞(HeLa cell)、幼仓鼠肾细胞(baby hamster kidney，BHK)、猴肾细胞(monkey kidneycells，COS)、人肝细胞癌细胞(human hepatocellular carcinoma cell，如Hep G2)，以及很多其他细胞系。通过确定哪株细胞系表达水平高并且产生的抗体具有基本的TNFα结合性质，来选择特别优选的细胞系。
抗TNFα抗体可用于检测患者样品中的TNFα，因此也可用于诊断如本文所述的疾病状态。此外，基于它们显著中和TNFα活性的能力(如以下实施例所示)，抗TNFα抗体对由TNFα引起的综合症和疾病有治疗效果。在具体的实施方案中，本文所述的抗体和方法涉及治疗的由TNFα引起的综合症包括发热、肌肉疼痛、嗜睡、头痛、恶心和发炎。其他的实施方案包括使用本文所述抗体和方法治疗恶病质、厌食、风湿性疾病如关节炎，炎性疾病如克罗恩氏病，自体免疫疾病如牛皮癣、移植物抗宿主反应和败血症休克。
治疗用药和制剂本文所述的具有生物活性的抗TNFα抗体可用于无菌药物制品或制剂，用于降低血清TNFα水平，因此可有效治疗一些病理疾病，如血清TNFα水平异常升高。抗TNFα抗体优选具有足够的亲和力以将TNFα有效抑制在目标治疗范围内，并且优选具有足够长的作用时间，从而不用频繁用药。延长作用时间可实现频率更低并且更方便的用药方案，通过肠胃外途径如皮下或肌肉注射。
抗体制剂用于体内给药时必须是无菌的。这一点易于实现，比如，在冻干和重建(reconstitution)之前或之后使用除菌滤膜过滤。抗体一般以冻干形式或在溶液中保藏。治疗抗体组合物一般存放在带有无菌取药口的容器内，如静脉溶液包(intravenous solution bag)或小瓶，带有可提取制剂的适配器，比如可穿过皮下注射器针头的塞子。
抗体给药途径与已知方法一致，如通过静脉、腹膜、大脑、肌肉、眼内、动脉内、鞘内、吸入或损伤区途径注射或输液，或者使用下文所述的缓释系统。本抗体优选通过输液或弹丸注射(bolus injection)连续给药。
治疗所用的抗体的有效剂量依赖于，比如，治疗目标、给药的途径和患者的病情。因此，治疗学家优选滴定确定剂量并根据要求修改给药途径，以获得最佳治疗效果。一般情况下，临床医师将给药抗体直至达到实现所需效果的剂量。这种治疗方法的进行易于由常规检测方法或本文所述的检测方法监控。
本文所述的抗体，可以同可药用的载体制备成混合物。这种药物组合物可通过静脉或鼻或肺给药，优选为液体或粉末气雾剂(冻干)。组合物还可根据需要肠胃外给药或皮下给药。当全身给药时，治疗组合物应该无菌、无热原，并且在可用于肠胃外的溶液中，并适当考虑到pH值、等渗压性和稳定性。这些条件均为本领域技术人员所公知。简言之，本文所述的用于保存或给药的化合物的药用制剂，其制备方法为，将具有所需纯度的化合物同生理可用的载体、赋形剂或稳定剂混合。这些物质在使用剂量和浓度上对接受者是无毒的，包括缓冲液如TRIS HCL、磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和其他有机酸盐；抗氧化剂如抗坏血酸；小分子量(小于约10个残基)肽如聚精氨酸，蛋白如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括纤维素及其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；平衡离子如钠和/或非离子表面活性剂如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇。
注射用的无菌组合物可根据常规制药方法配制，如RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy(第20版，Lippincott Williams &Wilkens Publishers(2003))。例如，可能需要将活性化合物溶解或悬浮于赋形剂中，如水或天然存在的植物油如芝麻油、花生油或棉花子油或合成脂肪赋形剂如油酸乙酯等。缓冲液、防腐剂、抗氧化剂等可以根据公认的制药惯例添加。
适宜的缓释制品的例子包括含有所述多肽的固体疏水聚合物的半透性基质，其中所述基质是成型品(shaped article)、涂膜(film)或微胶囊形式的。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(如聚(甲基丙烯酸-2-羟乙基酯)记载于Langer等，J.Biomed Mater.Res.，(1981)15167-277和Langer，Chem.Tech.，(1982)1298-105，或聚乙烯醇、聚交酯(美国专利3,773,919，EP 58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers，(1983)22547-556)、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯(Langer等，supra)，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。
聚合物例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子长达100天以上，而一些水凝胶释放蛋白质的周期较短。当封装的蛋白质长时间停留在体内时，它们可能会因为在37℃下暴露在水分中而变性或聚集，导致失去生物活性和可能改变免疫原性。根据所涉及的机制，可以设计合理的策略以保持蛋白质的稳定性。例如，如果发现聚集机制是通过二硫化物的互换(disulfide interchange)而形成分子间S-S键，那么可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制含水量、使用适当的添加剂、以及开发特殊的聚合物基质组合物实现稳定。
缓释组合物还包括悬浮在适宜制剂中的抗体结晶制品，该制剂能在悬浮液中保持结晶。当皮下注射或腹膜内注射这些制品时，会产生缓释效果。其他组合物还包括脂质体包裹的抗体。包含这种抗体的脂质体使用公知方法制备美国专利DE 3,218,121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1985)823688-3692；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1980)774030-4034；欧洲专利EP 52,322；EP 36,676；EP88,046；EP 143,949；142,641；日本专利申请83-118008；美国专利4,485,045和4,544,545；以及欧洲专利EP 102,324。
抗体制剂针对给定病人的剂量由主治医生考虑多种已知的可以改变药物作用的因素决定，包括疾病的严重程度和种类、体重、性别、饮食、时间以及给药途径，其他药物以及其他有关的临床因素。治疗有效剂量既可以使用体外方法也可以使用体内方法测定。
本文所述的治疗使用的抗体有效剂量依赖于例如治疗目标、给药途径和患者病情。因此，治疗学家优选滴定测定剂量并按要求修改给药途径以获得最佳的治疗效果。根据如上所述的因素，典型的每日剂量可以在大约0.001mg/kg到至多100mg/kg或更多的范围内。一般地，临床医师将给药治疗抗体，直至达到实现所需效果的剂量。此疗法的进行易于通过常规检测手段或本文所述方法监控。
应理解根据本文所述的组合物和方法给药的治疗实体可与掺入制剂中的适当的载体、赋形剂，以及其他试剂一起给药，以提高转移、传递和耐受性等等。这些制剂包括例如粉剂、糊剂、膏剂、胶冻剂、蜡剂、油剂、脂剂、含有脂类(阳离子或阴离子)的小囊(如LipofectinTM)、DNA缀合物、无水吸附糊剂、水包油和油包水乳化液、乳化聚乙二醇(不同分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶剂，以及包含聚乙二醇的半固体混合物。根据本发明制得的任何上述混合物都可以适用于医治和治疗，只要制剂中的活性成分不因该制剂而失活，以及该制剂在生理上是相容的并且耐受给药途径。参见Baldrick P.″Pharmaceutical excipient developmentthe need for preclinicalguidance.″Regul.Toxicol.Pharmacol.32(2)210-8(2000)，Wang W.″Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.″Int.J.Pharm.203(1-2)1-60(2000)，Charman WN″Lipids，lipophilicdrugs，and oral drug delivery-some emerging concepts.″J PharmSci.89(8)967-78(2000)，Powell等″Compendium of excipients forparenteral formulations″PDA J Pharm Sci Technol.52238-311(1998)以及其中的引文，以获得与剂型、赋形剂和载体有关的、药物化学家熟知的更多信息。
预期本文所述的抗体在治疗由TNFα引起的症状和疾病中具有治疗效果。在具体的实施方案中，本发明的抗体和方法涉及治疗由TNFα引起的症状，包括发烧、肌肉酸痛、嗜睡、头痛、恶心和炎症。其它的实施方案，包括使用本发明的抗体和方法治疗恶病质，厌食，风湿性疾病例如关节炎，炎性疾病例如克罗恩氏病，自身免疫性疾病例如牛皮癣、移植物抗宿主反应和败血症休克。
实施例提供以下实施例，包括进行的实验和获得的结果，是出于说明目的，不得解释为对本发明的限制。
实施例1
抗原制备用于免疫XENOMOUSE_动物的TNFα-KLH抗原的制备从R&D系统(Minneapolis，MN目录号210-TA/CF)获得重组人源TNFα。用于免疫XENOMOUSE_动物的TNFα-KLH抗原通过以下步骤制取将人源TNF-α(200μg)(R&D)与50μg钥孔血蓝素(KLH；Pierce，Rockford，伊利诺伊州)混合，加蒸馏水至终体积为165μl。加入250μl交联缓冲液(conjugation buffer)(0.1M MES，0.9MNaCl，pH 4.7)，再加入25μl 10mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，Pierce，Rockford，伊利诺伊州)储备溶液以使TNFα和KLH交联。交联溶液室温下放置2小时，未反应的EDC使用PBS pH 7.4通过1kDa的过滤器(Centrifugal filter；Millipore，Bedford，马塞诸塞州)离心过滤除去。
用于免疫XENOMOUSE_动物的TNFα-TCE抗原的制备人源TNFα与通用T细胞表位(TCE)(J.Immunol 1992148(5)1499)框内融合作为融合蛋白重组生产，用于免疫XENOMOUSE_动物。
人源TNFα从人类外周血单核细胞(PBMC)克隆得到。从纯化的hPBMC分离mRNA，再通过反转录生成cDNA。人源TNFα使用PCR进行特异性扩增，并与来自破伤风(Tetanus)毒素的通用T细胞表位(TCE)符合读框地克隆进表达载体pGEX(AmershamPharmacia)。融合蛋白在大肠杆菌中表达，使用Glutathione Sepharosebeads(目录号17-0756-01，Amersham Pharmacia)纯化，使用凝血酶(Sigma)裂解，使用制造商(Amersham Pharmacia)所述的方法洗脱。
实施例2抗体产生免疫通过顺次免疫XENOMOUSE_小鼠(XENOMOUSE_XMG2L3或3B-3L3 Abgenix，Inc.Fremont，加利福尼亚州)获得针对人TNFα的人源单克隆抗体。
为了产生杂交瘤，一群XMG2L3和3B-L3 XENOMOUSE_小鼠在脚垫部单独使用TNFα或同时使用TNFα和CPG免疫。起初每只小鼠使用与TITERMAX GOLD_(Sigma，Oakville，俄勒冈州)以体积比1∶1混合的10μg抗原免疫。随后每只小鼠使用与铝佐剂(alum)(Sigma，Oakville，俄勒冈州)混合并经过夜吸收的10μg抗原进行4次强化，然后注射一次混合于TITERMAX GOLD_中的TNFα，注射一次铝佐剂，然后每只小鼠使用10μg溶于PBS的TNFα进行最后一次强化。
接受TNFα和CPG的一群小鼠首先如上所述使用TNFα和TITERMAX GOLD_免疫，接下来的6次强化使用如前所述的经铝佐剂吸收的TNFα，以及CPG。最后一次强化使用溶于PBS的TNFα，以及CPG。特别地，动物在第0、3、9、16、21、25、30和35天免疫。动物在第28和39天采血获得血清，用于如下所述的收获选择。
为了由XENOMAX_产生mAb，一群XMG2 XENOMOUSE_小鼠用TNFα从脚垫部(FP)免疫，或者用TNFα-KLH(如实施例1制备)在尾基部通过皮下注射和腹膜内(intraperitoneum)(BIP)免疫，或者用TNFα-TCE(如实施例1制备)在尾基部通过皮下注射并腹膜内免疫。TNFα脚垫免疫中，每只小鼠最初使用与TITERMAXGOLD_以体积比1∶1混合的2μg抗原免疫。随后每只小鼠使用与铝佐剂(Sigma，Oakville，俄勒冈州)混合并经过夜吸收的2μg抗原进行四次强化，再注射一次溶于TITERMAX GOLD_的TNFα，一次铝佐剂，然后每只小鼠使用2μg溶于PBS的TNFα进行最后一次强化。特别地，动物在第0、3、7、10、14、17、21和24天免疫。这些动物在第19天进行采血获得血清，以进行如下所述的收获选择。
每只小鼠最初的BIP免疫分别使用2或5μg的TNFα-KLH或TNFα-TCE，上述物质与完全弗氏佐剂(CFA，Sigma，Oakville，俄勒冈州)以体积比1∶1混合。随后每只小鼠先分别用与不完全弗氏佐剂(IFA，Sigma，Oakville，俄勒冈州)以体积比1∶1混合的2或5μg抗原强化，然后每只小鼠使用溶于PBS的抗原进行最后一次强化。这些动物在第0、14、28、42、56和第75或93(最后一次强化)天免疫。这些动物在第63天进行采血获得血清，以进行如下所述的收获选择。
为了通过SLAM法产生兔源抗hTNFα单克隆抗体，一群新西兰白兔按如下方法免疫。首次强化使用以体积比1∶1经完全弗氏佐剂(CFA)乳化的250μg TNFα-TCE，沿兔背部的四个位点进行皮下注射。接下来进行3次免疫，经由后肢肌内注射以体积比1∶1由不完全弗氏佐剂(IFA)乳化的125μg TNFα-TCE。每次强化相隔21天。这些动物在第四次免疫之前进行采血以进行血清学实验，见表9。
选择收获的动物抗hTNFα的抗体滴度由ELISA测定。用hTNFα包被CostarLabcoat通用结合聚苯乙烯(Universal Binding Polystyrene)96孔板(Corning，Acton，马塞诸塞州)上，4度下过夜。去掉含有未结合的TNFα的溶液，将板用紫外线(365nm)处理4分钟(4000微焦)。使用蒸馏水将板洗5次。从TNFα免疫的动物中，或从未处理的XENOMOUSE_动物中获得的XENOMOUSE_血清进行滴定测试，所述血清用2％的牛乳/PBS先以1∶100的比例稀释后分为两份，再以1∶2的比例稀释。最后一孔留空。使用蒸馏水将板洗5次。加入羊抗人IgG Fc特异性辣根过氧化酶(HRP，Pierce，Rockford，伊利诺伊州)缀合的抗体，至终浓度为1μg/mL，室温下放置1小时。使用蒸馏水将板洗5次。板上加入TMB显色底物(Gaithersburg，马里兰州)培养30分钟，加入1M磷酸停止ELISA反应。每个XENOMOUSE_动物的具体滴度通过450nm的光密度测定，列入表2到8中。滴度代表血清稀释度的倒数，因此数值越大，对hTNFα的体液免疫应答就越强烈。
兔源抗TNFα滴度按以上方法测定，但是为了检测主要抗体，使用羊抗兔IgG重链和轻链特异性辣根过氧化酶(HRP，Pierce，Rockford，IL)试剂代替抗人试剂，见表9。
表2FP，3B-3L3小鼠，hTNFαG1 kλ


选择表2中所有的XENOMOUSE_动物收获和产生杂交瘤。
表3FP，3B-3L3小鼠，hTNFα+CpGG1 kλ

选择表3中所有的XENOMOUSE_动物收获和产生杂交瘤。
表4FP，XMG2L3小鼠，hTNFαG2 kλ


选择表4中所有的XENOMOUSE_动物收获和产生杂交瘤。
表5FP，XMG2L3小鼠，hTNFα+CpGG2 kλ

选择表5中所有的XENOMOUSE_动物收获和产生杂交瘤。
表6FP，XMG2小鼠，hTNFαIgG2/K


根据表6的血清学数据，选择XENOMOUSE_动物(0651-2，0651-3，0651-5和0651-9)进行XENOMAX_收获。
表7BIP，XMG2小鼠，hTNFα-KLHIgG2/K

根据表7的血清学数据，选择XENOMOUSE_动物(O797-4，O797-6，O797-7和O797-10)进行XENOMAX_收获。
表8BIP，XMG2小鼠，hTNFα-TCEIgG2/K


根据表8的血清学数据，选择XENOMOUSE_动物(O796-2，O796-4，O796-7，O796-8和O796-10)进行XENOMAX_收获。
表9

从兔IPI-5收获血液，以通过SLAM方法制备兔单克隆抗体。
实施例3产生抗人TNFα抗体通过杂交瘤产生抗hTNFα抗体淋巴细胞回收，B细胞分离、融合以及产生杂交瘤经过免疫的小鼠使用颈椎脱臼法处死，从各群中收集淋巴结并合并。分离淋巴样细胞是通过在DMEM中研磨以使细胞从组织中分离，并悬浮在DMEM中。细胞计数，按每一亿个淋巴细胞0.9mLDMEM的量加入细胞团中，以使细胞缓慢但完全地重新悬浮(resuspend)。每一亿个细胞中加入100μL CD90+磁珠，将细胞与磁珠4℃下保温15分钟以使细胞标记。磁性标记的细胞悬液包含多达108个阳性细胞(或总数多达2×109个细胞)，将此悬液装载在LS+柱上，并以DMEM洗涤。收集所有的流出液作为CD90阴性部分(大部分细胞为B细胞)。
P3骨髓瘤细胞和富含B细胞的淋巴结细胞以1∶1(骨髓瘤∶淋巴结)的比例结合，装入50mL锥形管中的DMEM培养液中。结合细胞800xg(2000rpm)离心5～7分钟，立即将上清液从产生的细胞团中去除。在细胞中加入2到4mL链霉蛋白酶溶液(CalBiochem，目录号53702；0.5mg/mL溶于PBS)使细胞团缓慢地重新悬浮。酶处理过程不能超过2分钟，加入3～5mL FBS终止反应。加入足量ECF溶液使总体积达到40mL，混合物800xg(2000rpm)离心5～7分钟。去除上清液，用少量ECF溶液使细胞团缓慢地重新悬浮，再加入足量ECF溶液使总体积达到40mL。细胞混合均匀，计数，800xg(2000rpm)离心5～7分钟。去除上清液，使细胞重新悬浮在少量的ECF溶液中。再加入足量的ECF溶液，将浓度调整到2×106细胞/mL。
将细胞放入电细胞融合(Electro-Cell-Fusion，ECF)发生器(Model ECM2001，Genetronic，Inc.，San Diego，加利福尼亚州)，按照制造商的说明书进行融合。电细胞融合之后，将细胞悬液在无菌条件下小心地从融合室中取出，转移到无菌的试管中，试管中装有相同体积的DMEM杂交瘤培养基。细胞在37℃下保温15～30分钟，然后400xg(1000rpm)离心5分钟。使细胞缓慢地重新悬浮于少量1/2HA培养基(一瓶购自Sigma，目录号A9666的50X HA培养基和一升杂交瘤培养基)，使用更多1/2HA培养基将体积作适当调整(按照每个96孔板5×106个B细胞以及每个孔200μL的标准)。将细胞混合均匀，移入96孔板中生长。在第7天或第10天，去掉一半培养基，细胞中再加入1/2HA培养基。
使用ELISA法对备选抗体进行选择培养14天后，在杂交瘤上清液中筛选TNFα特异性单克隆抗体。ELISA板(Fisher，目录号12-565-136)包被以50μL/孔的于包覆缓冲液(Coating Buffer)(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6，NaHCO38.4g/L)中的TNFα(2μg/mL)，在4℃放置过夜。放置后使用洗涤缓冲液(Washing Buffer)(0.05％Tween 20溶于PBS)将板冲洗3次。每孔加入200μL封闭缓冲液(Blocking Buffer)(0.5％BSA、0.1％Tween20、0.01％硫柳汞溶于1×PBS)，板在室温下放置1小时。然后，用洗涤缓冲液将板冲洗3次。加入50μL/孔的杂交瘤上清液，以及阳性对照和阴性对照，将板在室温下放置2小时。
放置后，用洗涤缓冲液将板冲洗3次。加入100μL/孔羊抗huIgGfc-HRP检测抗体(Caltag，目录号H10507)，羊抗hIgκ-HRP(Southern Biotechnology，目录号2060-05)和羊抗hIgλ(SouthernBiotechnology，目录号2070-05)，将板在室温下保温1小时。保温后，用洗涤缓冲液将板冲洗3次。加入100μl/孔TMB(BioFX Lab.目录号TMSK-0100-01)，显色大约10分钟(直到阴性对照孔刚刚开始显色)，然后加入50μl/孔终止溶液(TMB终止溶液)(BioFX Lab.目录号STPR-0100-01)，将板放在酶免疫分析仪(ELISA plate reader)上在波长450nm读数。阳性孔的数目列入表10。
表10

使用Luminex对抗TNFα杂交瘤上清液进行次级筛选以测定同种型和轻链使用Luminex平台基于荧光珠技术，可同时运行多项检测。Luminex分析仪能在不同编码的微球体上确定正信号事件。这就实现了单独包覆各个珠，然后将不同包覆的微球体混合在一起，然后一步检测与各不同微球体相结合的抗体。为了确定抗体的同种型，微球体的包覆方式应当使每个珠只能与特定的重链或轻链同种型特异结合。然后将微球体混合在一起，加入各抗体的杂交瘤上清液。保温20分钟后，冲洗微球体，使用荧光标记的二次抗体检测结合的抗体。使用Luminex分析仪分析微球体。表10显示不同融合组中发现的各同种型的数目。
检测杂交瘤抗TNFα抗体对TNFα诱导的凋亡的中和能力检测了47种抗TNFα的杂交瘤抗体中和TNFα诱导的人类WM266.4细胞凋亡的生物效应的能力。首先通过在Swell-Gel蛋白A(Pierce)上纯化的方法从各杂交瘤上清液中富集IgG，然后洗脱、中和并定量。20,000个WM266.6细胞种植在96孔板上的完全培养基(RPMI1640/10％FBS/Gln/P/S)中，并在37℃/10％CO2条件下温育过夜。去除培养基，在不含血清的培养基(RPMI1640/Gln/P/S)中加入50μL测试抗体和TNFα(室温下预温育30分钟)。50μL环己亚胺(cyclohexamide)板在以下最终实验条件下如上温育过夜V＝100μl，环己亚胺＝6μg/mL，TNFα＝600pg/mL＝11.4pM(三聚体形式)，实验抗体浓度如所述方式变动。每孔中加入100μL半胱氨酸蛋白酶缓冲液和0.3μL半胱氨酸蛋白酶底物(APO-ONE，Promega)。
使用Victor Wallac分析仪测定半胱氨酸蛋白酶活性，激发波长485nm，发射波长530nm。图1提供了源于杂交瘤的抗体中和凋亡的例子。图1的柱状图表示在人类WM 266.4细胞中不同TNFα抗体中和凋亡的效果。对照(阳性)表示只有环己亚胺时TNFα对凋亡的诱导。另一对照表示6nM鼠抗hTNFα抗体(R&D)对凋亡的抑制。Y轴表示半胱氨酸蛋白酶3/7活性的相对量，代表TNFα诱导的凋亡的程度。如图1所示，抗体，包括3.2、3.7和4.17，在3nM可有效中和TNFα诱导的凋亡。
加入碘化丙锭(PI)中和凋亡的试验进一步检测47种抗hTNFα杂交瘤抗体上清液中和TNFα诱导的人类MCF-7细胞凋亡的生物效应的能力。96孔板使用无酚红的DMEM+10％FCS以5000细胞/孔，200μl/孔种植。细胞在37℃+5％CO2条件下保温过夜。各板上在凋亡培养基(无酚红的DMEM中2.5％FCS，5μg/mL CHX)中，TNFα浓度恒定为100pg/mL(三聚体则为1.9pM)的条件下滴定分析杂交瘤抗体(如实施例2所述以捕捉ELISA试验定量，并且与标准对照抗体曲线对比)三次，并与兔014对照抗体比较，兔014对照抗体从10μg/mL到最终浓度0.005ng/mL(滴定比1∶5)。同时包括只有TNFα的六孔板和只有凋亡培养基的六个孔。TNFα+/-中和抗体在37℃+5％CO2条件下预保温1小时。然后将200μL抗体移入细胞中，在37℃+5％CO2条件下保温过夜。
细胞使用0.5μg/mL PI和2.5μg/mL Heochst 33342染色1小时。数出死亡细胞数(PI+ve)，除以总细胞数(Heochst+ve)，得到凋亡百分率。以Heochst 33342染色后，碘化丙锭吸收与总细胞数的比值来衡量杂交瘤来源的、人抗TNFα结合抗体中和TNFα诱导MCF-7细胞凋亡的能力。SLAM法生成的兔mAb，R014，以及各种其他人源mAb，包括3.2、4.17和3.7，均可有效中和TNFα诱导的MCF-7细胞的凋亡。
同种型转换和IgG2杂交瘤4.17和3.2的表达从杂交瘤4.17和3.2提取mRNA。利用反转录酶PCR以产生cDNA。利用PCR特异性扩增编码可变重链和轻链的cDNA。可变重链区克隆进入IgG1表达载体。这种载体是通过将人IgG1恒定区克隆进入pcDNA3.1+/Hygro(Invitrogen，Burlington，ON)的多克隆位点产生的。可变轻链区克隆进入IgK表达载体或Igλ。这种载体是通过将人IgK或Igλ恒定区克隆进入pcDNA3.1+/Neo(Invitrogen，Burlington，ON)的多克隆位点产生的。然后重链和轻链表达载体共同脂转染进入60mm培养皿的70％汇合的人胚肾293细胞中，转染的细胞可在24到72小时内分泌重组抗体，该重组抗体与原始浆细胞有相同的特异性。从人胚肾293细胞中汲取上清液(3mL)，使用夹心ELISA法(sandwich ELISA)特异性检测到人源IgG，表明有完整的抗体分泌。特异性采用ELISA法将重组抗体与TNFα结合来评定。
由XENOMAX_产生抗hTNFα抗体培养和选择B细胞收获动物中的B细胞并培养。分离分泌TNFα特异性抗体的细胞，如Babcook等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，937843-7848(1996)所述。使用ELISA法识别主要的TNFα特异性孔。来自XENOMOUSE_动物的大约1800万个B细胞培养在480个96孔板上，500或150个细胞/孔，根据TNFα对细胞进行筛选以识别抗原特异性孔。3,825个孔表现出显著高于背景的OD值，代表性例子列入表11。兔B细胞也根据其分泌抗TNFα抗体的能力进行筛选，阳性者按如下所述进一步分析。
表11

抗原特异性抗体浓度的标准化利用ELISA方法，可将上清液中抗原特异性抗体的浓度标准化。利用已知浓度的抗目标(TNFα)抗体平行滴定，可以生成标准曲线，上清液中抗原特异性抗体的量可以与标准比较，以得到浓度数值，见下表12。
表12

*去掉ELISA分析仪线性区之外的数据点。
限制性抗原试验限制性抗原分析是根据亲和力将B细胞培养上清液中制备的抗原特异性抗体相对于所有其他抗原特异性抗体划分等级。在抗原包被极低的情况下，平衡时仅有亲和力最高的抗体才能结合至任何水平可检测到的抗原。(见，例如，PCT公开文本WO/03048730A2题目“IDENTIFICATION OF HIGH AFFINITY MOLECULES BYLIMITED DILUTION SCREENING”公开于2003年6月12日)。
在96孔培养板上，于室温下将生物素化(Biotinylated)TNFα以三种浓度，即1ng/mL、0.1ng/mL和0.01ng/mL结合至链亲和素(streptavidin)板1小时。各板使用蒸馏水冲洗5次，然后在板中加入45μL 1％的牛乳/PBS，以及0.05％的叠氮化钠，然后各孔加入5μL的B细胞上清液。室温下在搅拌器上搅拌18小时，再用蒸馏水将板冲洗5次。向各孔中加入50μL 1μg/mL的Gt抗人(Fc)-HRP。室温下经过1小时，再用蒸馏水将板冲洗5次，然后在各孔中加入50μL的TMB底物。各孔中加入50μL 1M磷酸终止反应，板在波长450nm读数，结果列入表13。
表13

限制性抗原分析制备B细胞培养上清液，其抗原特异性抗体的浓度范围为10ng/mL到1000ng/mL。限制性抗原分析产生的结果与4.17杂交瘤来源的抗体滴定相比较。在这个试验中，许多抗体不能够产生可检测的结合，然而也有许多孔，包括401A7和433F4，在所有浓度下测得的O.D.值均明显高于其他培养上清液和重组抗体(表13)。结合衡量特异性抗体浓度的高抗原数据(详细内容见上)和限制性抗原输出，进一步分析其余的克隆。这样，就可以在如图2所示的浓度范围内比较B细胞培养上清液中的抗体和对照抗体。图2为在一定浓度范围内比较B细胞培养上清液中的抗体和对照抗体(4.17IgG2)的抗TNFα限制性抗原结合的点图。三角形表示B细胞培养上清液克隆，方块表示Bar抗体(4.17IgG2)。对应点在Bar抗体曲线之上的B细胞培养上清液克隆归于具有潜在高亲和力的一类。
加入碘化丙锭(PI)中和凋亡的试验对来自脚垫免疫小鼠的B细胞培养孔上清液中识别的所有1455种抗hTNFα抗体进行进一步试验，以检测它们中和TNFα诱导的人类MCF-7细胞凋亡的生物效应的能力。另外，在对从BIP免疫动物识别出的所有2,370种抗hTNFα进行限制性抗原分析之后，对动力学等级(kinetic ranking)最高的145种抗体进一步分析它们中和TNFα的活性。96孔板上使用无酚红DMEM+10％FCS以5000细胞/孔、200μL/孔种植MCF-7细胞。板在37℃+5％CO2条件下保温过夜。各板上B细胞培养抗体上清液在凋亡培养基(无酚红的DMEM中2.5％FCS，5μg/mL CHX)中，TNFα浓度恒定为100pg/mL(三聚体则为1.9pM)的条件下，与最有效的中和抗TNFα杂交瘤抗体，4.17和3.2和/或兔014对照一起分析。同时包括含有于凋亡培养基中的TNFα的平行(replicate)孔和只有凋亡培养基的孔作为对照。TNFα+/-试样在37℃+5％CO2条件下预保温1小时。200μL TNFα+/-移入细胞，并在37℃+5％CO2条件下保温过夜。
使用0.5μg/mL PI和2.5μg/mL Heochst 33342将细胞染色1小时。数出死细胞数(PI+ve)，除以总细胞数(Heochst+ve)，得到凋亡百分率。图3为一示例，是在人类MCF-7细胞中，对不同的XENOMAX_B细胞培养上清液抑制TNFα诱导的细胞凋亡的效率进行比较的代表性柱状图。许多B细胞培养孔上清液显示出中和TNFα诱导的凋亡的能力。这些上清液包括164C7、179B1、401A7、410B1、439A3和460A12。
多克隆溶液中抗hTNFα抗体中和TNFα诱导的凋亡的效能检测利用多克隆B细胞培养上清液中抗原特异性抗体的外推浓度，可计算出中和TNFα诱导的MCF-7细胞凋亡的表观效能。对标准抗目标试剂作平行实验，此处为杂交瘤来源的抗体3.2IgC2，就可以建立效能柱状图，并且寻找潜在效能高于标准的抗体。
对中和TNFα诱导的MCF-7细胞凋亡的计算效能进行比较，例子显示于图4。图4显示了对XENOMAX_B细胞培养上清液中和TNFα诱导的人类MCF-7细胞凋亡的计算效能进行比较的点图。三角形代表B细胞培养上清液的效能，而方块代表Bar抗体，3.2IgG2的效能。许多B细胞培养上清液在低抗TNFα抗体浓度时，与3.2对照标准曲线相比，可更强地中和TNFα诱导的凋亡，表明其具有更强的效能。
兔抗体抑制TNFα结合p55(TNFα受体I)兔抗TNFα中和抗体的发现是通过检测来自B细胞培养上清液的抗体是否能够抑制TNFα与其p55受体结合。接下来进行如下步骤。96孔微量滴定板以TNFα包被，过夜。第二天，将板冲洗，温育+/-抗TNFα抗体1小时。然后将生物素-p55加入板中，过1小时后用水冲洗，使用链亲和素-HRP检测结合的p55。然后按照以上所述的ELISA方法将板冲洗和显色。抑制p55结合的抗体称为中和的，见表14。
表14


TNFα特异性溶血蚀斑试验使用几种专门的试剂进行此项试验。这些试剂按如下方法制备。
绵羊红细胞(SRBC)的生物素化SRBC以25％原液保存在RPMI培养基中。为获得250μL绵羊红细胞沉淀，取1.0mL SRBC放入新的微量离心管(eppendorf tube)中。SRBC在微量离心机中以8000rpm(6800rcf)的脉冲旋转沉淀，除掉上清液，沉淀重新悬浮于1.0mL pH为8.6的PBS中，重复离心。洗涤循环重复2次，SRBC沉淀转入一支15mL的falcon管中，加入pH8.6的PBS至体积为5mL。在一支单独的50mL falcon管中，在45mL pH8.6的PBS中加入2.5mg硫代NHS生物素。生物素完全溶解后，立即加入5mL SRBC，将管在室温下旋转1小时。SRBC在3000rpm离心5分钟，去除上清液。生物素化SRBC移入微量离心管，换用pH7.4的PBS按如上所述冲洗3次，然后在15mL falcon管中加入免疫细胞培养基(RPMI 1640)至体积为5mL(5％B-SRBC原液)。原液4℃下保存备用。
以链亲和素(SA)包被B-SRBC取1mL 5％B-SRBC原液，放入新的微量离心管中。B-SRBC细胞按如上方法洗3次，重新悬浮于1.0mL pH7.4的PBS中，终浓度为5％(v/v)。加入10μL 10mg/mL的链亲和素储备溶液(CalBiochem，San Diego，加利福尼亚州)，将管在室温下混匀和旋转20分钟。重复冲洗步骤，SA-SRBC重新悬浮于1mL pH7.4的PBS中(5％(v/v))。
以人源TNFα包被SA-SRBCSA-SRBC以10μg/mL的生物素化TNFα包被，在室温下混匀和旋转20分钟。SRBC使用1.0mL pH7.4的PBS按如上方法洗2次。TNFα包被的SRBC重新悬浮于RPMI(+10％FCS)中，终浓度为5％(v/v)。
以免疫荧光法(IF)检测TNFα-SRBC的质量将10μL 5％的SA-SRBC和10μL 5％的TNFα包被的SRBC分别加入到单独的含40μL PBS的1.5mL新微量离心管中。将对照人源抗TNFα抗体加入各SRBC试样中，浓度为45μg/mL。将管在室温下旋转25分钟，然后将细胞用100μL PBS洗3次。细胞重新悬浮于50μLPBS中，与40μg/mL的结合于Alexa488(Molecular Probes，Eugene，OR)的羊抗人IgG Fc抗体共同温育。将管在室温下旋转25分钟，然后使用100μL PBS冲洗，细胞重新悬浮于10μL PBS中。取10μL染色的细胞，滴于干净的玻璃载玻片上，上面盖上玻璃盖玻片，在荧光下观察，以0～4中的任意数值计分。
制备浆细胞收获单个微培养孔的内容物，所述内容物经过前面多种检测已识别出其含有分泌目标免疫球蛋白的B细胞克隆。利用100-1000μL的微量吸管，加入37℃RPMI(10％FCS)回收孔中的内容物。通过吹吸使细胞重新悬浮，然后转移到新的1.5mL的微量离心管中(终体积大约为500-700μL)。细胞使用微量离心机在室温下以2500rpm(660rcf)离心1分钟，将管旋转180度，以2500rpm再次离心1分钟。去除冷冻培养基，免疫细胞重新悬浮于100μL RPMI(10％FCS)中，然后离心。重复使用RPMI(10％FCS)洗涤，细胞重新悬浮于60μL RPMI(10％FCS)中，保存于冰块上备用。
蚀斑试验预先准备载玻片(2×3英寸)，在边缘涂上硅树脂(silicone)室温下过夜使其固化。使用前，用大约5μL SigmaCoat(Sigma，Oakville，ON)处理载玻片，在玻璃表面涂抹均匀，干燥后用力擦拭。在60μL细胞试样中，加入TNFα包被的SRBC(5％v/v原液)、在RPMI(10％FCS)中制备的4x豚鼠(guinea pig)补体(Sigma，Oakville，ON)原液、以及4x增强血清原液(在RPMI(10％FCS)中1∶150)各60μL。将混合物(10-15μL)滴于准备好的载玻片上，上面覆盖以未稀释的石蜡油。载玻片在37℃温育至少45分钟。
蚀斑实验结果使用TNFα包被的绵羊红细胞识别孔中的抗原特异性浆细胞(见表15)。
表15

重组抗TNFα抗体的表达单个的浆细胞分离后，提取mRNA，进行反转录酶PCR操作，以产生编码可变重链和轻链的cDNA。克隆人源可变重链区，转换同种型进入IgG1表达载体。该载体通过将人源IgG1的恒定区克隆进入pcDNA3.1+/Hygro(Invitrogen，Burlington，ON)的多克隆位点而产生。人源可变轻链区克隆进入IgK表达载体。这些载体通过将人源IgK的恒定区克隆进入pcDNA3.1+/Neo(Invitrogen，Burlington，ON)的多克隆位点而产生。然后重链和轻链表达载体共同脂转染进入60mm培养皿的70％汇合的人胚肾293细胞中，转染的细胞可在24到72小时内分泌重组抗体，该重组抗体与原始浆细胞有相同的特异性。从人胚肾293细胞中汲取上清液(3mL)，使用夹心ELISA法特异性检测到人源IgG，表明有完整的抗体分泌(表16)。特异性采用ELISA法将重组抗体与TNFα结合来评定。
表16

按如下步骤进行分泌ELISA实验。对照板以2mg/mL羊抗人IgGH+L包被过夜作为结合板，将hTNFα包被在Costar Labcoat通用结合聚苯乙烯96孔板，保持4℃过夜。用蒸馏水将板冲洗5次。从未稀释的微脂转染上清液中选7孔以1∶2滴定重组抗体。用蒸馏水将板冲洗5次。加入羊抗人IgG Fc特异性、HRP缀合的抗体至终浓度为1μg/mL，室温下放置1小时，以进行分泌实验和两项结合实验。用蒸馏水将板洗5次。板中加入TMB显色30分钟，加入1M磷酸终止ELISA反应。各ELISA板在450nm处测定各个孔的光密度。
兔源抗体基因按如上方式获取、克隆和表达，但须克隆进入包含兔IgG1重链恒定区或κ恒定区的载体。将细胞从孔7A4(表14)上分离、克隆并表达为完全兔源抗体，R014(AB-TNFα-R014)。
重组抗TNFα抗体的纯化为进行大规模生产，重链和轻链表达载体(2.5μg各链/培养皿)脂转染进入10个100mm的培养皿中，其中有70％汇合的人胚肾293细胞。转染的细胞在37℃下温育4天，取上清液(6mL)，然后补入6mL新鲜培养基。第7天，取出上清液并与最初取出的上清液合并(10个板共有120mL)。使用蛋白A琼脂糖凝胶(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)亲和色谱法从上清液中纯化出各种抗体(1mL)。抗体使用500mcL的0.1M甘氨酸(pH2.5)从蛋白A柱中洗脱。洗脱物在pH7.4的PBS中透析并过滤杀菌。使用非还原SDS-PAGE分析抗体，测定纯度和产量。同时在OD250处使用紫外分析测定浓度。
实施例4抗TNFα抗体与跨膜TNFα结合可溶性和膜结合的TNFα均可与TNFα受体相互作用，引起TNFα促炎症效应(pro-inflammatory effect)。因此，除了可溶性TNFα分子外，确定299v2和263是否能够与膜结合的TNFα有效结合非常重要。为此，使用TNFα转染的CHO细胞以及活化的T细胞。
测定抗TNFα试剂与在CHO细胞表面表达的跨膜突变TNFα的结合。具体地说，测定纯化的、量化的IgG2κ和λ杂交瘤抗体，以及同种型转换的杂交瘤和XENOMAX_来源的IgG1重组抗体与在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表面表达的跨膜TNFα结合的能力。TNFα的cDNA在多个位置产生突变，以防止TNFα从细胞表面分裂。然后将cDNA克隆进入表达载体。将CHO细胞转染，对稳定表达的细胞进行药物选择，以产生DTNFα细胞系。滴定抗TNFα抗体和依那西普(Etanercept，重组人TNF受体融合蛋白)，并加入DTNFαCHO细胞，冰上放置1或18小时。使用冷的PBS洗涤细胞，二级生物素化抗兔或人IgG在冰上再保温10分钟，洗涤，加入三级SA-PE标记的抗体，在冰上再放置10分钟。使用荧光活化细胞分选(FACS)在不同抗体浓度下测定结合和染色曲线。
低浓度下，人源抗体，以及嵌合的英夫利昔单抗(Infliximab)和兔R014，与细胞上跨膜形式的TNFα结合，而依那西普则明显表现较低的结合信号。299v2、263、英夫利昔单抗、阿达木单抗和依那西普在DTNF-CHO细胞上以0.1μg/mL的浓度在4℃下温育18小时。对于单克隆抗体，299v2和阿达木单抗的染色程度明显比263和英夫利昔单抗低。结果数据表明，Fc介导的效应，例如抗体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)应该可以在表达跨膜TNFα的细胞中观察到。许多产生的抗体可能比英夫利昔单抗和依那西普具有更强的Fc介导的效应。这可能特别有利于治疗细胞表面TNFα起主要病理生理作用的疾病，比如克罗恩氏病或牛皮癣。
为了治疗主要发病状态可能由可溶形式的TNFα介导的疾病适应症，可能需要具有低Fc介导的效应物功能的抗体。这可以通过将抗TNFα抗体表达为IgG2或IgG4同种型来实现。
同时还测定了抗TNFα试剂与活化PBMC的结合。PBMC从正常供体中分离，与抗CD3抗体共同温育以活化T细胞。T细胞活化说明膜结合TNFα有表面TNFα表达。在不同浓度下再次测定抗TNFα试剂与膜结合的TNFα结合的能力，方法是使用FACS分析，根据光散射对淋巴细胞进行″门控制″(gating)，以及使用与PE结合的抗人IgG二级抗体。染色结果数据表明，所有的单克隆抗体，299v2、263、英夫利昔单抗和阿达木单抗均能在T细胞活化后将淋巴细胞染色，而依那西普却不能。如果T细胞不活化，抗TNFα抗体均无法使淋巴细胞染色。
实施例5表位分箱(binning)实验抗TNFα抗体的表位图谱以下记叙了绘制抗TNFα抗体的表位图谱的方法。利用人和小鼠TNFα来构建和表达嵌合TNFα蛋白。表17提供了人和小鼠TNFα的比对。
表17人 VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANA小鼠LRSSSQNSSDKPVAHVVANHQVEEQLEWLSQRANA人 LLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCP小鼠LLANGMDLKDNQLVVPADGLYLVYSQVLFKGQGCP人 STHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRE小鼠DY-VLLTHTVSRFAISYQEKVNLLSAVKSPCPKD人 TPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINR小鼠TPEGAELKPWYEPIYLGGVFQLEKGDQLSAEVNL人 PDYLDFAESGQVYFGIIALSEQ ID NO265小鼠PKYLDFAESGQVYFGVIALSEQ ID NO266利用人源和鼠源TNFα-a基因共有的限制酶切位点来构建框内融合的TNFα嵌合蛋白。制成7种构建体人源TNFα、小鼠、TNFαH/MBglI、M/H BglI、H/M HincII、H/M PvuII、M/H PvuII。所有蛋白的表达和分泌，均在使用针对人源和鼠源TNFα的多克隆抗体进行ELISA试验中可检测到的水平上。嵌合TNFα蛋白氨基酸连接点位于BgII-36/37、HincII-90/92、PvUII-124/126。后两种情况中的一个氨基酸差异是由于在鼠源TNFα序列中位置73缺少一个组氨酸残基。通过ELISA将抗TNFα抗体与这些蛋白结合的例子列入表18。
表18


为了确定不同抗体的结合位点，通过位点定向诱变使许多hTNFα残基发生突变。通过ELISA法筛选一组结合抗体。人源残基在位置27，31和131被鼠源残基替换。位置73的组氨酸缺失，一实例列入表19。
表19


如表19所示，兔014、4.17、SC291、SC299和SC313的结合位点位于人源TNFα的前36个氨基酸残基中。已经表明氨基酸31-35参与受体识别和激发生物应答(Jones，E.Y.，Stuart，D.I.，和Walker，NPC.，(1992)，Tumor Necrosis FactorsStructure，Function andMechanism of Action(Aggarwal，B.B.，和Vilcek，J.，编辑)93-127页，Marcel Dekker，Inc.，纽约)。引入Arg31这一非保守性变化以进一步绘制表位图谱。位置31的单个氨基酸变化表明可以完全阻止SC291，SC299和SC313的结合，而mAb 4.17只失去80％的结合活性，需要再在位置27发生变化才能阻止4.17的活性。
MAb 3.2的结合位点位于残基1到91之间。尽管Gln27和Arg31的置换不会影响它结合人源TNFα，但是N-末端似乎是结合活性所必需的。Mab 3.7的表位位于残基36到157之间。
使用单克隆抗体SC250、SC263、SC269、SC282、SC283和英夫利昔单抗均不能中和嵌合体。所有这些抗体对人源TNFα具有高度特异性，它们的表位是一组残基，位于TNFα多肽上不同的、且不相邻的位置。Gln27、Arg31、His73和Arg131都不涉及中和结合位点。
表20总结了对299v2、263、依那西普、英夫利昔单抗和阿达木单抗绘制的更多表位图谱的结果。如表20所示，299v2、依那西普和阿达木单抗可以结合包含人源TNF氨基酸1到氨基酸36之间区域的嵌合蛋白，而263和英夫利昔单抗不与任何嵌合蛋白结合。所有抗TNF抗体都与人源TNF结合，但是都不与鼠源TNF结合。这些结果表明，299v2、依那西普和阿达木单抗的结合区域很可能包含在TNF的前36个氨基酸中，而263和英夫利昔单抗的结合区域分散在整个分子上。所有抗TNF抗体都与蛋白变性敏感区结合，表明它们的结合区具有构象。
表20

进一步分析TNFα受体p75-hFc和p55-hFc(R&D，目录号372-RI-050和372-RI/CF)结合TNFα蛋白的情况，如表21所示。
表21


实施例6抗猕猴TNFα的结合交叉反应性与人源和猴源可溶性重组TNFα结合同时还测定了抗TNFα抗体结合可溶性重组TNFα的能力。人源和猴源(猕猴(cynomolgous macaque))TNFα以GST融合蛋白在大肠杆菌中表达。由ELISA测定结合性。299v2、263、依那西普、英夫利昔单抗和阿达木单抗(″抗TNFα抗体″)在96孔板中温育过夜，所述96孔板包被以0.5μg/mL人源GST-TNFα、2μg/mL猴源GST-TNFα和10μg/mL GST。使用HRP缀合的羊抗人IgG抗体检测结合抗体。结果显示，所有抗TNFα抗体以类似的剂量应答与人源TNFα结合(图5)。抗TNFα抗体与猴源TNFα的结合不同。299v2、依那西普和阿达木单抗与猕猴TNFα以相似的方式结合，而263和英夫利昔单抗似乎不与猕猴TNFα结合(图6)。
实施例7动力学分析使用KinExA_和BIACORE_技术测定抗TNFα抗体的动力学数据。KinExA_方法包括溶液中测定平衡状态的表观亲和力(foramalaffinity)数据。为了测定各种人源抗TNFα抗体的结合动力学数据，进行两个实验，各重复三次。两个实验中均滴定已知浓度的抗原，每种抗原滴定液中加入不同浓度的抗体，并且达到结合平衡。为了测定人源TNFα的Kd值，使用三聚体(52.5kDa)，见表22，或三单体(17.5kDa)，见表23，的摩尔TNFα结合位点浓度来计算Kd。使用对偶曲线分析(dual curve analysis)来分析结果。兔R014抗体动力学数据测定基本采用上述方法，然而，未知抗原浓度法改用已知抗体浓度以计算Kd值。另外，为了排除可能的亲合效果(avidity effect)，使用木瓜蛋白酶裂解产生Fab碎片，重复进行动力学分析(见表24)。
使用BIACORE_产品的资料文件中所述的方法，还可以从其有关数据计算出其它的动力学常数。缔合速率常数(ka)是根据抗原抗体反应动力学计算得到的表示抗体与目标抗原的结合强度(程度)的数值。离解速率常数(kd)是根据抗原抗体反应动力学计算得到的表示此单克隆抗体与目标抗原的解离强度(程度)的数值。离解速率常数(kd)值除缔合速率常数(ka)值得到离解常数(Kd)，见表25。
表22

*本实验中使用与依那西普(Enbrel)相似的p75-hFc构建体(R&D系统)。使用依那西普可得到类似的结果(数据未列出)。
**每个实验的误差在6～7％之间。
表23

*本实验中使用与依那西普(Enbrel)相似的p75-hFc构建体(R&D系统)。使用依那西普可得到类似的结果(数据未列出)。
**每个实验的误差在6～7％之间。
表24

表25

对299v2与猕猴TNFα的结合亲和力也进行了测定，因为在ELISA实验中发现这种抗体可与猴源TNFα结合。KinExA法也用来测定反映这种结合亲和力的Kd值。299v2结合猴源TNFα的亲和力为626pM，将TNFα看作单体，因此比与人源TNFα的亲和力大约低200倍。
实施例8体外抗hTNFα抗体特性在人MCF-7细胞中抑制TNFα诱导的凋亡使用如前所述的方法大量培养、纯化和定量IgG2κ和λ杂交瘤。使用如前所述的方法表达、纯化和定量同种型转换的杂交瘤和XENOMAX_来源的IgG1重组抗体。进一步测定抗体中和TNFα诱导的人类MCF-7细胞凋亡的生物效应的能力。96孔板使用无酚红的DMEM+10％FCS以5000细胞/孔、200μL/孔种植MCF-7细胞。板在37℃+5％CO2条件下温育过夜。在各个板上，对各种抗体进行滴定实验，终浓度为0.005ng/ml到10μg/mL。抗TNF试剂在凋亡培养基(无酚红的DMEM中有2.5％FCS，5μg/mL CHX)中稀释，三倍或多达六倍，TNFα的恒定浓度为100pg/mL(作为三聚物为1.9pM)。还包括凋亡培养基中只有TNFα的6孔板和只有凋亡培养基的6孔板。TNFα+/-中和抗体在37℃+5％CO2条件下预温育1小时或18小时。将200μL TNFα+/-中和抗体加入到细胞中，在37℃+5％CO2条件下温育过夜。
细胞用0.5μg/mL PI和2.5μg/mL Heochst 33342染色1小时。数出死细胞数(PI+ve)，除以总细胞数(Heochst+ve)，得到凋亡百分率。使用MCF-7细胞检测中和，并作为碘化丙锭和Heochst 33342染色的比例探测。图7和图8以线状图的形式提供中和抗体滴定曲线的实例，该曲线可通过四参数曲线拟合导出IC50值。
表26所示结果为体外抑制TNF诱导的MCF-7细胞凋亡的不同实验，在抗体与TNF预温育1小时或18小时的时间点所获数据的平均值。较长的18小时预温育时间可使亲和力差异更加容易地被观察到，因为抗体-抗原结合反应更接近平衡状态。299v2在所有完全人源单克隆抗体和英夫利昔单抗中，显示出最低的IC50值。同时还观察到在亲和力和中和效能之间有强相关性。
表26

抗TNFα中和凋亡的IC50平均值的例子显示于柱状9中。如图9所示，所有抗体均为TNFα诱导的凋亡的有效中和剂。特别地，抗体299v2表现出比英夫利昔单抗，阿达木单抗或依那西普更强的平均效能。
表27显示兔R014单克隆抗体与TNF预温育1小时后，TNF诱导的MCF-7细胞凋亡的抑制。
表27

*实验次数抑制TNFα诱导的人类WM 266.4细胞的凋亡按如上所述大量培养、纯化和定量IgG2κ和λ杂交瘤。使用如上所述的方法表达、纯化和定量同种型转换的杂交瘤和XENOMAX_来源的IgG1重组抗体。进一步测定抗体中和TNFα诱导的人类WM266.4细胞凋亡的生物效应的能力。20,000 WM266.6细胞种植在96孔板中的完全培养基(RPMI1640/10％FBS/Gln/P/S)中，并在37℃/10％CO2条件下温育过夜。去掉培养基，将50μL实验抗体加TNFα(室温下预保温30分钟)加入无血清培养基(RPMI1640/Gln/P/S)。50mL环己亚胺板在以下最终实验条件下如上保温过夜V＝100ml，环己亚胺＝6μg/mL，TNFα＝600pg/mL＝11.4pM(三聚体形式)。实验抗体浓度如所述方式变动。每孔中加入100μL半胱氨酸蛋白酶缓冲液和0.3μL半胱氨酸蛋白酶底物(APO-ONE，Promega)。使用VictorWallac分析仪测定半胱氨酸蛋白酶活性；激发波长485nm；发射波长530nm。图10显示抗体中和凋亡能力的例子。图10为显示抗TNFα中和的IC50平均值的柱状图。在人类WM266细胞中进行中和实验，测定半胱氨酸蛋白酶活性作为TNFα诱导的凋亡的指标。按图7中简要叙述的方法计算抗体IC50值。
一对照组显示TNFα和环己亚胺单独诱导的凋亡。其他的对照组包括兔014抗体，以及英夫利昔单抗和p75-hFc(R&D)，它们作为依那西普的替代物。图中显示半胱氨酸蛋白酶活性作为TNFα诱导的凋亡的量度。从图10中可以看出，SC299V1和SC299V2抗体彼此十分相似，并且除了R014以外，263以及或许234比英夫利昔单抗和p75-hFc更有效。4.17 IgG2、SC282和3.2 IgG2比p75-hFc更有效。图10还说明，所有抗体均为TNFα诱导的凋亡的有效中和剂。
抑制人全血中TNFα诱导的IL-8的产生人全血培养物可复制出临床相关的天然存在的条件，该条件可能不存在于细胞培养或实验动物体内。全血培养用来评定抗TNFα抗体中和TNFα诱导产生IL-8的效能。全血通过静脉穿刺法从正常供体中获取，收集在EDTA管中，种植于96孔板中。抗TNFα抗体在RPMI培养基中稀释，并与全血混合。使用不相关的人源IgG1抗体作为对照。然后加入TNFα(最终浓度100pg/ml，将TNFα看作三聚体相应为1.9pM)。板在37℃下温育6小时。温育后，培养物中加入Triton X-100至终浓度为0.5％(v/v)，以使细胞裂解。使用ELISA法测定产生的IL-8。为了表示结果，在IgG1对照存在的条件下由TNFα诱导产生IL-8的量设为100％。表28报道了使用抑制曲线(图11)计算出的抗TNFα抗体的IC50值。299v2和依那西普替代物显示出最低的IC50值和最高的效能。
表28

*本实验中使用与依那西普(Enbrel)相似的p75-hFc构建体(R&D系统)。使用依那西普可得到类似的结果(数据未列出)。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性对抗TNFα抗体进行实验以测定其支持由PBMC(主要是NK细胞)介导的杀伤TNFα转染的CHO细胞的能力。简单地说，从正常供体获得人PBMC，以一定浓度标准进行重新悬浮，以便当加入到效应物细胞中时，能够产生1∶100的效应物/靶细胞比。同时，将稳定表达膜结合TNFα的TNFα转染的CHO细胞，使用膜染料PKH-26进行标记。然后将CHO细胞种植于96孔培养皿中三份，加入或者不加5μg/mL抗体。温育30分钟，加入效应物细胞，37℃下过夜发生ADCC反应。此时，合并这三份试样，根据厂商的说明书使用染料TOPO-3染色，然后使用FACS分析。计算PKH-26和TOPO-3双阳性细胞(杀死的靶细胞)数与PKH-26单阳性细胞(存活的靶细胞)数的比率，并以百分率的形式表述结果。结果说明单克隆抗体具有支持ADCC作用的能力，与作为依那西普替代物的p75-hFc相比具有显著差异(表29)。
补体依赖的细胞毒性同时还检测抗TNFα抗体固定补体并从而介导杀伤TNFα转染的CHO细胞的能力。简单地说，CHO细胞以12500/孔种植于96孔板中两份，加入5μg/mL抗体。冰上温育3小时，加入兔源补体至终浓度为10％，室温下进行CDC反应30分钟。此时，细胞用0.5μg/mLPI和2.5μg/mL Heoehst 33342染色1小时，并用计数器(Autoscope)计数。实验重复三次。以如上所述的TNFα诱导的凋亡试验中的方法计算和表述结果。与ADCC作用情况一样，结果说明单克隆抗体具有激发CDC作用的能力，与作为依那西普替代物的p75-hFc相比具有差异(表29)。
表29

**本实验中使用与依那西普(Enbrel)相似的p75-hFc构建体(R&D系统)。
实施例9体内抗hTNFα抗体的表征抑制小鼠体内TNFα诱导的肝损伤为了测试抗人TNFα抗体是否能够中和体内人TNFα，研究了小鼠中抗人TNFα抗体预防由施用人TNFα和D-半乳糖胺诱导的肝损伤的能力(Lehmann V等，J.Exp.Med.，1987165(3)657-63)。施用TNFα和D-GalN可诱导急性肝损伤，与LPS和D-GalN诱导的肝损伤很相似，特征是大量肝细胞程序化死亡，最终导致休克和死亡。D-GalN处理后使小鼠对脂多糖(LPS)以及鼠源TNFα的致死效应的敏感度提高100-1000倍(Lehmann V等，J.Exp.Med.，1987165(3)657-63)。由LPS和D-GalN诱导的程序化肝损伤已经证明依赖于内源产生的TNFα(Leist M等，Am.J Pathol.，1995，146(5)1220-34.)。还已经证明这种肝损伤专门依赖通过p55受体分泌的TNFα信号(NowakM等，Am.J.Physiol.2000，278(5)R1202-9)，说明D-GalN同时也使对人源TNFα的致死效应敏化，其中人源TNFα在小鼠中只与p55受体结合。通过测定血清酶丙氨酸转氨酶(ALT)的活性来确定hTNFα和D-GalN诱导的肝损伤的程度。
实验按照所述步骤进行。从Charles River Laboratories购得的8到10周龄的Balb/c雌性小鼠，体重大约20克。每组使用8到10只小鼠。在预备试验中确定给药剂量和途径，以及测定血清中ALT水平的时间。小鼠注射D-GalN(Sigma)(900mg/kg，腹膜内注射)，90分钟后注射人TNF(R&D系统)(1μg/小鼠，静脉注射)。静脉注射1μg/小鼠的TNF导致循环水平的TNF在19nM(将TNF看作三聚体)。TNF/GalN给药6小时后使用商业诊断试剂盒(Sigma)通过测定ALT来衡量肝细胞损伤程度。为了比较299v2、263、依那西普、阿达木单抗和英夫利昔单抗在体内抑制TNFα的能力，进行剂量-应答实验，先注射抗TNF试剂(1-10i.v.μg/鼠)，90分钟后注射TNF(1μg/鼠，静脉注射)。对照组小鼠在注射TNF之前先注射盐水。数据以对照组的百分比表示，并绘制中和曲线(图12)。使用四参数拟合曲线计算IC50值。表30显示由不同实验得到的不同抗TNF试剂的IC50平均值。
抑制小鼠体内TNFα诱导的IL-6产生作为检测抗TNFα抗体抑制体内TNFα能力的另一种方法，可将抗TNFα抗体用于阻止由人源TNFα诱导小鼠中的IL-6产生。TNFα引发多种急性生物反应，包括诱导产生IL-6(Benigni等，J.Immunol.1575563，1996)。每组使用8到10只小鼠。如在最初的时程实验中所得结果，小鼠注射人源TNFα引起血清中IL-6水平急剧增长，注射后2小时达到峰值。根据针对TNFα给药剂量和途径而进行的另一项预备实验的结果，小鼠采用静脉注射1μg/鼠的人源TNFα。施用TNFα2小时后，使用商业ELISA试剂盒(R&D系统)测量IL-6水平。注射抗TNFα抗体(1-10i.v.μg/鼠)，90分钟后再注射TNFα(1μg/鼠，静脉注射)，以进行剂量-应答实验。对照组小鼠在注射TNFα之前先注射盐水。数据以对照组的百分比表示，并绘制中和曲线(图13)。使用四参数拟合曲线计算IC50值。表30显示由不同实验得到的不同抗TNFα抗体的IC50平均值。
表30

实施例10抗TNFα抗体结构分析对表1中所示抗体的可变重链和可变轻链进行测序，以得到其DNA序列。所有抗TNFα抗体的完全序列信息均列入随同本说明书递交的序列表中，包括核苷酸和氨基酸序列。
表31中将各种XENOMAX_来源的抗体重链区与特定种系的重链区作比较。表32中将各种XENOMAX_来源的抗体轻链区与特定种系的轻链区作比较。表33中将各种杂交瘤来源的抗体重链区与特定种系的重链区作比较。表34中将各种杂交瘤来源的抗体轻链区与特定种系的轻链区作比较。
取样品，参照中国药典2000年版二部附录“药物稳定性试验指导原则”，按市售包装，长期留样试验(置于25℃±2℃，相对湿度60％±10％)条件下放置，并分别于3、6、9、12个月取样分析，以及加速试验(30℃±2℃，相对湿度75％±10％)条件下放置，并分别于1、2、3、6个月末取样分析。主要从样品的性状、均匀性、油水分离现象(有无分层)、含量等方面进行考察，结果分别表3和4。
表3 本发明阿米卡星软膏长期留样试验结果




表32.Xenomax轻链分析




表33.杂交瘤重链分析AB-TNFα-XG2













表34.杂交瘤轻链分析AB-TNFα-XG2K








实施例11测定抗体的典范类对于各免疫球蛋白链的高变区，Chothia等使用术语″典范类″来描述抗体结构(J Mol Biol.1987年8月20日；196(4)901-17)。对多种免疫球蛋白的Fab和VL片段的原子结构进行分析，以找出其氨基酸序列与其抗原结合位点的三维结构之间的关系。Chothia等发现，只有相对较少的残基，通过堆积、氢键或呈现独特的_、ψ或ω构象的能力，主要形成高变区的主链构象。这些残基发现存在于高变区内位点和保守性β-折叠结构区。通过对具有未知结构的免疫球蛋白的序列进行分析，Chothia等发现许多免疫球蛋白具有大小与已知结构之一相似的高变区，另外在形成保守性构象的位点含有相同的残基。
这些发现表明，这些高变区具有与已知结构的高变区近似的构象。对于五种高变区，全部构象似乎限于相对少数的不连续结构类中。这些高变区常见的主链构象被称为″典范类″。Chothia等(Nature.1989年12月21-28日；342(6252)877-83)和其他人(Martin，等，J Mol Biol.1996年11月15日；263(5)800-15)的进一步研究证实，在六种抗体高变区中至少五种，只存在少数几种主链构象。
分析上述各抗体，以确定各抗体互补决定区(CDR)的典范类。已知的是，只有抗体重链的CDR1和CDR2以及抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3确定了典范类。下表(35和36)总结了分析结果。典范类数据的形式为*HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR3，其中″HCDR″指重链CDR，″LCDR″指轻链CDR。因此，例如典范类为1-3-2-1-5是指一抗体，其HCDR1落入典范类1，其HCDR2落入典范类3，其LCDR1落入典范类2，其LCDR2落入典范类1，其LCDR3落入典范类5。
当抗体氨基酸与定义某典范类的氨基酸有70％或更多相同时，即将该抗体归属于该典范类。当相同性低于70％时，典范类归属以星号(″*″)标出，表明是根据各CDR长度和总体数据而估计的最适合的典范类。确定各抗体的氨基酸可以在例如以上引用的Chothia等的文章中发现。
表35




实施例12通过表达和与TNF-α表位结合实验对抗TNF-α抗体进行功能区分析测序/分箱结果免疫球蛋白链的可变(V)区由多个种系DNA片段编码，在B细胞个体发育期间连接成为功能性可变区(VHDJH或VKJK)。详细研究了TNFα抗体应答的分子和遗传多样性。这些实验揭示了几个针对抗TNFα的特异性点。分析65个TNFα特异性抗体，发现13个种系VH基因，抗体中有54个来自VH3家族，其中34个使用VH3-33基因片段。频率最高的基因，即VH3-33种系基因，在分析的65个抗体中的34个中均有表达，并且仅限于两个不同的箱(bin)，所述箱与结合所涉及的轻链类型(κA30对L2或λ)有明显联系。分箱和功能性抗体选择表明，特定箱中的抗体表达相同的IgVH，某些情况下表达相同的VHDJH重排。而且还发现，H和L链对在箱内保守。这些发现表明，对于任何给定的表位，只有少数种系的成员用于形成相应的互补位(paratope)，对于各抗原表位，有限数量的L和H链可配对形成特异性互补位。
人源TNFα的生物相关表位的位置是通过人源TNFα特异性单克隆抗体的表达，以及其与一组嵌合人/鼠TNFα分子的结合实验来确定。上述抗体落在4个大分箱组中，并与对hTNFα生物活性起关键作用的几个位点有联系。TNFα的N-末端区发现涉及受体结合。
在第一组抗体中，抗体通过直接结合TNFα受体结合区来中和TNFα活性，所述抗体全部识别分泌的TNFα分子中前36个残基中的序列。结果显示两种受体结合相同的N-末端区。Van Ostade等((1993)nature，361266-269)报道P75受体结合区定域在分子基部的环上，位置29和32的单个氨基替换可降低与p75受体的结合活性。第一组中的抗体(VH3-33/JH6b与κ链A30/JK4偶联)都具有典范类1-3-2-1-1。在有Lys11和Arg31时，所有实验抗体均显示与前36残基结合。表达与λ轻链偶联的VH3-33/Jh6b抗体则显示不同的特异性。
Van Ostade等((1991)EMBO 10827-836)通过无规突变诱变和定向诱变证实，氨基酸32-34、84-91、117-119和143-148等四个区的完整性对保持生物活性非常重要。使用与L2κ链偶联的VH3-33/JH4b抗体显示可识别TNFα分子中不同的非连续区域。这些抗体对人源TNFα具有高度特异性，它们的表位是位于TNF多肽上不同的、非邻接位置的一组残基。
第三组抗体包括使用与λ轻链偶联的VH3-33抗体，如单克隆抗体3.2。这组抗体的结合位点位于残基1到91之间。尽管替换Gln27和Arg31并不影响结合人源TNFα，但N-末端对结合活性显得非常重要。在下表36中提供结果。
表36



实施例13抗TNFα抗体和抗体缀合物在治疗关节炎中的应用为了验证抗TNFα抗体在治疗人类关节炎患者时的体内作用效果，人类患者每隔一定时间就注射一次有效量的抗TNFα抗体。患者在治疗过程中定期接受检查以确定其关节炎是否好转。
与使用对照抗体治疗的关节炎患者相比，使用抗TNFα抗体治疗的关节炎患者的关节炎症状，包括炎症水平减轻。可以使用的对照抗体包括与抗TNFα受试抗体同种型相同的抗体，并且这些抗体可能无法结合TNFα抗原。
实施例14抗TNFα抗体作为诊断试剂的用途在试样中检测TNFα抗原可以开发在试样中检测TNFα抗原的酶联免疫吸附测定法(ELISA)。实验中，微量滴定板(比如96孔微量滴定板或384孔微量滴定板)的孔使用针对抗原的一次完全人源单克隆抗体吸附几小时。固定的抗体作为针对任何存在于试样中的抗原的捕捉抗体。将孔冲洗并以牛乳蛋白或白蛋白等阻断剂处理，以防止分析物的非特异性吸附。
随后，使用可能含有抗原的试样或者含有标准量抗原的溶液处理滴定孔。该试样可以是，例如，从怀疑为具有病理诊断意义的一定循环抗原水平的个体上取得的血清试样。
冲洗掉试样或标准溶液之后，使用生物素缀合物标记的二次完全人源单克隆抗TNFα抗体处理滴定孔。标记的抗TNFα抗体用作检测抗体。冲洗掉多余的二次抗体之后，使用与亲和素结合的辣根过氧化酶(HRP)和适当的显色底物处理滴定孔。从标准试样得到标准曲线，与之相比即可确定试样中抗原的浓度。
这种ELISA实验为检测试样中的TNFα抗原提供了高特异性、高灵敏度的方法。
检测患者体内TNFα抗原浓度夹心ELISA法被开发出来用以定量检测人血清中TNFα水平。夹心ELISA法中两种完全人源单克隆抗TNFα抗体可识别TNFα分子上的不同表位。该ELISA法以如下步骤进行以50μL含2μg/mL捕捉抗TNFα抗体的包被缓冲液(0.1M NaHCO3，pH9.6)包被ELISA板(Fisher)。4℃下温育过夜之后，使用200μL封闭缓冲液(0.5％BSA，0.1％Tween 20，0.01％硫柳汞溶于PBS)25℃下将板处理1小时。使用0.05％Tween 20的PBS溶液(洗涤缓冲液，WB)将板冲洗三次。正常或患者血清(Clinomics，Bioreclaimation)在含50％人血清的封闭缓冲液中稀释。板在4℃下与血清试样温育过夜，使用WB冲洗，然后在25℃下与100μL/孔的生物素化检测抗TNFα抗体温育1小时。冲洗，板与HRP-链亲和素温育15分钟，如上冲洗，再以100μL/孔的邻苯二胺的双氧水溶液(Sigma显影液)处理以显示颜色。加入50μL/孔的H2SO4(2M)终止反应，使用ELISA分析仪在492nm读数。通过使用四参数曲线拟合程序对比纯化TNFα抗原的稀释液，可计算出血清试样中TNFα抗原的浓度。
等同物以上所写说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。以上叙述和实施例详述了本发明特定的优选实施方案，记载了发明者认为的最佳方式。然而应该注意到，不管前文叙述有多详细，本发明可有多种途径实施，本发明应该根据所附权利要求书及其任何等同物解释。
序列表<110>阿布格尼克斯公司J.S.巴布科克J.S.康O.富尔德L.格林X.冯S.克莱坎普M.哈克-弗兰德肖P.拉塞纳斯万米C.皮戈特M.L.梁R.李K.曼丘伦乔R.法吉尼G.森诺迪J.S.巧娟<120>针对肿瘤坏死因子的抗体及其用途<130>ABGENIX.073VPC<140>未知<141>2003-12-02<150>60/430729<151>2002-12-02<160>320<170>Windows版FastSEQ，版本4.0<210>1<211>384<212>DNA<213>人<400>1caggtgcagt tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggaacatct attacagtgg gagcacctac 180
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gctatcctta ggggctacta ctactacgat atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360accgtctcct ca 372<210>38<211>124<212>PRT<213>人<400>38Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr20 25 30Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Glu Thr Ala Ile Leu Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asp Met Asp100 105 110Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>39<211>321<212>DNA<213>人<400>39gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120gggaaagccc ctaagcgcct gatctctgct gcatccagtt tgcaaggtgg ggtcccatca 180aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt accctctcac tttcggcgga 300gggaccaagg tggagatcaa a 321<210>40<211>107<212>PRT<213>人
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atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120gggaaagccc ctaagtgcct gatctatgtt gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt acccgctcac tttcggcgga 300gggaccaagg tggagatcaa a 321<210>256<211>107<212>PRT<213>人<400>256Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp20 25 30Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Cys Leu Ile35 40 45Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Leu85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>257<211>348<212>DNA<213>人<400>257gaggtgcaac tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aattatggca tgaactgggt ccgccaggct 120ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac ataagtaata gtattacttc caaatactac 180gctgactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ttcactgtat 240ctgcaaatga acagcctgag agacgtggac acggctgtgt atcactgtgc gagaggaccg 300ggcgggtttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 348<210>258<211>116<212>PRT
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Ala Lys Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr His Pro Phe Asp Tyr Trp100 105 110Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>263<211>321<212>DNA<213>人<400>263gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgcc gggcgagtca gggcattagc aattatttag cctggtatca acagaaacca 120gggaaagttc ctaagttcct gatctatgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct 180cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccgtcagcag cctgcagcct 240gaagatgttg caacttatta ctgtcaaatg tataacagtg tcccattcac tttcggccct 300gggaccaaag tggatatcaa a 321<210>264<211>107<212>PRT<213>人<400>264Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Phe Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Met Tyr Asn Ser Val Pro Phe85 90 95Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105<210>265<211>157<212>PRT
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<221>变体<222>101，102<223>Xaa＝任何氨基酸<400>275Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly1 5 10 15Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser20 25 30Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Trp Asn Trp Asp Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly85 90 95Thr His Trp Pro Xaa Xaa Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu100 105 110Ile Lys<210>276<211>111<212>PRT<213>人<400>276
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<221>变体<222>98<223>Xaa＝任何氨基酸<400>280Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser100 105<210>281<211>109<212>PRT<213>人<400>281Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser100 105<210>282
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<211>108<212>PRT<213>人<400>286Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn20 25 30Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser100 105<210>287<211>109<212>PRT<213>人<400>287Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser100 105<210>288
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<211>109<212>PRT<213>人<400>296Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser100 105<210>297<211>108<212>PRT<213>人<400>297Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn20 25 30Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser100 105<210>298
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<211>107<212>PRT<213>人<400>310Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Ile85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys100 105<210>311<211>110<212>PRT<213>人<400>311Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln1 5 10 15Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn20 25 30Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu35 40 45Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln65 70 75 80Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu85 90 95Ser Ala Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110<210>312
<211>107<212>PRT<213>人<400>312Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>313<211>107<212>PRT<213>人<400>313Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>314
<211>107<212>PRT<213>人<400>314Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Phe85 90 95Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105<210>315<211>110<212>PRT<213>人<400>315Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln1 5 10 15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn20 25 30Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu35 40 45Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln65 70 75 80Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu85 90 95Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110<210>316
<211>108<212>PRT<213>人<400>316Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His85 90 95Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105<210>317<211>108<212>PRT<213>人<400>317Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln1 5 10 15Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala20 25 30Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Gly Asn His85 90 95Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105<210>318
<211>107<212>PRT<213>人<400>318Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Ile85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys100 105<210>319<211>108<212>PRT<213>人<400>319Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His85 90 95Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105<210>320
<211>111<212>PRT<213>人<400>320Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln1 5 10 15Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly20 25 30Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu35 40 45Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser85 90 95Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110
权利要求
1.一种与肿瘤坏死因子-α特异性结合的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列″Ser Tyr Asp Met His″的重链互补决定区1(CDR1)。
2.根据权利要求1所述的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列″Val IleTrp Ser Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly″的重链互补决定区2(CDR2)。
3.根据权利要求2所述的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列″GluVal Glu Ser Ala Met Gly Gly Phe Tyr Tyr Asn Gly Met Asp Val″的重链互补决定区3(CDR3)。
4.根据权利要求1所述的人源单克隆抗体，包括包含如SEQ ID NO70所示氨基酸序列的重链氨基酸。
5.根据权利要求1所述的人源单克隆抗体，包括包含如SEQ ID NO74所示氨基酸序列的重链氨基酸。
6.根据权利要求1所述的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列″ArgAla Ser Gln Gly Ile Arg Ile Asp Leu Gly″的轻链互补决定区1(CDR1)。
7.根据权利要求6所述的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列″AlaAla Ser Thr Leu Gln Ser″的轻链互补决定区2(CDR2)。
8.根据权利要求7所述的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列″LeuGln His Lys Ser Tyr Pro Leu Thr″的轻链互补决定区3(CDR3)。
9.根据权利要求6所述的人源单克隆抗体，包括包含如SEQ ID NO72所示氨基酸序列的轻链氨基酸。
10.一种与肿瘤坏死因子-α特异性结合的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列″Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ile Asp Leu Gly″的轻链互补决定区1(CDR1)。
11.根据权利要求10所述的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列“AlaAla Ser Thr Leu Gln Ser”的轻链互补决定区2(CDR2)。
12.根据权利要求11所述的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列“LeuGln His Lys Ser Tyr Pro Leu Thr”的轻链互补决定区3(CDR3)。
13.根据权利要求10所述的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列“SerTyr Asp Met His”的重链互补决定区1(CDR1)。
14.根据权利要求13所述的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列“ValIle Trp Ser Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly”的重链互补决定区2(CDR2)。
15.根据权利要求14所述的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列″GluVal Glu Ser Ala Met Gly Gly Phe Tyr Tyr Asn Gly Met Asp Val″的重链互补决定区3(CDR3)。
16.一种与肿瘤坏死因子-α特异性结合的人源单克隆抗体，包括VH3-33重链基因，或其保守性变体。
17.根据权利要求16所述的人源单克隆抗体，包括A30VK1轻链基因。
18.一种与肿瘤坏死因子-α特异性结合的人源单克隆抗体，其中，抗体包括与典范类1对应的重链互补决定区1(CDR1)。
19.根据权利要求18所述的人源单克隆抗体，其中，所述抗体包括与典范类3对应的重链互补决定区2(CDR2)。
20.根据权利要求19所述的人源单克隆抗体，其中，所述抗体包括与典范类2对应的轻链互补决定区1(CDR1)。
21.根据权利要求20所述的人源单克隆抗体，其中，所述抗体包括与典范类1对应的轻链互补决定区2(CDR2)。
22.根据权利要求21所述的人源单克隆抗体，其中，所述抗体包括与典范类1对应的轻链互补决定区3(CDR3)。
23.一种与肿瘤坏死因子-α特异性结合的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列″Arg Asn Tyr Met Ser″的重链互补决定区1(CDR1)。
24.根据权利要求23所述的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列″ValIle Tyr Ser Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly″的重链互补决定区2(CDR2)。
25.根据权利要求24所述的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列″GlyGlu Gly Gly Phe Asp Tyr″的重链互补决定区3(CDR3)。
26.根据权利要求23所述的人源单克隆抗体，包括包含如SEQ ID NO50所示氨基酸序列的重链氨基酸。
27.根据权利要求23所述的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列″ArgAla Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala″的轻链互补决定区1(CDR1)。
28.根据权利要求27所述的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列″GlyAla Ser Ile Arg Ala Thr″的轻链互补决定区2(CDR2)。
29.根据权利要求28所述的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列″GlnGln Tyr Asn Tyr Trp Trp Thr″的轻链互补决定区3(CDR3)。
30.根据权利要求23所述的人源单克隆抗体，包括包含如SEQ ID NO52所示氨基酸序列的轻链氨基酸。
31.一种与肿瘤坏死因子-α特异性结合的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列″Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala″的轻链互补决定区1(CDR1)。
32.根据权利要求31所述的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列″GlyAla Ser Ile Arg Ala Thr″的轻链互补决定区2(CDR2)。
33.根据权利要求32所述的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列″GlnGln Tyr Asn Tyr Trp Trp Thr″的轻链互补决定区3(CDR3)
34.根据权利要求31所述的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列″ArgAsn Tyr Met Ser″的重链互补决定区1(CDR1)。
35.根据权利要求34所述的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列″ValIle Tyr Ser Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly″的重链互补决定区2(CDR2)。
36.根据权利要求35所述的人源单克隆抗体，包括具有氨基酸序列″GlyGlu Gly Gly Phe Asp Tyr″的重链互补决定区3(CDR3)。
37.一种与肿瘤坏死因子-α特异性结合的人源单克隆抗体，包括VH3-53重链基因，或其保守性变体。
38.根据权利要求37所述的人源单克隆抗体，包括L2VK3轻链基因。
39.一种与肿瘤坏死因子-α特异性结合的人源单克隆抗体，其中，抗体包括与典范类1对应的重链互补决定区1(CDR1)。
40.根据权利要求39所述的人源单克隆抗体，其中，所述抗体包括与典范类1对应的重链互补决定区2(CDR2)。
41.根据权利要求40所述的人源单克隆抗体，其中，所述抗体包括与典范类2对应的轻链互补决定区1(CDR1)。
42.根据权利要求41所述的人源单克隆抗体，其中，所述抗体包括与典范类1对应的轻链互补决定区2(CDR2)。
43.根据权利要求42所述的人源单克隆抗体，其中，所述抗体包括与典范类3对应的轻链互补决定区3(CDR3)。
44.一种在患者样品中，检测肿瘤坏死因子-α(TNFα)水平的方法，包括，将权利要求1或23中所述的抗TNFα抗体与采自患者的生物样品接触，检测所述抗体与所述样品中的TNFα之间的结合水平。
45.根据权利要求44所述的方法，其中生物样品为血液。
46.一种组合物，包括权利要求1或23所述的抗体，或其功能性片段，和可药用的载体。
47.一种对患有肿瘤疾病的动物进行有效治疗的方法，包括选择需要治疗肿瘤疾病的动物；和向所述动物给药治疗有效剂量的权利要求1或23的完全人源单克隆抗体，其中所述抗体与肿瘤坏死因子-α(TNFα)特异性结合。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述肿瘤疾病选自乳癌，卵巢癌，膀胱癌，肺癌，成胶质细胞瘤，胃癌，子宫内膜癌，肾癌，结肠癌，胰腺癌和前列腺癌。
49.一种有效治疗免疫介导的炎性疾病的方法，包括选择需要治疗炎性疾病的动物；和向所述动物给药治疗有效剂量的权利要求1或23所述的完全人源单克隆抗体，其中所述抗体与肿瘤坏死因子-α(TNFα)特异性结合。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述免疫介导的炎性疾病选自类风湿性关节炎，血管球性肾炎，动脉粥样硬化，牛皮癣，再狭窄，自身免疫病，克罗恩氏病，移植物抗宿主反应，败血症休克，恶病质，厌食，强直性脊柱炎和多发性硬化。
51.一种在动物中抑制肿瘤坏死因子-α(TNFα)诱导的凋亡的方法，包括选择需要对TNFα诱导的凋亡进行治疗的动物；和向所述动物给药治疗有效剂量的权利要求1或23所述的完全人源单克隆抗体，其中所述抗体与TNFα特异性结合。
52.权利要求1或23所述的抗体在制备治疗动物肿瘤疾病的药物中的用途，其中所述单克隆抗体与肿瘤坏死因子(TNFα)特异性结合。
53.根据权利要求52所述的用途，其中所述肿瘤疾病选自乳癌，卵巢癌，膀胱癌，肺癌，成胶质细胞瘤，胃癌，子宫内膜癌，肾癌，结肠癌，胰腺癌和前列腺癌。
54.权利要求1或23所述的抗体在制备有效治疗动物免疫介导的炎性疾病的药物中的用途，其中所述单克隆抗体与肿瘤坏死因子(TNFα)特异性结合。
55.根据权利要求54所述的用途，其中所述免疫介导的炎性疾病选自类风湿性关节炎，血管球性肾炎，动脉粥样硬化，牛皮癣，再狭窄，自身免疫病，克罗恩氏病，移植物抗宿主反应，败血症休克，恶病质，厌食和多发性硬化。
56.权利要求1或23所述的抗体在制备有效治疗动物肿瘤坏死因子诱导的凋亡的药物中的用途，其中所述单克隆抗体与肿瘤坏死因子(TNFα)特异性结合。
全文摘要
针对抗原TNFα的抗体及此抗体的用途。特别是针对抗原TNFα的完全人源单克隆抗体。编码以下序列的核苷酸序列和含有以下序列的氨基酸序列免疫球蛋白分子的重链和轻链，特别是与跨越框架区和/或互补决定区(CDR)的邻近重链和轻链序列相应的序列，具体是从FR1到FR4或从CDR1到CDR3。表达这些免疫球蛋白分子和单克隆抗体的杂交瘤或其他细胞系。
文档编号A61K39/395GK1745101SQ200380109456
公开日2006年3月8日 申请日期2003年12月2日 优先权日2002年12月2日
发明者J·S·巴布科克, J·S·康, O·富尔德, L·格林, X·冯, S·克莱坎普, M·哈克-弗兰德肖, P·拉塞纳斯万米, C·皮戈特, M·L·梁, R·李, K·曼丘伦乔, R·法吉尼, G·森诺迪, J·S·巧娟 申请人:阿布格尼克斯公司