专利名称：黄烷醇和矢车菊苷配质促进内环境稳定的制作方法
技术领域：
本发明涉及鉴定人或者兽医动物的细胞因子反应性的筛选方法和其中所用的产物和测定法，其含有黄烷醇和矢车菊苷配质或者它们的混合物，还涉及诊断人和兽医动物中细胞因子表型的方法；鉴定处于与炎症和/或免疫调节途径有关的病症的危险中的受试者的方法；鉴定饮食和/或药物干预以调节与炎症和/或免疫调节途径有关的病症的方法；和用所选的黄烷醇和矢车菊苷配质或者它们的混合物预防性或者治疗性治疗人或者兽医动物的方法。
背景黄烷醇和矢车菊苷配质已经表现出调节与血管健康有关的多种因子的潜力。所述潜力包括抗氧化作用(Lotito LB等人，BiochemBioplzys Res Commun 2000；276945-951，Arteel和Sies，FEBS Lett 1999；462167-170；Sanbongi等人，Cell Immunol 1997；177s 129-136)，调节细胞因子产生(Mao等人，J Medicinal Foods 2002；517-22；Mao等人，Life Sciences 2000；661377-1386；Mao等人，Medicinal Foods 2000；3107-114)，调节类十二烷酸和NO和过硝酸盐水平和一般的抗炎特征(Osakabe等人，Biosci Biotechnol Biochem1998；621535-1538；Arteel和Sies，FEBSLett 1999；462167-170)。还公开了黄烷醇和矢车菊苷配质的其他有益作用，例如，作为抗血小板和抗微生物剂，和用于癌症治疗(美国专利号5,554,645和6,297,273)。
TGF-β1是心血管系统的强力调节剂，从而大量研究致力于操纵其产生和用于治疗目的的活性。已经提出了多种试剂用于增加TGF-β1的产生。Metcalfe等人提出它莫西芬减小了脂质病变的形成，这部分是通过摄入高脂肪食物的小鼠中TGF-β1的循环浓度上升所致(Densem等人，J Heart Lung Trans 2000；19551-556)；而与此吻合的是，Diurovic报导经历激素替代疗法的绝经后妇女显示出TGF-β1的血浆浓度增加，表明用于减小心血管疾病的危险的可能方法(Grainger等人，Nat Med 1995；11067-1073)。TGF-β1的拮抗剂的发现可能在治疗纤维样变性疾病中有用。核心蛋白聚糖——TGFβ1的天然抑制剂——已经成功地用于抑制大鼠肾中TGF-β1介导的组织纤维样变性(Isaka等人，Nat Med 1996；2418-423)。此外，已经报导一种食用植物多酚白藜芦醇具有针对血管平滑肌细胞中功能异常的保护作用，这部分是由于白藜芦醇能够抑制TGF-β1mRNA(Mizutani等人，Biochem Biophys Res Comm 2000；27461-67)。考虑到TGF-β1的重要性，需要其他方法用以调节人或者兽医动物的体内TGF-β1应答。
申请人现在已经令人惊奇地发现黄烷醇和矢车菊苷配质及它们的混合物能够促进细胞因子内环境稳定，包括TGF-β1内环境稳定，并且可用作筛选工具以鉴定受试者中细胞因子反应性，包括TGF-β1反应性或者确定所述细胞因子反应性的表型。这使得内科医生、临床医生和兽医以及营养学家以鉴定受试者(人或者兽医动物)为处于与炎症或者免疫调节途径有关的病症，如心血管疾病、关节炎和癌症的低或者高危险性中，并且可以根据所述受试者的表型设计适宜的饮食和/或药物干预。
发明概述本发明涉及黄烷醇和/或矢车菊苷配质，和它们的混合物的筛选、诊断、预防、治疗和营养应用，用于诊断、预防和/或治疗与炎症和/或者免疫调节途径有关的病症。本发明还涉及用于人和/或兽医动物的定制药物和/或饮食方案(即，干预)的设计，所述方案用于处理通过本文描述的筛选方法学鉴定的人或兽医动物的健康组织。
一方面，提供了使用黄烷醇和矢车菊苷配质，和它们的混合物鉴定人或者兽医动物中细胞因子反应性的筛选方法学和测定法。用于确定人或者兽医动物中身体样品中体外基线细胞因子水平的诊断测定法也在本发明的范围内。
另一方面，本发明涉及根据人或动物的表型(即，细胞因子反应性)设计人或者兽医动物的饮食和/或药物方案(即，干预)的方法，所述方案可有效防止或者治疗通过所述筛选方法学和测定法诊断的健康状况。在某些实施方案中，该方案可包括施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质，或它们的混合物。
在再一方面，提供了人或者兽医动物的预防或者治疗性治疗的方法，该方法包括基于人或者动物的细胞因子表型，即细胞因子反应性设计所述人或者兽医动物的饮食和/或药物方案，该方案可有效防止或者治疗通过所述筛选方法学和测定法诊断的健康状况。在某些实施方案中，根据该方案，所述预防/治疗包括施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质，或它们的混合物。
本发明还涉及确定未知具有细胞因子调节性质的多酚的治疗价值的方法，通过在含有至少一种低细胞因子产生者和至少一种高细胞因子产生者的身体样品的测定中体外试验所述多酚，并将身体样品与多酚孵育以确定低和高细胞因子产生者中的细胞因子水平是否受到多酚的存在的影响来实现所述治疗价值的测定。
附图简述
图1代表所试验的所有个体(n＝13)和它们对每种可可黄烷醇/矢车菊苷配质(FLO)级分的响应的散布图。每个空心圆代表个体的百分数改变(相对于基线对照)形式的值。
图2代表可可黄烷醇/矢车菊苷配质(FLO)对低基线细胞因子产生者中TGF-β1的分泌的影响。在单独的可可级分(25μg/ml)的存在下将PBMC孵育72小时后萃取上清液用于ELISA分析(平均±SEM；n＝7)。使用具有双尾p值的学生成对t检验将可可处理诱导的值与对照值(即，没有可可的中值基线)比较(*认为p＜0.05为显著)。
图3代表可可黄烷醇和矢车菊苷配质(FLO)对高基线细胞因子产生者中TGF-β1分泌的影响。在单独的可可级分(25μg/ml)的存在下将PBMC孵育72小时后萃取上清液用于ELISA分析(平均±SEM；n＝7)。使用具有双尾p值的学生成对t检验将可可处理诱导的值与对照值(即，没有可可的中值基线)比较(*认为p＜0.05为显著)。
发明详述将该申请中引用的所有专利、专利申请和参考文献并入本文作为参考。对于任何不一致的情况，以本公开为准。
本发明涉及黄烷醇和/或矢车菊苷配质，或它们的混合物的筛选、诊断、预防、治疗和营养应用，用作筛选工具以鉴定人或者兽医动物中细胞因子反应性，并且用于诊断、预防和/或治疗与炎症和/或者免疫调节途径有关的病症。本文中所用的“炎症途径”是哺乳动物的活机体在应答有害刺激和/或组织损伤中发生的生物化学途径。“免疫调节途径”是能够调节或者调整哺乳动物的活机体中免疫功能的生物化学途径。兽医动物的实例为猫、狗和马。
本发明还涉及用于人或兽医动物的定制药物和/或饮食方案(即，干预)的设计，所述方案用于处理通过本文描述的筛选方法学鉴定的人和/或兽医动物的健康组织。一旦鉴定了健康组织或者病症，就可以使用用于预防或者治疗病症的任何方法。在某些实施方案中，该方案可包括施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质，或它们的混合物。
化合物和组合物用于本发明的化合物为黄烷醇，如表儿茶酸、儿茶酸和它们的没食子酸形式，如表儿茶酸没食子酸和儿茶酸没食子酸。还可以使用矢车菊苷配质，其为了本申请的目的被定义为黄烷醇的寡聚体并且可以含有至少一种没食子酸化单体。矢车菊苷配质包括B型和A型矢车菊苷配质。
黄烷醇为单体化合物并且包括(+)儿茶酸、(-)表儿茶酸和它们各自的差向异构体(例如，(-)儿茶酸和(+)表儿茶酸)并且具有结构 矢车菊苷配质寡聚体可以具有2到约18，优选2到约12，最优选2到约10个单体单位。至少某些单体单位可以没食子酸化。例如，寡聚体可以是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体和十聚体。在B型寡聚体中，上面所示的单体通过(4→6)和/或(4→8)的黄烷间键连接。仅具有(4→8)键的寡聚体是线性的；而存在至少一个(4→6)键导致具有分枝的寡聚体。
通过下式代表线性寡聚体，其中n为0到16的整数 用下式代表分枝寡聚体的实例，其中A和B独立地为1到15的寡聚体，在最终寡聚体中A和B的和为3到18
本发明中还可以使用A型矢车菊苷配质，即含有C2-O-C7和C4→C8或者C4→C6的双连接的寡聚体(含有上述单体)。
用于本发明中的化合物可以是天然来源或者合成制备。天然发生的化合物可以从含有多种多酚的化合物，例如，从可可、葡萄种子、花生、蔓越橘、苹果和其他来源分离。本领域中技术人员基于可用性和/或成本选择天然或者合成化合物。
为了简单起见，将从可可得到的用于本发明的黄烷醇和矢车菊苷配质在此处称为“可可多酚”(CP)。CP可来源于可可豆、可可粒或者可可成分。术语“可可成分”指来源于无壳的可可粒的含有可可固体的物质，如巧克力液体和部分或者完全脱脂的可可固体(例如，蛋糕或者粉剂)。CP可以以可可成分、提取物、提取级分或者合并的提取级分包含在本发明的组合物中。
通过从可可豆、可可粒或者可可成分，如巧克力液体和部分脱脂的可可固体，和/或者完全脱脂的可可固体制备可可多酚。优选地，从完全或者部分脱脂的可可粉制备提取物。可以使用来自可可属(Theobroma)的任何种(例如，T.cacao和T.grandiflorum)、Herrania或者它们的种间和种内杂种的可可豆。可以从经发酵、发酵不足或者未发酵的豆制备提取物，所发酵的豆具有最少量的可可多酚，未发酵的具有最多可可多酚。豆的选择可以基于豆的发酵因子，例如，可以从发酵因子为275或者更小的豆制备提取物。可以如国际专利申请号PCT/US97/15893(以WO98/09533出版，相应于美国专利号6,015,913，这里引用其相关部分作为参考)中描述的通过控制发酵的程度优化可可成分中多酚水平和其提取。
可以从可可成分提取可可多酚，其中已经使用可可加工的常规方法(例如，在Industrial Chocolate Manufacture and Use，编者Beckett，S.T.，Blackie Acad.& Professional，New York，1997，如1、5、和6章中描述)或者Kealey等的美国专利号6,015,913中描述的改良加工方法加工了所述可可成分，所述改良方法与常规加工方法相比通过防止多酚破坏而保存了多酚。所述改良可可加工方法省略了常规的焙烧步骤。从而，可以使用通过(a)将可可豆加热一定时间和温度，其足够使可可壳变松而不焙烧可可粒；(b)从可可壳风选可可粒；(c)螺旋压榨可可粒和(d)回收可可油和部分脱脂的可可固体，其合有可可多酚的保存水平得到的可可成分。该方法比常规方法保留高得多的矢车菊苷配质寡聚体。通过该方法产生的可可固体可以含有每克脱脂固体20,000μg总矢车菊苷配质；优选大于25,000μg/g，更优选大于28,000μg/g，最优选大于30,000μg/g。为了本发明的目的，如Hammerstone等人，(J.Agric.Food Chem.，472490-496，1999)描述的确定总矢车菊苷配质量，本文引用该文献作为参考。
可以使用溶剂从上面所述来源提取可可多酚，其中多酚溶于所述溶剂中。适宜的溶剂包括水或者有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇和乙酸乙酯。可以使用溶剂混合物。当用水作为溶剂时，可以将其用例如乙酸轻微酸化。优选溶剂为水和有机溶剂，例如，水性甲醇、乙醇或者丙酮的混合物。水性有机溶剂可以含有，例如，约50％到约95％有机溶剂。从而，可以使用水中的50％、60％、70％、80％和90％有机溶剂。该溶液还可以含有少量酸，如乙酸，例如，量为约0.5％到约1.0％。提取物的组成，即表现度(即寡聚体图)和矢车菊苷配质寡聚体的量将取决于溶剂的选择。例如，水提取物主要含有单体，乙酸乙酯提取物含有单体和低级寡聚体，主要为二聚体和三聚体，水性甲醇、乙醇或者丙酮提取物含有单体和一系列高级寡聚体。用于提取单体和高级矢车菊苷配质寡聚体的优选溶剂之一是70％丙酮。然而，在本发明中可以使用含有多酚的任何提取物。可可多酚提取的方法是本领域中公知的并且在例如，美国专利号5,554,645(Romanczyk等人)和国际申请号PCT/US97/05693(以WO97/36497出版)中描述，这里引用这两篇文献作为参考。从而，在一个实施方案中，通过将可可豆减小为可可粉，将其脱脂，提取可可多酚，并纯化该提取物制备可可提取物。将可可豆和浆冷冻干燥，将冷冻干燥的可可豆去浆和去壳，并研磨去壳的豆可以制备可可粉。
例如，通过除去咖啡因和/或可可碱，并通过凝胶渗透层析和/或高压液相层析(HPLC)可以纯化可可多酚提取物。例如，可以使用凝胶渗透层析(例如，在Sephadex LH-20上)富集高级矢车菊苷配质寡聚体的提取物。例如，直到所选的寡聚体开始从柱子洗脱才可以收集含有单体和低级寡聚体的洗脱物。这种提取的一个实例是本领域中公知的并且在国际专利申请PCT/US97/05693(以WO97/36497出版，现在为美国专利号6,297,273，将其相关部分并入本文作为参考)的实施例5中描述。通过使用制备HPLC，例如，正相HPLC，可以将提取物分级分离成单体级分和含有按重量计至少50％单体或者特定寡聚体的寡聚体级分。当级分含有单体和低级寡聚体(最多并且包括四聚体)时，所述级分含有按重量计约90到95％的特定寡聚体级分。可以将所希望的级分分离后合并以得到所选寡聚体的联合，例如，得到寡聚体3-10或5-10。本领域技术人员考虑本说明书的指导、本领域中的一般知识和，例如，美国专利号5,554,645(Romanczyk等人)和国际申请号PCT/US97/05693(以97/36497出版，现在为美国专利号6,297,273)，WO可以操纵层析条件以实现所希望的矢车菊苷配质图。
通过含有多酚的可可成分，或者通过包括巧克力，可以在本发明的组合物中提供可可多酚，所述巧克力可以是奶、甜食和半甜食，并且优选为暗色巧克力，和低脂巧克力。可可成分可以通过使用常规可可加工方法制备，但是优选使用Kealey等人的美国专利号6,015,913中描述的方法制备。备选地，为了提高可可多酚的水平，可以使用从发酵因子为275或者更小的可可豆制备的可可液体和可可固体。这些成分的可可多酚含量高于使用常规可可加工方法(例如，使用焙烧)和完全发酵的可可豆得到的可可多酚含量。使用常规技术从上述成分可以制备巧克力或者使用如国际申请号PCT/US99/05414(以WO99/45788出版，现在为美国专利号6,399,139，将其相关部分并入本文作为参考)描述改良方法以在巧克力生产期间保存可可多酚也可以制备巧克力。通过下面的非常规方法的至少一种制备的巧克力在本文中优选称为“具有保存量的可可多酚的巧克力”(i)从发酵不足或者未发酵的可可豆制备；(ii)在可可成分生产过程中保存可可多酚；和(iii)在巧克力生产过程中保存可可多酚。
也可使用合成矢车菊苷配质并且其通过本领域中公知的方法制备并且如例如在国际申请号PCT/US98/21392(以WO99/19319出版，现在为美国专利号6,207,842，将其相关部分并入本文作为参考)描述。
黄烷醇和矢车菊苷配质的衍生物也可用于本发明中。这些衍生物包括没食子酸化单体和寡聚体、糖基化单体和寡聚体、和它们的混合物；单体和寡聚体的代谢物，如硫酸化、葡糖醛酸化和甲基化形式；和由结肠微生物群落代谢或者内在的哺乳动物代谢产生的矢车菊苷配质的酶切割产物。所述衍生物的实例和它们的产生方法是本领域中众所周知的，如例如，在国际申请号PCT/US00/335331(以WO01/41775出版，将其相关部分并入本文作为参考)中描述。所述衍生物可以来源于天然来源或者合成制备。
筛选和诊断测定法本发明的黄烷醇和矢车菊苷配质可以用作筛选工具以鉴定受试者、人或者兽医动物中的细胞因子反应性，从而用黄烷醇和矢车菊苷配质治疗。确定受试者的细胞因子反应性的重要优点取决于基于个体设计药物和/或饮食干预的能力。
细胞因子包括白介素、淋巴因子、趋化因子、TNF、干扰素和TGF。在一个实施方案中，细胞因子为TGF beta[此处“TGF-β”]，例如，TGF beta 1[此处“TGF-β1”]。细胞因子的实例为IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、和TNF-α(alpha)。与这些细胞因子有关的疾病或者病症的诊断和治疗在本发明的范围内。
用于鉴定人或者兽医动物中细胞因子反应性的筛选测定法包括(i)体外确定人或者兽医动物的身体样品中基线细胞因子水平，其中所述细胞因子与炎症和/或免疫调节途径有关；和(ii)在足够诱导细胞因子水平改变的条件下，将所述身体样品与一系列黄烷醇和矢车菊苷配质，或者它们的混合物孵育，并测量所得细胞因子水平。该测定法可以还包括将基线细胞因子水平与步骤(ii)中所得细胞因子水平比较以确定人或者兽医动物中对黄烷醇和矢车菊苷配质的细胞因子反应性。
本文中所用的“基线细胞因子水平”指当人或者兽医动物未受到经设计用于调节或者导致调节该细胞因子水平的任何饮食或者药物治疗时，体外确定的所述人或者兽医动物的身体中的细胞因子水平。
使用如实施例2中描述的测定法可以鉴定细胞因子反应性。从而，从受试者、人或者兽医动物得到血液；分离外周血单核细胞(PBMB)并将其与单独的黄烷醇和矢车菊苷配质孵育。在加入黄烷醇和矢车菊苷配质之前和之后测量培养上清液中所分泌的细胞因子，例如，TGF-β1的水平。使用一系列单独试验的个体黄烷醇和矢车菊苷配质，例如，如实施例2中所示的单体、二聚体到十聚体，或者备选地，使用单一试验样品中的黄烷醇和矢车菊苷配质的混合物可以鉴定细胞反应性。适宜的混合物是含有黄烷醇和矢车菊苷配质寡聚体2-18，例如，单体和寡聚体2-10的可可提取物。也可以使用适于测量黄烷醇和矢车菊苷配质对身体样品中细胞因子分泌和/或水平的影响的其他测定法。
分析结果以确定细胞因子对黄烷醇和矢车菊苷配质的反应性。例如，对每种试验的黄烷醇和矢车菊苷配质，或者在备选方法中，对黄烷醇/矢车菊苷配质混合物计算细胞因子分泌相对于受试者的基线水平的百分数改变。结果为三倍重要性。
首先，可以将受试者鉴定为低基线细胞因子产生者或者高基线细胞因子产生者。这点是重要的，因为仅通过观察该受试者的基线细胞因子水平不能鉴定细胞因子反应性；需要使用黄烷醇和矢车菊苷配质的孵育步骤。从而，如果黄烷醇和矢车菊苷配质，或者它们的混合物增加基线细胞因子水平，那么将受试者鉴定为“低基线产生者”。相比，如果黄烷醇和矢车菊苷配质，或者它们的混合物降低基线细胞因子水平，那么将受试者鉴定为“高基线产生者”。如实施例2中所示，所有黄烷醇和矢车菊苷配质都具有细胞因子内环境稳定或者调节活性，即它们根据受试者的细胞因子表型增加或者降低(尽管程度不同)细胞因子水平。换句话说，相同的黄烷醇或矢车菊苷配质根据受试者的基线细胞因子水平可以降低或者增加细胞因子水平。例如，如关于TGF-β1所示，尽管某些黄烷醇和矢车菊苷配质在一种情况中比另一种情况中更具活性，但是每个个体中每种化合物的一般作用是相似的，因为它们刺激TGF-β1从低基线产生者释放，并抑制TGF-β1从高基线产生者分泌。
其次，根据细胞因子，鉴定受试者为低或者高细胞因子产生者可以诊断该受试者中以前未诊断的健康状况。其还提供了根据个体进行治疗的机会。从而，低基线细胞因子产生者可能需要增加细胞因子水平，高基线细胞因子产生者可能需要降低细胞因子水平，两者的目的都是促进内环境稳定。本文中公开的化合物可用于实现该作用。本领域中技术人员将理解，“内环境稳定”指生物的正常身体状态中稳定性的倾向，其通过控制机理体系实现。
再次，对治疗需要该治疗的受试者最有效的黄烷醇和/或矢车菊苷配质可以通过选择对基线细胞因子水平产生最显著作用的黄烷醇/矢车菊苷配质来鉴定。例如，在实施例2中，这些最有效的黄烷醇和/或矢车菊苷配质对于低基线产生者是单体和二聚体，对于高基线产生者是高级寡聚体。
上面描述的测定法可用于为任何细胞因子产生一组标准，细胞因子可以在许多受试者(包括低、正常和高细胞因子水平的那些受试者)之间试验它们对黄烷醇和矢车菊苷配质的应答。这些标准有助于根据受试者的基线细胞因子水平为该受试者设计饮食和/或药物方案——将受试者的基线细胞因子水平与所述标准相比并设计适宜的定制方案，例如，黄烷醇/矢车菊苷配质方案。当为一系列细胞因子得到时，所述标准尤其有用。根据基线细胞因子水平，可以设计饮食和/或药物方案以调节受试者中细胞因子水平，即促进人或者兽医动物的身体中细胞因子水平的内环境稳定。
如上面提到的，上面提到的筛选方法和测定法可进一步用于早期鉴定(诊断)处于与炎症和/或免疫调节途径有关的病症的危险中的受试者，甚至不存在可见的症状时也可鉴定。本领域技术人员可以基于与所述筛选测定中试验的细胞因子有关本领域中的知识鉴定这些病症。
例如，认为TGF-β1是参与多种生理过程的多功能蛋白质(Grainger和Metcalfe，The Endothelium in Clinical Practice，Rubanyi和Dzau，编著(Marcel Dekker Inc，New York)1997；203-243；Kenny等人，Am Heart J 1994；1271456-1461)。尤其，TGF-β1受到作为心血管保护的潜在介质的关注，因为Grainger和Metcalfe提出了他们的保护性细胞因子假说(Baxter等人，J Cardiovasc Phare 2001；38930-939，Mao等人，Int J Immunotherapy 1999；1523-29)。该假说基于如下证据TGF-β1保持动脉血管壁中内皮细胞和平滑肌细胞的正常生理表型，从而抑制内皮细胞的活化，以及抑制导致动脉粥样硬化剂诱导的平滑肌细胞的迁移、去分化和增殖。体内研究已经表明患有晚期动脉粥样硬化的受试者中TGF-β1的活性形式的水平下降(Baxter等人，J Cardiovasc Phare 2001；38930-939)，该结果支持TGF-β1作为动脉粥样硬化形成的抑制剂。另一方面，TGF-β1的过量产生可导致细胞外基质积累，这对于受伤的血管壁是不利的，因此导致心脏纤维样变性(Pearson等人，Methods Enzymol 2001；335350-360)。对TGF-β1和冠心病(CHD)之间关系的研究表明TGF-β1的活性形式的增加与CHD的发生和严重性有关(Grainger等人，HuMol Gen 1999；893-97)。此外，另一个研究表明高产生的TGF-β1基因型和心脏移植后冠状动脉病变的早发作相关(Wang等人，Cardiovasc Res 1997；34404-410)。最后，暗示TGF-β1是肾病/肾衰竭的主要因素。因此，在诊断测定中确定受试者中的异常基线细胞因子水平可以有助于受试者的早期诊断和治疗。从而，确定受试者中TGF-β1水平可以导致上面提到的疾病(例如，心血管疾病、冠心病、心脏纤维样变性、动脉粥样硬化、肾病/肾衰竭)的早期诊断和治疗。例如，使用本发明的筛选方法学，可以将人或者兽医动物(例如，猫、狗)诊断为具有血管和肾健康问题，如处于心血管疾病、冠心病、心脏纤维样变性、动脉粥样硬化、和/或肾病或衰竭的危险中或者患有心血管疾病、冠心病、心脏纤维样变性、动脉粥样硬化、和/或肾病或衰竭。
类似地，IL-4水平与变态反应、类风湿性关节炎(Gallagher等人，Curr.Opin.Rheumatol.，11(5)372-6，1999)和哮喘(Pauwels等人，Clin.Exp.Allergy，28Suppl.31-5，1998)和炎症免疫疾病(Rocken等人，Immunol Today 17(5)225-31，1996)有关。IL-4还可能在预防依赖胰岛素的糖尿病的发作中有作用(Cameron等人，Crit Rev Immunol17(5-6)537-44，1997)。IL-6的下调已经用于治疗炎性肠病(Rogler等人，World J Surg 22(4)382-9，1998)。IL-6在炎性皮肤病的诱导中起重要作用，表明IL-6产生的下调可以治疗该病症(Sawamura等人，J Immunol，161(10)5633-9，1998)。已经暗示IL-5作为在炎症和诸如哮喘和牙周病中起重要作用。并且TNFα与炎性肠病(Sandborn等人，Inflamm.Bowel Dis.5(2)，119-33，1999)和类风湿性关节炎(Ohshima等人，J Clin Immunol，19(5)305-13，1999)有关。使用本发明的筛选方法学可以在早期诊断与这些和其他细胞因子有关的病症。
饮食和药物方案的设计具体人或者兽医动物的饮食和/或药物方案或者干预可以基于该人或者动物的细胞因子表型，即，细胞因子产生进行定制设计，并且可以有利地优化用于预防性或治疗性治疗的方法。使用，例如，黄烷醇和/或矢车菊苷配质的施用可以实现所述预防性或治疗性治疗，然而，可以使用公知治疗与炎症和/或免疫调节途径有关的病症的其他预防或者治疗。
设计饮食和/或药物方案的方法通常包括(i)在体外确定人或者兽医动物的身体样品中基线细胞因子水平，其中所述细胞因子与炎症和/或免疫调节途径有关；和(ii)基于基线细胞因子水平设计用于保持该受试者的健康状况或者用于预防和/或治疗与炎症和/或免疫调节途径有关的病症的药物和/或饮食方案(取决于该受试者的状况)。在一个实施方案中，所述细胞因子是TGFβ，更具体地，TGF-β1。
该定制设计的方案可以保持、增加、或者减小人或者兽医动物中的基线细胞因子水平或者防止与炎症和/或免疫调节途径有关的健康状况的发展，或者治疗该健康状况。在某些实施方案中，所述药物和/或饮食方案将考虑施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质寡聚体。然而，可以使用公知预防与炎症和/或免疫调节途径有关的病症、预防所述病症的发展和/或治疗所述病症的任何其他方案。甚至本领域中公知的疗法也可以有利地和出乎意料地从确定所述受试者的细胞因子表型和反应性中受益。
该方法可以还包括用于鉴定细胞因子对黄烷醇和矢车菊苷配质的反应性(例如，TGFβ，更具体地TGFβ1反应性)的筛选测定法。可以如前面章节和实施例2中描述的实施该测定法。
在一个实施方案中，提供了设计人或者兽医动物的饮食和/或药物方案的方法，该方法包括(i)在体外确定人或者兽医动物的身体样品中基线细胞因子水平，其中所述细胞因子与炎症和/或免疫调节途径有关；(ii)基于基线细胞因子水平诊断该人或者兽医动物是否处于与炎症和/或免疫调节途径有关的病症的危险中或者患有该病症；和(iii)设计可有效预防性或者治疗性治疗步骤(ii)中诊断的病症的药物和/或饮食方案。该方案可以包括施用黄烷醇、矢车菊苷配质或者它们的混合物，但是也可以使用本领域中技术人员显而易见的其他方法。
在其他实施方案中，本发明提供了设计人或者兽医动物的饮食和/或药物方案的方法，该方法包括(i)在体外确定人或者兽医动物的身体样品中基线细胞因子水平，其中所述细胞因子与炎症和/或免疫调节途径有关；(ii)在足够诱导细胞因子水平变化的条件下将所述身体样品与一系列黄烷醇和矢车菊苷配质孵育，并测量所得细胞因子水平；(iii)将基线细胞因子水平与步骤(ii)中所得细胞因子水平比较以确定所述人或者兽医动物对黄烷醇和矢车菊苷配质的细胞因子反应性；和(iv)基于细胞因子反应性，设计促进所述人或者兽医动物中内环境稳定的细胞因子水平的药物和/或饮食方案；其中所述药物和/或饮食方案包括施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质寡聚体，或者它们的混合物。
本发明的范围内还包括设计人或者兽医动物的饮食和/或药物方案的方法，该方法包括(i)在体外确定人或者兽医动物的身体样品中基线细胞因子水平，其中所述细胞因子与炎症和/或免疫调节途径有关；(ii)在足够诱导细胞因子水平变化的条件下将所述身体样品与一系列黄烷醇和矢车菊苷配质孵育，并测量所得细胞因子水平；(iii)将基线细胞因子水平与步骤(ii)中所得细胞因子水平比较以确定所述人或者兽医动物对黄烷醇和矢车菊苷配质的细胞因子反应性；(iv)基于细胞因子反应性诊断该人或者兽医动物是否处于与炎症和/或免疫调节途径有关的病症的危险中或者患有该病症；和(v)设计可有效预防性或者治疗性治疗步骤(iv)中诊断的病症的药物和/或饮食方案。该药物和/或饮食方案可以包括施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质寡聚体，但是也可以使用其他适宜的方案。可以诊断的病症的实例为心血管疾病、冠心病、心脏纤维样变性、动脉粥样硬化、和/或肾病或肾衰竭。
根据人或者兽医动物是否需要增加、减小或者保持细胞因子水平设计方案，该方案包括施用所选的黄烷醇和/或矢车菊苷配质，或者它们的混合物。本发明还可用于具有正常基线细胞因子水平的受试者，因为施用此处描述的化合物的混合物可以预防以保持内环境稳定的细胞因子水平。例如，可以设计饮食或者药物方案，并且该方案包括使用低级和高级矢车菊苷配质寡聚体的混合物，所述混合物将保持基线细胞因子水平。
治疗方法预防性或者治疗性治疗人或者兽医动物的方法也在本发明的范围内。该方法包括基于如上述的人或者动物的细胞因子表型为所述人或者兽医动物设计饮食和/或药物方案，并根据该方案施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质。
在一个实施方案中，该方法提供了人或者兽医动物的预防性或者治疗性治疗，所述方法包括(i)在体外确定人或者兽医动物的身体样品中基线细胞因子水平，其中所述细胞因子与炎症和/或免疫调节途径有关；(ii)在足够诱导细胞因子水平变化的条件下将所述身体样品与一系列黄烷醇和矢车菊苷配质孵育，并测量所得细胞因子水平；(iii)将基线细胞因子水平与步骤(ii)中所得细胞因子水平比较以确定所述人或者兽医动物对黄烷醇和矢车菊苷配质的细胞因子反应性；(iv)基于细胞因子反应性，设计促进所述人或者兽医动物中内环境稳定的细胞因子水平的药物和/或饮食方案；其中所述药物和/或饮食方案包括施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质寡聚体；和(v)根据步骤(iv)中设计的药物和/或饮食方案对所述人或者兽医动物施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质寡聚体；或者它们的混合物。
还提供了人或者兽医动物的预防性或者治疗性治疗的方法，所述方法包括(i)在体外确定人或者兽医动物的身体样品中基线细胞因子水平，其中所述细胞因子与炎症和/或免疫调节途径有关；(ii)基于基线细胞因子水平诊断该人或者兽医动物是否处于与炎症和/或免疫调节途径有关的病症的危险中或者患有该病症；和(iii)设计可有效预防性或者治疗性治疗步骤(ii)中诊断的病症的药物和/或饮食方案；和(iv)根据步骤(iii)中设计的药物和/或饮食方案治疗所述人或者兽医动物。在某些实施方案中，该药物和/或饮食方案可以包括施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质寡聚体，但是也可以使用其他方法。所诊断的病症的实例为心血管疾病、冠心病、心脏纤维样变性、动脉粥样硬化、和/或肾病或肾衰竭。
另一实施方案包括人或者兽医动物的预防性或者治疗性治疗的方法，所述方法包括(i)在体外确定人或者兽医动物的身体样品中基线细胞因子水平，其中所述细胞因子与炎症和/或免疫调节途径有关；(ii)在足够诱导细胞因子水平变化的条件下将所述身体样品与一系列黄烷醇和矢车菊苷配质孵育，并测量所得细胞因子水平；(iii)将基线细胞因子水平与步骤(ii)中所得细胞因子水平比较以确定所述人或者兽医动物对黄烷醇和矢车菊苷配质的细胞因子反应性；(iv)基于基线细胞因子水平诊断所述人或者兽医动物是否处于与炎症和/或免疫调节途径有关的病症的危险中或者患有该病症；(v)设计可有效预防性或者治疗性治疗步骤(iv)中诊断的病症的药物和/或饮食方案；和(vi)根据步骤(v)中设计的药物和/或饮食方案治疗所述人或者兽医动物。该药物和/或饮食方案可以包括施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质寡聚体，但是也可以使用本领域中技术人员显而易见的其他方法。所要治疗的病症可以为心血管疾病、冠心病、心脏纤维样变性、动脉粥样硬化、和/或肾病或肾衰竭。
在更具体的实施方案中，考虑治疗低基线TGF-β1产生者和高基线TGF-β1产生者的方法。从而，下面的两种方法也在本发明的范围内(i)治疗受试者的方法，所述受试者为低基线TGF-β产生者，所述方法包括对该受试者施用至少一种黄烷醇和/或矢车菊苷配质寡聚体，其选自单体、二聚体、三聚体、四聚体和五聚体，或者它们的任何混合物，所用的量可有效刺激该受试者中TGF-β的水平，其中所述受试者为人或者兽医动物；和(ii)治疗受试者的方法，所述受试者为高基线TGF-β产生者，所述方法包括对该受试者施用至少一种矢车菊苷配质寡聚体6-10，或者它们的任何混合物，所用的量可有效刺激该受试者中TGF-β的水平，其中所述受试者为人或者兽医动物。
可以如本文中描述的对处于与炎症和/或调节途径有关的病症的危险中或者患有所述病症的患者确定表型、诊断和/或治疗。这些病症的实例为心血管疾病、冠心病、动脉粥样硬化、心脏纤维样变性、血栓形成(例如，深静脉血栓形成)和通常其他的血管病症，以及哮喘、炎性肠病、溃疡性结肠炎、Chron氏病、牙龈炎、牙周炎、急性水肿、和关节炎(例如，类风湿性关节炎)。
以有效量施用黄烷醇、矢车菊苷配质和其衍生物。本领域中技术人员使用本领域中的常识和本申请中的教导可以确定有效量。例如，可以以每天至少约50mg到每天约数克量的施用本发明化合物。最高终末量没有限制。在一个实施方案中，有效量为约100mg到约2克，或者约100mg到约1.5g，或者约200到约600mg。考虑到所述化合物在受试者的身体中的半寿期，每天可以施用所述化合物一次或数次(例如，2或3次)。所述化合物可以以本领域中技术人员设计的方案施用或者每天、每周、每月施用，等等。
黄烷醇和/或矢车菊苷配质可以以食物、食物添加剂、饮食补充剂，或者药物的形式施用。这些组合物可以含有载体、稀释剂，或者赋形剂。根据所计划的用途，可以选择所述载体、稀释剂或者赋形剂以适于人或者兽医用途、食物、添加剂、补充品或者药物用途。
本文中所用的“食物”为基本上由蛋白质、碳水化合物和/或脂肪组成的物质，其用于生物的机体中以维持生长、修复和重要过程和供给能量。食物还可以含有补充物质，如矿物质、维生素和调味剂。见Merriam-Webster′s Collegiate Dictionary，第10版，1993。术语食物包括适于人或者动物消费的饮料。本文中所用“食物添加剂”由FDA在21 C.F.R.170.3(e)(1)中定义并且包括直接和间接添加剂。本文中所用“药物”为医学药物。见Merriam-Webster′s Collegiate Dictionary，第10版，1993。药物还可以指药剂。本文中所用“饮食补充剂”是计划补充饮食的产品(除了烟草之外)，其具有或者含有一种或多种下面的饮食成分维生素、矿物质、草本或者其他植物性药材、氨基酸、由人用来通过增加总的日摄取量补充饮食的饮食物质、或者浓缩物、代谢物、组分、提取物或者这些成分的组合。
本发明范围包括通过增加黄烷醇/矢车菊苷配质水平改进的任何常规食物，包括任何饮料。
对于可可多酚的情况，通过(i)向不含有可可多酚的食物加入可可多酚或者其衍生物或者(ii)当食物通常含有可可多酚，如巧克力，通过增强在常规制备的食物中发现的多酚水平以实现提高。可以通过加入额外的可可多酚，例如，提取物形式的可可多酚；或者加入与含有另一种多酚的成分(例如，坚果皮)联合的可可多酚；通过操作可可成分加工和可可豆选择，如上述，以保存用于生产食品的可可成分中的可可多酚来实现所述增强。从而，这些食物(包括饮料)与常规食物(包括饮料)相比含有“升高的多酚水平”(包括可可矢车菊苷配质)。当巧克力生产商将含有可可多酚的可可提取物加入其以前通过商业途径可得到的产品中时，得到了具有多酚的升高水平的巧克力的实例。所述食物可以称为“高可可多酚食物”，即，它们含有比它们的常规食物更高的多酚水平。
在一个实施方案中，所述食物是糖果，如身份标准(SOI)或者非SOI巧克力，如奶、甜的和半甜巧克力，包括黑色巧克力、低脂巧克力和糖果，其可以是巧克力包裹的糖果。其他实例包括烘焙产品(例如，核仁巧克力饼、烘焙小吃、小甜饼、饼干)、调味品、格兰诺拉麦片、太妃咀嚼糖、食品替代条、涂抹品、糖浆、粉状饮料混合物、可可或巧克力香味的饮料、布丁、年糕、稻米混合物、调味沙司等等。如果希望，所述食物可以是巧克力或者可可味的。食品可以还含有L-精氨酸和/或胆固醇降低剂。
所述组合物可以为了预防的目的施用于健康哺乳动物或者施用于需要治疗或者具有至少一种相关危险因素的哺乳动物。具有与血管健康问题有关的至少一种危险因素的任何个体都是此处描述的组合物所施用的受试者。具有胆固醇水平升高的家族史的个体、绝经期间或者绝经后女性、绝经后女性/心肌缺血后损伤、手术或者化学诱导的雌激素不足的女性、老年人、患有高血糖、糖尿病、高血压和肥胖的人，和吸烟者都是需要此处描述的治疗的敏感个体。易于产生血管健康问题或者使用本文中描述的测定法已经鉴定为处于发生与炎症和/或免疫调节途径有关的病症的危险中的哺乳动物的其他群体也可以根据所设计的方案接受所述组合物。
其他多酚的筛选本发明还涉及设计用于评估其他多酚是否能够促进内环境稳定的方法。
根据哺乳动物的细胞因子产生确定多酚调节该哺乳动物中细胞因子水平的治疗价值的方法可通过在含有来自至少一个低细胞因子应答者和至少一个高细胞因子应答者(如使用黄烷醇和矢车菊苷配质在本文中描述的筛选测定法中确定)的身体样品的测定法中在体外试验多酚并将该多酚对低细胞因子应答者的效果与对高细胞因子应答者的效果相比较以确定哪种哺乳动物细胞因子表型(如果存在)受到多酚的存在的影响来实施。
在一个实施方案中，本发明涉及确定多酚调节哺乳动物中细胞因子水平的治疗价值的方法，该方法包括(i)从至少一个低细胞因子产生者和至少一个高细胞因子产生者得到身体样品；(ii)确定该身体样品中基线细胞因子水平；(iii)在足够诱导细胞因子水平变化的条件下将所述身体样品与不知道具有细胞因子调节性质的多酚孵育；(iv)确定步骤(iii)的孵育后细胞因子水平；和(v)将基线细胞因子水平与步骤(iv)的细胞因子水平比较以确定所述多酚是否具有细胞因子调节性质。
在下面的非限制性实施例中进一步描述本发明。
实施例实施例1-提取和纯化矢车菊苷配质提取步骤方法1使用Jalal和Collin(“可可的成熟植物、幼苗和组织培养物的多酚”，Phytochemistry，6，1377-1380，1977)描述的方法的改良方法从脱脂、未发酵的冻干可可豆提取矢车菊苷配质。用2×400mL 70％丙酮/去离子水，然后用400mL 70％甲醇/去离子水从脱脂可可块的50克批量提取矢车菊苷配质。合并提取物并用旋转蒸发器在部分真空下45℃蒸发除去溶剂。将所得水相用去离子水稀释到1L并用2×400mLCHCl3萃取。丢弃溶剂相。然后用4×500mL乙酸乙酯萃取水相。通过在Sorvall RC 28S离心机上以2,000×g 10℃下离心30分钟以破坏任何所得乳液。向合并的乙酸乙酯萃取物中加入100-200mL去离子水。用部分真空下的旋转蒸发器在45℃下蒸发溶剂。所得水相在液氮中冷冻，然后在LABCONCO冻干系统上冻干。从不同可可基因型得到的矢车菊苷配质粗品产率在表1中列出。
表1矢车菊苷配质粗品产率
方法2备选地，用70％水性丙酮从脱脂、未发酵的冻干可可豆提取矢车菊苷配质。将10克脱脂材料用100mL溶剂匀浆5-10分钟。将浆液在4℃以3000×g离心15分钟，并将所得上清液穿过玻璃棉。滤液在部分真空下蒸馏并将所得水相在液氮中冷冻，然后在LABCONCO冻干系统上冻干。矢车菊苷配质粗品的产率为15-20％。
不希望被任何特定理论所束缚，认为粗品产率的不同反映了不同基因型、地理起源、园艺品种、和制备方法的不同。
通过凝胶渗透层析部分纯化可可矢车菊苷配质方法1通过Sephadex LH-20(28×2.5cm)上的液相层析部分纯化如上述得到的矢车菊苷配质。通过从去离子水到甲醇的分级梯度帮助分离。最初梯度组成以去离子水中的15％甲醇开始，然后每30分钟逐步用去离子水中的25％甲醇、去离子水中的35％甲醇、去离子水中的70％甲醇，最后为100％甲醇。将黄嘌呤生物碱类(咖啡因和可可碱)的洗脱后的流出液作为单一级分收集。该级分产生了没有黄嘌呤生物碱类的亚级分，将其进一步细分级以产生5种亚级分，将它们称为MM2A到MM2E。通过部分真空中的旋转蒸发器在45℃下蒸发从每个亚级分除去溶剂。所得水相在液氮中冷冻并在LABCONCO冻干系统上过夜冻干。以该方法细分级了约100mg物质。
层析条件柱子28×2.5cm Sephadex LH-20，移动相甲醇/水分级梯度，15∶85，25∶75，35∶65，70∶30，100∶0，以1/2小时间隔分级，流速1.5mL/分钟，检测器lambda1(λ1)＝254nm，λ2＝365nm下UV，记录纸速度0.5mm/分钟，柱负荷120mg。
方法2通过Sephadex LH 20(72.5×2.5cm)上液相层析部分纯化如上描述的矢车菊苷配质，使用100％甲醇作为洗脱溶剂，流速为3.5mL/分钟。头1.5小时后收集洗脱液级分，并通过旋转蒸发器浓缩级分，将其再溶于水中并冻干。将这些级分称作富含五聚体的级分。
可以如美国专利号5,554,645和6,297,273(它们的相关部分并入本文作为参考)描述的使用HPLC将黄烷醇和矢车菊苷配质在单独的级分中分离。
实施例2-黄烷醇和矢车菊苷配质对TGF-β1的作用可可级分制备从高矢车菊苷配质含量的可可粉(Cocoapro，Mars，Incorporated；Hackettstown，NJ)制备水溶性黄烷醇和/或矢车菊苷配质(FP)级分。根据Kealey等人的美国专利号6,015,913(这里并入本文作为参考)中描述的方法制备粉末。如实施例1中描述的用丙酮/水提取可可粉得到粗提物。根据Adamson等人(J Agric Food Chem 1999；474184-4188.)描述的使用高效液相层析(HPLC)从粗提物纯化级分。研究从单体到十聚体的纯化级分。所纯化的FP级分含有0.5％(w/w)以下的总生物碱类(可可碱和咖啡因)。在表2中显示了通过HPLC估计的单体和矢车菊苷配质组成，和这些制备物的分子量。将所有样品悬浮在含有10％热失活的胎牛血清(Atlanta Biologicals，Noreross，GA)的RPMI1640(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中。将它们用相同的培养基稀释到终浓度25μg/ml。
PBMC分离将来自健康志愿者的外周血收集到含有柠檬酸钠的试管中并用没有氯化钙、氯化镁或者硫酸镁的Hanks平衡盐溶液(HBSS；Gibco BRL)混合。然后将稀释的血液用Histopaque-1077梯度(Sigma，St.Louis，MO)分层并以500×g在室温下离心30分钟。从界面层收获PBMC，将其用HBSS洗涤两次，然后计数。将细胞重悬浮在含有10％胎牛血清并补加0.1％50mg/ml庆大霉素溶液(Gibco BRL)的RPMI 1640中。通过锥虫蓝排除测定估计生存力后将PBMC浓度调节到2×106个活细胞/ml。生存力总是大于96％。
用可可FP级分培养PBMC将500μl 1.0×106个细胞悬浮液用等体积多种可可处理液在37℃、5％CO2的48孔板中培养。用25μg/ml单独的可可FP级分孵育静息PBMC。所有处理都一式两份地进行。孵育72小时后，收获上清液级分用于ELISA分析。
TGF-β1(ELISA)72小时后收获培养上清液级分并保存在-20℃直到通过ELISA分析。将96孔Costar EIA板(Cat.#2592)用DuoSet人TGF-β1ELISA显色试剂盒(R & D Systems，Minneapolis，MN)中提供的小鼠抗TGF-β1包被。含有潜伏形式的TGF-β1的细胞培养上清液在酸性环境(0.5ml样品+(0.1ml 1N HCl)中活化并用0.1ml 1.2N NaOH/0.5M HEPES中和。随后，根据生产商的推荐测量经活化的上清液中的TGF-β1浓度。ELISA系统的最低TGF-β1标准为31.3pg/ml。
统计在未刺激的静息PBMC中检查了不同可可FP级分对TGF-β1分泌的影响。通过具有两尾p值的学生成对t检验比较结果(即，没有可可类黄酮的对照细胞对用单独的FP级分处理的细胞)。认为p＜0.05是显著的。
结果制备未刺激的静息PBMC并将其与25μg/ml单独的可可FP级分孵育。孵育72小时后在上清液级分中估计TGF-β1产生。
ELISA分析表明在所试验的13名受试者中个体间差异明显。图1描绘了以相对于每名受试者的中值基线的百分数改变形式表示的这些个体对可可FP级分的波动应答。然而，当基于TGF-β1的基线产生对个体归类时，在TGF-β1分泌受到可可FP级分的影响方面观察到明显趋势。有7名低基线产生者(LBP)，他们的基线TGF-β1浓度小于6000pg/ml(3604±568pg/ml)，而剩下的被分配到高基线产生组(HBP；7910±695pg/ml)。单独的可可FP级分可刺激低LBP组中的TGF-β1释放(图2)。通常，低分子量FP级分(≤五聚体)在增大中比较大的寡聚体更有效，诱导从基线增加30％到68％(表3)，而较大的寡聚体(≥六聚体)仅相对于基线中度增加TGF-β1分泌(15％到20％，表3)。单体和二聚体FP级分显著增加了LBP组中的TGF-β1分泌，分别产生5981±666(p＝0.0035)和6062±667(p＝0.0027)pg/ml的浓度。与LBP组相比，单独的可可FP级分抑制HBP中TGF-β1分泌(图3)。三聚体到十聚体FP级分相对于基线显著抑制TGF-β128％到62％(表3)，而单体和二聚体显示出中度减小(分别为17％和23％)。
结果表明可可FP级分能够通过根据个体的基线TGF-β1水平增加或者抑制TGF-β1释放而促进TGF-β1的内环境稳定水平。
在本研究中，对TGF-β1的基线分泌的评估表明所检查的受试者中大的个体间差异。Grainger等人已经表明TGF-β1的循环浓度可以基于该个体的遗传背景非常不同(Hu Mol Gen 1999；893-97)。可以理解考虑到TGF-β1基因的多态性可以影响其产生，所以观察到TGF-β1的这些不同的基线水平。不幸的是，在当前研究中没有对所试验的受试者进行基因型分析。然而，很明显，可可FP级分可以刺激来自TGF-β1的基线水平低(3604±568pg/ml)的受试者的PBMC中TGF-β1蛋白质分泌。与低基线受试者相比，来自高基线产生个体(7910±695pg/ml)的PBMC在与FP级分孵育后显示出TGF-β1产生受到抑制。因为没有对低和高TGF-β1产生个体进行基因型分析，所以还可能在从这些受试者收集血液前HBP就被引发产生TGF-β1。不过，可可FP级分仍然分别有效减小或者增加了HBP和LBP中的TGF-β1分泌。
以前用表现出对细胞因子产生具有不同效果的较大和较小矢车菊苷配质级分观察到可可FP对细胞因子产生的效果—双相类型的效果。在静息PBMC中，较大的FP寡聚体(六聚体和以上)显著刺激IL-1β和IL-4释放，而较小的级分抑制它们的分泌(Mao等人，Life Sciences2000；661377-1386；Mao等人，J Medicinal Foods 2000；3107-114)。然而，在本研究中，令人惊奇地发现FP对TGF-β1释放的效果不仅取决于FP级分的分子大小，而且取决于PBMC分泌TGF-β1的能力。某些级分更具活性，可可级分在每个个体中的一般效果是类似地，因为它们刺激TGF-β1从LBP释放，并抑制TGF-β1从HBP分泌。考虑到上面的情况，与可可FP对血小板反应性、类十二烷酸产生和血管反应性的影响呼应的是可可FP还通过促进内环境稳定的TFG-β1水平的保持对心血管系统具有保护效果。
表2.单独的可可FLO级分图
表3.FLO级分对低(n＝7)和高(n＝6)基线产生者中TGF-β分泌的影响。值表达为相对于中值基线对照的平均百分数变化。
权利要求
1.设计人或者兽医动物的饮食和/或药物方案的方法，该方法包括(i)在体外确定所述人或者兽医动物的身体样品中基线细胞因子水平，其中所述细胞因子与炎症和/或免疫调节途径有关；和(ii)基于基线细胞因子水平，设计促进所述人或者兽医动物中内环境稳定的细胞因子水平的药物和/或饮食方案；其中所述药物和/或饮食方案包括施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质寡聚体和/或其衍生物。
2.设计人或者兽医动物的饮食和/或药物方案的方法，该方法包括(i)在体外确定所述人或者兽医动物的身体样品中基线细胞因子水平，其中所述细胞因子与炎症和/或免疫调节途径有关；(ii)基于基线细胞因子水平诊断该人或者兽医动物是否处于与炎症和/或免疫调节途径有关的病症的危险中或者患有该病症；和(iii)设计可有效预防性或者治疗性治疗步骤(ii)中诊断的病症的药物和/或饮食方案。
3.权利要求2的方法，其中药物和/或饮食方案包括施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质寡聚体和/或其衍生物。
4.权利要求2的方法，其中所述病症为心血管疾病、冠心病、心脏纤维样变性、动脉粥样硬化、和/或肾病或肾衰竭。
5.设计人或者兽医动物的饮食和/或药物方案的方法，该方法包括(i)在体外确定所述人或者兽医动物的身体样品中基线细胞因子水平，其中所述细胞因子与炎症和/或免疫调节途径有关；(ii)在足够诱导细胞因子水平变化的条件下，将所述身体样品与一系列黄烷醇和矢车菊苷配质和/或其衍生物，或者它们的混合物孵育，并测量所得细胞因子水平；(iii)将基线细胞因子水平与步骤(ii)中所得细胞因子水平比较以确定所述人或者兽医动物对黄烷醇和矢车菊苷配质的细胞因子反应性；(iv)基于细胞因子反应性，设计促进所述人或者兽医动物中内环境稳定的细胞因子水平的药物和/或饮食方案；其中所述药物和/或饮食方案包括施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质寡聚体；和/或其衍生物，或者它们的混合物。
6.设计人或者兽医动物的饮食和/或药物方案的方法，该方法包括(i)在体外确定所述人或者兽医动物的身体样品中基线细胞因子水平，其中所述细胞因子与炎症和/或免疫调节途径有关；(ii)在足够诱导细胞因子水平变化的条件下将所述身体样品与一系列黄烷醇和矢车菊苷配质和/或其衍生物，或者它们的混合物孵育，并测量所得细胞因子水平；(iii)将基线细胞因子水平与步骤(ii)中所得细胞因子水平比较以确定所述人或者兽医动物对黄烷醇和矢车菊苷配质的细胞因子反应性；(iv)基于细胞因子反应性，诊断所述人或者兽医动物是否处于与炎症和/或免疫调节途径有关的病症的危险中或者患有该病症；和(v)设计可有效预防性或者治疗性治疗步骤(iv)中诊断的病症的药物和/或饮食方案。
7.权利要求6的方法，其中所述药物和/或饮食方案包括施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质寡聚体和/或其衍生物。
8.权利要求6的方法，其中所述病症为心血管疾病、冠心病、心脏纤维样变性、动脉粥样硬化、和/或肾病或肾衰竭。
9.预防性或者治疗性治疗人或者兽医动物的方法，该方法包括(i)在体外确定所述人或者兽医动物的身体样品中基线细胞因子水平，其中所述细胞因子与炎症和/或免疫调节途径有关；和(ii)基于基线细胞因子水平，设计促进所述人或者兽医动物中内环境稳定的细胞因子水平的药物和/或饮食方案；其中所述药物和/或饮食方案包括施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质寡聚体；和(iii)根据步骤(ii)中设计的药物和/或饮食方案对所述人或者兽医动物施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质寡聚体和/或其衍生物。
10.预防性或者治疗性治疗人或者兽医动物的方法，该方法包括(i)在体外确定所述人或者兽医动物的身体样品中基线细胞因子水平，其中所述细胞因子与炎症和/或免疫调节途径有关；(ii)基于基线细胞因子水平诊断该人或者兽医动物是否处于与炎症和/或免疫调节途径有关的病症的危险中或者患有该病症；和(iii)设计可有效预防性或者治疗性治疗步骤(ii)中诊断的病症的药物和/或饮食方案；和(iv)根据步骤(iii)中设计的药物和/或饮食方案治疗所述人或者兽医动物。
11.权利要求10的方法，其中所述药物和/或饮食方案包括施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质寡聚体和/或其衍生物。
12.权利要求10的方法，其中所述病症为心血管疾病、冠心病、心脏纤维样变性、动脉粥样硬化、和/或肾病或肾衰竭。
13.预防性或者治疗性治疗人或者兽医动物的方法，该方法包括(i)在体外确定所述人或者兽医动物的身体样品中基线细胞因子水平，其中所述细胞因子与炎症和/或免疫调节途径有关；(ii)在足够诱导细胞因子水平变化的条件下将所述身体样品与一系列黄烷醇和矢车菊苷配质和/或其衍生物，或者它们的混合物孵育，并测量所得细胞因子水平；(iii)将基线细胞因子水平与步骤(ii)中所得细胞因子水平比较以确定所述人或者兽医动物对黄烷醇和矢车菊苷配质和/或其衍生物的细胞因子反应性；(iv)基于细胞因子反应性，设计促进所述人或者兽医动物中内环境稳定的细胞因子水平的药物和/或饮食方案；其中所述药物和/或饮食方案包括施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质寡聚体和/或其衍生物；和(v)根据步骤(iv)中设计的药物和/或饮食方案对所述人或者兽医动物施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质寡聚体和/或其衍生物，或者它们的混合物。
14.预防性或者治疗性治疗人或者兽医动物的方法，该方法包括(i)在体外确定所述人或者兽医动物的身体样品中基线细胞因子水平，其中所述细胞因子与炎症和/或免疫调节途径有关；(ii)在足够诱导细胞因子水平变化的条件下将所述身体样品与一系列黄烷醇和矢车菊苷配质和/或其衍生物，或者它们的混合物孵育，并测量所得细胞因子水平；(iii)将基线细胞因子水平与步骤(ii)中所得细胞因子水平比较以确定所述人或者兽医动物对黄烷醇和矢车菊苷配质和/或其衍生物的细胞因子反应性；(iv)基于基线细胞因子水平，诊断所述人或者兽医动物是否处于与炎症和/或免疫调节途径有关的病症的危险中或者患有该病症；和(v)设计可有效预防性或者治疗性治疗步骤(iv)中诊断的病症的药物和/或饮食方案；和(vi)根据步骤(v)中设计的药物和/或饮食方案治疗所述人或者兽医动物。
15.权利要求14的方法，其中所述药物和/或饮食方案包括施用黄烷醇和/或矢车菊苷配质寡聚体和/或其衍生物。
16.权利要求14的方法，其中所述病症为心血管疾病、冠心病、心脏纤维样变性、动脉粥样硬化、和/或肾病或肾衰竭。
17.权利要求1、2、5、6、9、10、13或14的方法，其中所述细胞因子是TGF-β。
18.权利要求1、2、5、6、9、10、13或14的方法，其中所述细胞因子是TGF-β1。
19.用于鉴定人或者兽医动物的细胞因子反应性的筛选测定法，其包括(i)体外确定人或者兽医动物的身体样品中基线细胞因子水平，其中所述细胞因子与炎症和/或免疫调节途径有关；和(ii)在足够诱导细胞因子水平改变的条件下，将所述身体样品与一系列黄烷醇和矢车菊苷配质和/或其衍生物，或者它们的混合物孵育，并测量所得细胞因子水平。
20.权利要求19的筛选测定法，其还包括将基线细胞因子水平与步骤(ii)中所得细胞因子水平比较以确定所述人或者兽医动物对黄烷醇和矢车菊苷配质和/或其衍生物的细胞因子反应性。
21.权利要求20的筛选测定法，其还包括诊断所述人或者兽医动物是否处于心血管疾病、冠心病、心脏纤维样变性、动脉粥样硬化、或肾病或肾衰竭的危险中或者患有这些疾病。
22.确定多酚调节哺乳动物中细胞因子水平的治疗价值的方法，该方法包括(i)从至少一个低细胞因子产生者和至少一个高细胞因子产生者得到身体样品；(ii)确定该身体样品中基线细胞因子水平；(iii)在足够诱导细胞因子水平变化的条件下将所述身体样品与不知道具有细胞因子调节性质的多酚孵育；(iv)确定步骤(iii)的孵育后细胞因子水平；和(v)将基线细胞因子水平与步骤(iv)的细胞因子水平比较以确定所述多酚是否具有细胞因子调节性质。
23.权利要求22的方法，其中所述哺乳动物是人。
24.权利要求22的方法，其中所述哺乳动物是兽医动物。
25.治疗受试者的方法，所述受试者为低基线TGF-β产生者，所述方法包括对该受试者施用至少一种黄烷醇和/或矢车菊苷配质寡聚体，所述矢车菊苷配质寡聚体选自单体、二聚体、三聚体、四聚体和五聚体，或者它们的任何混合物或衍生物，所用的量可有效刺激该受试者中TGF-β的水平，其中所述受试者为人或者兽医动物。
26.权利要求25的方法，其中TGF-β为TGF-β1。
27.治疗受试者的方法，所述受试者为高基线TGF-β产生者，所述方法包括对该受试者施用至少一种矢车菊苷配质寡聚体6-10，或者它们的任何混合物或衍生物，所用的量可有效刺激该受试者中TGF-β的水平，其中所述受试者为人或者兽医动物。
28.权利要求27的方法，其中TGF-β为TGF-β1。
全文摘要
本发明包括鉴定人或者兽医动物的细胞因子反应性的筛选方法和其中所用的产物和测定法，其含有黄烷醇和矢车菊苷配质和/或其衍生物，或者它们的混合物，还涉及诊断人和兽医动物中细胞因子表型的方法；鉴定处于与炎症和/或免疫调节途径有关的病症的危险中的受试者的方法；鉴定饮食和/或药物干预以调节与炎症和/或免疫调节途径有关的病症的方法；和用所选的黄烷醇和矢车菊苷配质和/或其衍生物，或者它们的混合物预防性或者治疗性治疗人或者兽医动物的方法。
文档编号A61K31/7048GK1758917SQ200380109418
公开日2006年4月12日 申请日期2003年12月2日 优先权日2002年12月2日
发明者H·H·施米茨 申请人:马尔斯公司