专利名称：两亲性脂质用于制备减少肿瘤转移的药物组合物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及两亲性脂质在制备用于减少肿瘤转移的药物组合物中的用途，其中该两亲性脂质是磷脂和/或鞘磷脂。
癌性疾病和肿瘤通常是人类死亡和严重疾病的主要原因。即使手术除去肿瘤后，患者也通常遭受肿瘤疾病，主要是肿瘤转移。消化道癌的手术治疗后腹膜癌症的发展仍然是复发的通常原因。在具有浆膜侵入的胃癌中，即使进行治疗性切除，也有高达50％的患者发生腹膜癌症(Boku T等人，Br J Surg 1990；77436-9；和Jansen M等人，Chirurg 2001；72561-5)。一些研究表明检测腹膜腔中游离的、分离的肿瘤细胞可以作为结肠癌和胃癌患者中术后存活的预后标记(Koga S等人，J Cancer Res Clin Oncol 1984；108236-8；SchottA等人，Ann Surg 1998；227372-9；Bando E等人，Am J Surg 1999；178256-62；和Broll R等人，Langenbecks Arch Chir 1996；38151-8)。
腹膜肿瘤复发可以是原发性肿瘤或者手术时脱落物的浆膜侵入导致的残留的、腹膜内游离肿瘤细胞的结果。肿瘤细胞向腹膜壁的侵染是复杂的过程，其包括粘附、蛋白水解和迁移(Schwartz OK，SeminOncol 1996；23316-24)。发生腹膜扩散的最重要的步骤似乎在于肿瘤细胞与间皮细胞或者细胞外基质组分的粘附(Kiyasu Y等人，Cancer Res 1981；411236-9；Koga S等人，Gann 1980；718-13；和SchwartzOK，Semin Oncol 1996；23316-24)。实验研究表明腹膜转移主要倾向于在受伤的腹膜部位发生(Yashiro M等人，Cancer1996；771668-75)。
胃癌细胞与腹膜表面的粘附代表了肿瘤细胞侵入中必要的第一步(SchwartzOK，Semin Oncol 1996；23316-24)。在扫描电子显微镜研究中，Kiyasii等阐明癌细胞不粘附到间皮细胞而是游离的亚间皮结缔组织。然而，存在胃癌细胞时，间皮细胞变成半球形并且发生脱落(Kiyasu Y等人，Cancer Res 1981；411236-9)。
因为仅手术是不完全的治疗，所以已经评价了多种其他治疗。腹膜内化疗是治疗腹膜接种的可靠的方法，但是已经描述了通常的并发症(Hagiwara等人，Surgery 1988；104874-881；Fass等人，Langenbecks Arch Chir Suppl Kongress bd 1998；1151363-1366；Sayag等人，Oncology 1993；50333-337；Fujimura等人，Int Surg1999；8460-66；Fujimoto等人，Ann Surg 1990；212592-596；和Koga等人，Cancer 1988；61232-237)。
试图抑制肿瘤细胞粘附。因为腹膜肿瘤细胞粘附由粘附分子介导，所以用对粘附分子特异的抗体抑制人胃癌细胞的扩散(Chailley-Heu B等人，Biochem J 1997；328(Pt1)251-6)。各种抗体的临床用途的主要问题似乎是这些抗原在不同起源的肿瘤和其他细胞系中的不同表达。
此外，已经报导了使用硫酸葡聚糖和透明质酸钠在动物模型中减少腹膜转移的试验(Hagiwara A等人，Anticancer Drugs 1997；8894-7；和Haverlag R等人，Eur J Surg 1999；165791-5)。
硫酸葡聚糖导致小鼠的腹壁中损伤部位处肿瘤植入减少(Hagiwara A等人，Anticancer Drugs 1997；8894-7；和HagiwaraA等人，Antican-cer Drugs 2000；11873-7)。同时作者报导接种黑素瘤细胞后治疗组中存活延长。然而，当使用葡聚糖防止粘附时观察到若干副作用。主要问题是水肿、胸膜渗出、凝固的威胁生命的功能异常和某些变态反应(diZeregaGS，Curr Opin Ob-stet Gynecol1996；8230-7；和Treutner KH等人，Chirurg 2000；71510-7)。
已证明透明质酸钠增强结肠肿瘤细胞转移潜力，这可能是通过CD44受体介导(Tan等人，Br J Surg 2001；88246-250)。推断该治疗导致腹膜内肿瘤生长指数化。
考虑到上面的现有技术，本发明涉及癌性疾病的医学治疗，尤其涉及肿瘤复发和转移的抑制。
根据本发明，通过使用两亲性脂质制备用于减少肿瘤转移的药物组合物解决了该问题，其中两亲性脂质是磷脂和/或鞘磷脂。
本发明人已经令人惊奇地表明通过施用两亲性脂质，优选施用磷脂显著减小了肿瘤转移，这导致存活率增加。两亲性脂质是安全的并且不导致不希望的副作用。
术语“两亲性脂质”用于本申请中指一种有机分子，其甘油(例如，多元醇，如醇)主链被通过酯键偶联的两个酰基链取代，还具有取代醇的剩余羟基的极性基团。术语两亲性阐明各自化合物同时含有亲水和亲脂基团。根据本发明使用的两亲性脂质，优选脂质体当在脂质中分散时形成双层。为了本发明的医学用途，所述两亲性脂质必须是药学上可接受的。满足这些要求的任何两亲性脂质都可按照本发明使用。
按照本发明使用的优选的两亲性脂质的实例包括磷脂、磷酸甘油酯、半乳糖脂、鞘磷脂(鞘脂类)、半乳糖脂、糖基甘油酯和/或磷脂酰胆碱。
术语“药物组合物”用于本申请中指已经得到管理机构(EMEA、FDA等)批准的药物组合物。然而，术语“药物组合物”不限于这些组合物但是包括含有两亲性脂质并且适于所要求保护的医学用途的任何组合物或医学装置。
本发明包括单特异类型的两亲性脂质的用途，用于制备减少肿瘤转移的药物组合物，以及用于该目的的多种两亲性脂质的组合的用途。本发明的所有实施方案优选使用磷脂。更具体地，本发明包括公知的磷脂用于减少肿瘤转移的医学用途，所述磷脂当前被用作乳化剂以制备用于肠胃外营养的fett乳剂。
本申请中，术语磷脂(PL)用于指含有通过酯键连接的两个酰基链和含有取代甘油的剩余羟基的极性、含磷基团的甘油主链。各个极性脂质衍生物可以是天然的、半合成的或者合成来源的。从而可以通过天然来源提供和从天然来源制备磷脂，因为它们是植物和动物来源的细胞中常见的膜组分。可以提取和纯化天然发生的磷脂。各个磷脂当前例如已经用于制备用于肠胃外营养的fett乳剂。
药物级磷脂有几种不同的来源，如蛋和大豆。根据它们的来源，关于脂肪酸组合物以及极性基团组合物的详细组分将不同。通过内源磷脂的纯化和分级分离可以提供更明确的分子组成的磷脂，所述内源磷脂包括半合成磷脂(包括最终合成步骤)或者合成磷酯(通过纯粹的合成途径)。
脂质，更具体地，磷脂是腹腔的天然组分。推测该物质可以在腹膜表面形成润滑层(Beavis等人，Perit Dial Int1994；14348-355；和ChailleyHeu等人，Biochem J 1997；328(Pt1)251-256)。磷脂的腹膜内应用导致粘附形成，特别是腹膜损伤部位粘附形成的显著降低，而对吻合、剖腹术伤口和肝脏切开的愈合没有任何副作用(Muller等人，J Surg Res 2001；9668-74；Muller等人，Langenbecks Arch Surg 2001；386278-284；和WO98/535800)。然而，直到今天，还没有提出脂质作为治疗癌性疾病，尤其用于减少转移的活性物质。
在根据本发明的两亲性脂质的医学用途中，由于肿瘤细胞粘附的抑制、转移细胞粘附的抑制和/或肿瘤转移生长的抑制，本发明肿瘤转移得到减少。
根据本发明，两亲性脂质可用于减少任何肿瘤转移，如腹膜癌症和多种其他癌症，例如，胃癌、结肠癌、卵巢癌或胰腺癌的复发。
当然，本发明的医学用途针对将转移的发生减小到零。然而，必须将实现转移数量的显著减少和/或存活率的增加的两亲性脂质的医学用途考虑为显著改善并且被本发明覆盖。
两亲性脂质可以用于预防性治疗。根据特别优选的实施方案，该两亲性脂质用于腹膜内肿瘤复发的预防性治疗，特别是恶性肿瘤，例如，胃肠癌和泌尿生殖器系统的癌，如卵巢癌或者膀胱癌的复发。患者在治疗前可能经历治疗性切除或者施用两亲性脂质后不久接受各自手术治疗。
在本发明的医学用途中，两亲性脂质可以作为药物组合物中用于减少肿瘤转移的唯一活性化合物或者可以与其他活性化合物，如抗肿瘤药物、放射活性药物等组合。术语“活性化合物”用于本申请中指组合物中的化合物，其负责所观察到的效果(肿瘤转移的减少)。如果两亲性脂质用作唯一的活性化合物，将实现特定优点，因为与多数抗肿瘤化合物和放射活性药物相比，两亲性脂质不导致任何副作用，公知所述抗肿瘤化合物和放射活性药物导致显著的副作用。
在本发明的一方面，两亲性脂质用于治疗哺乳动物。人的治疗尤其优选。
可以以临床有效的任何形式和浓度施用两亲性脂质。根据本发明的一个实施方案，磷脂分散于水溶液中。该溶液优选含有浓度为0.05％到25％(w/v)，更优选浓度为0.5到20％(重量/重量)，最优选浓度为1.5％到10％(重量/重量)的磷脂。
为了施用，可以将两亲性脂质配制成任何适宜的药物组合物。优选用于局部施用，如滴注或者注射的分散剂制剂，其中特别优选腹膜内施用。
根据特别优选的实施方案，所施用的两亲性脂质分散在水性脂质中并且所施用的脂质的量高于最小包被体积，即高于包被所有内表面所需的两亲性脂质的足够量的体积。水分将由器官吸收并且两亲性脂质将在内表面形成包衣。
另一方面，本发明涉及制备用于治疗肿瘤转移的药物组合物的方法，该方法包括其中将两亲性脂质与水溶液混合的步骤。两亲性脂质优选分散在水溶液中。通过本领域中众所周知的许多备选方法如高压匀浆可以得到分散剂。优选地，以如此方式制备分散剂使得得到具有颗粒大小为40到100nm的脂质体。
制备所述药物组合物的方法优选还包括一个步骤，其中将用于该药物组合物制备的分散剂或者组分消毒。
在本发明的该实施方案中，所述两亲性脂质可以是磷脂、鞘磷脂和/或半乳糖脂。此外，两亲性脂质可以是一种特定类型的两亲性脂质或者不同两亲性脂质的组合。所述药物组合物可以但不必含有用于转移治疗的活性化合物，如抗肿瘤药物或者放射活性药物。根据特别优选的实施方案，所述药物组合物不含有当前用于治疗肿瘤和转移的任何活性化合物。根据另一实施方案，两亲性脂质是该药物组合物中的唯一活性药物化合物。
附图简述
图1显示了如实施例2中描述的在多种浓度的PL存在下肿瘤体积的分析的结果。
图2显示了如实施例2中描述在各种浓度的PL存在下肿瘤粘附的平均面积的分析结果。
图3显示了如实施例2中描述在各种浓度的PL存在下腹膜癌指数(PCI)的分析结果。
图4显示了用于实施例2中的受试动物的相对存活的分析结果。
图5显示了用于实施例3中的受试动物的相对存活的结果。
图6显示了如实施例3中描述的在各种浓度的PL存在下腹膜癌指数(PCI)的分析结果。
图7显示了具有腹膜擦伤的盲肠a.PL150后30天b.NaCl后30天图8显示了如实施例3中描述的在各种浓度的PL存在下肿瘤体积的分析的结果。
图9显示了如实施例3中描述的在各种浓度的PL存在下肿瘤粘附的平均面积的分析结果。
图10显示了实施例4的粘附测定法的结果，即在各种浓度的PL存在下结肠癌细胞对用ln包被的微量滴定板的粘附的抑制。
图11显示了实施例4的粘附测定法的结果，即在各种浓度的PL存在下结肠癌细胞对用coll IV包被的微量滴定板的粘附的抑制。
图12显示了实施例4的粘附测定法的结果，即在各种浓度的PL存在下胃癌细胞对用fn包被的微量滴定板的粘附的抑制。
图13显示了实施例5的粘附测定结果，a)1.0g PL存在下胃癌细胞对层粘连蛋白的粘附。
b)对照组中，胃癌细胞对层粘连蛋白的粘附。
图14显示了实施例5的粘附测定结果，即在各种浓度的PL存在下胃癌细胞对用ln包被的微量滴定板的粘附的抑制。
图15显示了实施例5的粘附测定结果，即在各种浓度的PL存在下胃癌细胞对用fn包被的微量滴定板的粘附的抑制。
图16显示了实施例5的粘附测定结果，即PL在各种浓度的存在下胃癌细胞对用coll IV包被的微量滴定板的粘附的抑制。
实施例1用于制备PL的方法可取决于所选的PL的来源和将要得到的分子。纯化水平对于天然来源的PL尤其重要。基于例如，反复溶剂提取/沉淀方法，达到静脉内使用易于接受的质量的纯化方法是本领域中技术人员公知的(F Nielloud，G Marti Mestres，PharmaceuticalEmulsions and Suspensions，第一章.VB，6.VI Marcel Dekker，NY2000；与参考文献)。
为了以适于所计划的目的的形式提供PL，通常将磷脂配制成脂质体分散剂，可以生产所述脂质体分散剂并保存备用。脂质体分散剂将容易吸附到患者的内表面，如腹膜的内表面，从而形成单层或多层，其将防止肿瘤细胞与所包被表面的粘附。
从药理学观点看，这种脂质体分散剂将满足许多条件。为了稳定性和功能性的原因，优选使用高压匀浆或者适于得到非常小的微粒大小(亚微米)的其他方法制备分散剂。此外，该溶液应该是无菌的。通过热消毒达到适当的无菌确保水平，热消毒是实现消毒的优选选择。然而，热消毒对制剂的理化稳定性带来压力。
使用用于制备和消毒的工业方法(I Hanin和G Pepeu(编者)″Phospholipids″115-122页，Plenum Press NY 1990；M J Groves，″Parenteral Products″，Heinemann 1973)可以容易地制备具有良好的双层形成性质，含有适当平衡的磷脂，或者用可以帮助提供稳定的脂质体分散剂的添加剂配制的优化的制剂。
制备下面的磷脂分散剂1.30g蛋磷脂25g甘油NaOH调节pH＝8注射用水(WFI)调节到1000ml2.20g卵磷脂NaCl/磷酸缓冲液到pH＝7和等渗WFI到1000ml3.20g卵磷脂(磷脂酰胆碱)0.1g natriumoleate25g甘油WFI到1000ml4.25g磷脂酰胆碱5g磷脂酰乙醇胺NaCl磷酸缓冲液到pH＝7和等渗WFI到1000ml在所引用的液体中搅拌PL粉末并进行高压匀浆直到得到脂质体的非常细小的分散剂，其含有大小为50-100nm的颗粒。通过高压灭菌对所得分散剂消毒并保存备用。
在下面的实施例中使用了上面的分散剂1。
实施例2在BD IX大鼠中腹膜内注射肿瘤细胞(细胞系DHD/K12/TRb)后发生腹膜癌症是成熟的动物模型(Dunnington等人，Int J Cancer1987；39248-254；Reisser等人，Bull Cancer 1991；78249-252；and Qin等人，Int J Cancer 1991；47765-770)，本发明中使用该模型以观察磷脂是否具有治疗效果。
1.细胞培养使用细胞系DHD/K12/TRb。从同基因BD-IX大鼠(Garcia-Olmo等人，Cancer Lett 1998；132127-133)中诱导的结肠腺癌得到细胞。所述细胞系从欧洲动物细胞培养物中心(ecacc，Salisbury，UK)购买。
将细胞在组织培养瓶(75cm2，Falcon，Becton Dicidson-Gambil，Heidelberg，德国)中DMEM和补加10％胎牛血清(GIBCO)和0.005％庆大霉素(GIBCO)的Ham′s F10(1∶1；GIBCO)中以单层培养。细胞培养物在5％CO2的湿润空气中37℃下孵育。将细胞用0.125％胰蛋白酶处理2分钟后将细胞传代。将细胞以200g离心10分钟后沉淀，重悬在20ml PBS中，并再次沉淀。将细胞沉淀物重悬浮在30ml完全培养基中并以1∶3的分裂比接种。仅来源于三次传代的细胞用于实验。在操作当天，将2×106个细胞悬浮在100μl完全培养基中。
2.动物和麻醉该研究中包括共90只雌性BD-IX大鼠(平均体重250+/-28g)。将大鼠成对保持在保护笼中，可以不受限制地接近水和标准大鼠食物。将动物随机分配到相等数目的9个不同的组(表1)。在无菌条件下实施手术步骤并通过肌内注射氯胺酮100mg/kg(氯胺酮10％，Sanofi-Ceva，Dsseldorf，德国)和xylacine 5mg/kg(Rompun2％，Bayer，Leverkusen，德国)实施全身麻醉。
表1
3.手术步骤将肿瘤细胞与磷脂溶液一起通过2cm中线切口注射到腹膜腔。在组2中，还使用手术刀擦伤右侧腹中盲肠处的壁体腔膜和脏体腔膜(Muller等人，J Surg Res 2001；9668-74)。手术前和观察期末，测量所有动物的体重。
4.腹膜癌症的评估分别30天和90天的间隔后，通过吸入致死剂量的Isofluran处死动物。通过两个正中旁切口打开腹部进行完全探察。用数字化仪器测量并通过定制软件在个人计算机上计算腹膜癌症的大小(mm)(Treutner KH等人，J Surg Res 1995；59764-71)。小心切除后，通过水排除测量肿瘤体积(ml)。
此外，确定了如Sugarbaker等人(Sugarbaker PH等人，CancerTreat Res 1996；81149-68)描述的腹膜癌指数(PCI)。PCI适应大鼠中肿瘤大小。使用下面的病变大小得分LS-I肿瘤大小＜2mm，LS-22.1-5mm；LS-3＞5mm或者汇合。通过独立的不知情观察人员实施腹部探察。
最后，从腹壁、盲肠、空肠、肝脏、脾脏和大网膜采集标本并在甲醛溶液中固定。将5μm厚的切片用苏木精和伊红染色后进行关学显微镜观察。
5.统计学分析所有数据都表达为平均值+/-平均值的标准误(SEM)。用双因素ANOVA进行统计学分析，根据成对比较进行对比。根据Bonferroni将显著性水平调节到α/18＝0.00278。用Log秩检验比较存活曲线。
6.结果在所有动物中最初的手术步骤是正常的。无论治疗如何，所有大鼠都发生了腹膜癌症。注射磷脂后没有观察到不利的副作用。
体重30天后，对照组(C)中体重的平均减轻为18±9g。在PL75组以及PL150组中，体重差不多保持恒定，差异分别为1±2.8g和-2±5g。那些差异不显著。
体积在具有deperitonealisation(C+dp)的对照组中肿瘤体积达到9.27±1.5ml，没有腹膜病变(C)的对照组中肿瘤体积达到14.45±0.75ml。在没有deperitonealisation的试验组中，我们发现用较高磷脂浓度治疗后，肿瘤体积显著分别减小到7±0.59ml(PL75)和7.13±0.91ml(PL150)(p＜0.0001)。尽管在PL150+dp中可以发现肿瘤体积的显著减小，但是与对照组相比差异不显著(p＝0.0817)(图1)。
面积30天后对照组中肿瘤粘附的平均面积为640±112.5mm2(C+dp)，和1691±123.6mm2(C)。在PL75组中，我们测量为1082.43±169.4mm2(PL75+dp)和1048.42±209.3mm2(PL75)。在PL150组中，为480±41.6mm2(PL150+dp)和836.49±155.9mm2(PL150)。仅在PL150组中发现肿瘤粘附面积的显著减小(图2)。
PCI关于腹膜癌指数(PCI)，对照组的值分别达到39±2.03(C+dp)和43±1.125(C)。与对照组相比，我们发现在PL150组中显著减小，分别为29.6±1.97(PL150+dp)和25.7±2.29(PL150)。在PL75组中记录的PCI在腹膜病变的亚组中相等(38.2±1.14，PL75+dp)，在另一亚组中显著减小(33±1.62，PL75)(图3)。
存活率在90天的观察期中，对照组中仅一只动物幸存。中值生存时间为68.5±3.56。PL75组中所有大鼠由于肿瘤发展而死亡直到手术后第80天，中值生存时间为66.5±2.79。然而，PL150组的生存(中值74.3±2.71)与对照组相比显著延长，尽管差异不显著(p＝0.13)(图4)。
组织学可以在所有动物中通过组织学证明结肠癌的浸润。肿瘤的浸润证据局限于浆膜。不能检测到向更深层的侵入。发现exophytic肿瘤生长。从组织学观点看，与试验组相比，对照组中腹膜内肿瘤生长无差异。
实施例3胃癌细胞系NUGC-4来源于35岁女性的淋巴结转移。最初的肿瘤的组织学描述了分化很差的腺癌(Schwartz OK，Semin Oncol 1996；23316-24；和Akiyama S等人，Jpn J Surg 1988；18438-46)。裸鼠中腹膜扩散的实验模型已经完全建立(Nakashio T等人，Int JCancer 1997；70612-8，Satta T等人，Gastroenterol J pn 1993；28580)并且用于本研究中。
1.细胞培养物人胃癌细胞系NUGC-4购买于日本癌症研究资源库(日本东京)。细胞以单层保持在组织培养瓶(75cm2，Falcon，Becton Dikinson-Gambil，Heidelberg，德国)中补加10％胎牛血清(GIBCO)、青霉素和链霉素(GIBCO)的RPMI 1640培养基(GIBCO，Paisley，UK)中。将细胞培养物在5％CO2的湿润空气中37℃孵育。用0.125％胰蛋白酶处理细胞6分钟后将细胞传代。将细胞以200g离心10分钟后沉淀，重悬在20ml PBS中，并再次沉淀。将细胞沉淀物重悬浮在30ml完全培养基中并以1∶3的分裂比接种。仅来源于三次传代的细胞用于实验。在操作当天，将1×106个细胞悬浮在100μl完全培养基中。
2.动物和麻醉该研究中包括共90只雌性BALB/C nu/nu小鼠(平均体重20.2+/-2g)。将动物成对保持在保护笼中，可以不受限制地接近水和标准小鼠食物。将小鼠随机分配到相等数目的9个不同的组(表1)。在无菌条件下实施手术步骤并通过肌内注射氯胺酮40mg/kg(氯胺酮10％，Sanofi-Ceva，Dsseldorf，德国)和0.1mg/kg KG Medeto-midin(Dormitor)实施全身麻醉。
3.手术步骤将肿瘤细胞与磷脂溶液一起通过1cm中线切口注射到腹膜腔。在组2中，使用还使用手术刀擦伤右侧腹中盲肠处的壁体腔膜和脏体腔膜。手术前和观察期末，测量所有动物的体重。
4.腹膜癌症的评估分别30天和90天的间隔后，通过吸入致死剂量的Isofluran处死动物。通过两个正中旁切口打开腹部进行完全探察。用数字化仪器测量并通过定制软件在个人计算机上计算腹膜癌症的大小(mm)。小心切除后，通过水排除测量肿瘤体积(ml)。
此外，确定了如Sugarbaker等人(Sugarbaker PH等人，CancerTreat Res 1996；81149-68)描述的腹膜癌指数(PCI)。PCI适应小鼠中肿瘤大小。使用下面的病变大小得分LS-I肿瘤大小＜2mm，LS-22.1-5mm；LS-3＞5mm或者汇合。通过独立的不知情观察人员实施腹部探察。
最后，从腹壁、盲肠、空肠、肝脏、脾脏和大网膜采集标本并在甲醛溶液中固定。将5μm厚的切片用苏木精和伊红染色后进行关学显微镜观察。
5.统计学分析所有数据都表达为平均值+/-平均值的标准误(SEM)。用双因素ANOVA进行统计学分析，根据成对比较进行对比。根据Bonferroni将显著性水平调节到α/18＝0.00278。用Log秩检验比较存活曲线。
6.结果无论治疗如何，所有小鼠都发生了腹膜癌症。注射磷脂后没有观察到不利的副作用。
在对照组中没有小鼠活过75天。中值幸存时间为69±3天。在PL150组中，相对幸存更长，中值幸存时间为73±5天。在PL75组中，4只动物活过了整个的90天观察期。然而，中值幸存时间仅为59±6天(图5)。
30天后，对照组中的腹膜癌指数(PCI)在没有腹膜病变(dp)的为16.4+/-1.7，有腹膜病变的为21.7+/-0.77。用PL75治疗后发生微小改变。PCI分别为14+/-1和17.8+/-1.09(dp)。然而，与对照值相比，差异不显著。在PL150组中实现了显著更低的PCI，为9+/-1.68(p＝0.0002)和14.3+/-1.07(p＝0.0001)(局部deperitonealization后)(图6)。
主要在腹部切除部位发现肿瘤粘附。如果实施了标准腹膜病变，那么腹膜癌症集中在这些部位(图7a，b)。对照组中平均PCI“结肠”达到接近最大值(2.9+/-0.09)，而在治疗组中在那些部位记录的PCI减小。但是由于评估整个结肠而不是盲肠，我们不能发现与对照组相比PL对该区域中肿瘤粘附的显著影响。PCI“右侧腹”在两个试验组中都显著减小。治疗后30天，PL75组中值为1.7+/-0.44，PL150组中为0.9+/-0.44，相比对照组中为2.8±0.13。
手术后30天记录的对照组的肿瘤体积为0.9+/-0.1ml(dp)和0.9+/-0.17ml。PL75组中的各自值达到0.67+/-0.14ml(dp)和1.0+/-0.13ml。统计学分析揭示两个亚组中没有显著差异。施用PL150后，具有腹膜病变的亚组中肿瘤体积可以减小到0.48+/-0.09ml(dp)和0.6±0.16。这两个结果与对照组都没有显著差异。然而，p值为0.04(图8)。对照组中肿瘤细胞粘附的平均面积在对照组中达到217+/-31.5mm2(dp)和245+/-29.3mm2，相比PL75中为184+/-28.3mm2(dp)和201+/-30.3mm2。PL150组中各自面积仅为145+/-17mm2(dp)和164+/-32.8mm2。两组中对照组与PL150组之间的差异不显著，但是p值非常低，在没有腹膜病变的试验组中p＝0.049，在有病变的试验组中p＝0.08(图9)。
从而这些结果表明PL可用于抑制特别是腹壁中腹膜肿瘤细胞粘附。
实施例4在该体外研究中，确定了磷脂对结肠癌细胞对胞外基质组分的粘附的影响。具体地，分析了癌细胞与几种整联蛋白，即在伤口愈合中起重要作用的主要基底膜组分胶原IV(coll IV)和层粘连蛋白(ln)以及纤连蛋白(fn)的反应性。
1.肿瘤细胞人直肠癌细胞系HRT-18购买于日本癌症研究资源库(日本东京)。细胞以单层保持在组织培养瓶(75cm2，Falcon，BectonDikinson-Gambil，Heidelberg，德国)中补加10％胎牛血清(GIBCO)、青霉素和链霉素(GIBCO)的RPMI 1640培养基(GIBCO，Karlsruhe，德国)中。将细胞培养物在含5％CO2的湿润空气中37℃孵育。用0.125％胰蛋白酶处理细胞6分钟后将细胞传代。将细胞以200g离心10分钟后沉淀，重悬在20ml PBS中，并沉淀。将细胞沉淀物重悬浮在30ml完全培养基中并以1∶3的分裂比接种。仅来源于三次传代的细胞用于实验。
2.细胞外基质组分(ECM)将平底聚苯乙烯微量滴定板(Becton Dickinson，Heidelberg，德国)包被后用于粘附实验。将纯化的ECM组分溶于具有下面浓度的PBS中胶原IV(coll IV)-2.5μg/ml(Biomol，Hamburg，德国)、纤连蛋白(fn)-10μg/ml(Boehringer，Mannheim，德国)和层粘连蛋白(ln)-50μg/ml(Boehringer，Mannheim，德国)。我们发现这些浓度在前面的稀释系列中是最佳的。将它们加入孔中并在5％CO2的湿润空气中在4℃孵育24小时(coll IV，fn)，或者37℃孵育45分钟(ln)。通过加入1％(w/v)BSA(4℃，12h)并用Hepes缓冲液冲洗孔阻断对包被的孔的非特异蛋白质结合。
3.粘附测定对于粘附实验，将结肠癌细胞用胶原酶I(15min，37℃，Worthington，Freehold，USA)解离并用RPMI 1640洗涤一次，离心(200g 10分钟)，重悬浮在RPMI 1640中，并在5％CO2的湿润空气(37℃)中预孵育30分钟。将100μl培养基中的70,000个肿瘤细胞接种于ln和fn包被的孔中，根据稀释系列将30,000个细胞接种于coll IV包被的孔中。用结晶紫染色根据Aumeilley等人，和Tietze等人描述的方法实施粘附细胞的评估。孵育30分钟后，通过用温热的RPMI 1640洗涤两次除去含有未粘附的细胞的上清液。在室温下用30％(v/v)甲醇/乙醇固定粘附细胞15min。将细胞用0.1％(w/v)结晶紫(Sigma，Hamburg，德国)染色，用蒸馏水充分洗涤，并在室温干燥。将染料用50μl 0.2％(v/v)Triton X-100/孔重悬浮并在ELISA读出器中590nm下(Titertek Multiscan Plus MKII，Flow Laboratories GmbH，Meckenheim，德国)测量颜色产生。光密度(OD)显示与每孔1×103到1×105个细胞的细胞量的线性关系，所述细胞量为通过稀释系列确定的。
没有细胞的BSA/聚苯乙烯的对照染色得到最小光密度(OD)值，其为0.01-0.07。从实验中所得的那些值减去这些值。
磷脂完全制备肿瘤细胞悬浮液后，将PL溶液以下面的浓度加入0.1、0.5、0.75、1和1.5mg/100μl培养基。所用的浓度与我们的体内实验相关。
4.统计学分析所有实验都一式四份地进行三次。所有数据都表达为平均值+/-平均值的标准误(SEM)。用单因素ANOVA进行统计学分析，根据成对比较进行对比。根据Bonferroni将显著性水平调节到α/10＝0.005。
5.结果层粘连蛋白在人直肠细胞(HRT-18)对层粘连蛋白的粘附测定中，孵育30分钟后在对照组中检测到平均消光为0.7±0.07。加入浓度为0.75(ext.0.5±0.08)、1(ext.0.44±0.07)和1.5(ext.0.39±0.08)mg/孔的磷脂导致肿瘤细胞粘附的显著减少(p＜0.0001)。与对照组相比，用1.5mg/孔的浓度处理使细胞粘附减少到46％(图10)。
胶原IV30,000个肿瘤细胞与胶原IV孵育后的消光为0.34±0.03。尽管用最低浓度的磷脂(0.1mg/孔)处理导致增加肿瘤细胞粘附(ext.0.5±0.03)，但是用1.5mg磷脂/孔可以减少粘附24％(ext.0.26±0.02)。与对照组相比，在该试验中观察到的差异仅用最大浓度时才显著(p＜0.0001)(图11)。
纤连蛋白对于纤连蛋白，我们观察到与类似于层粘连蛋白实验的肿瘤细胞粘附的减少。与对照组中的消光相比，用0.5mg磷脂/孔(ext.0.99±0.09)处理已经导致细胞粘附的显著减少，其值为1.17±0.1(p＝0.0005)。更高的磷脂(0.75、1、1.5mg/孔)浓度的影响也是显著的(p＜0.0001)。加入1.5mg磷脂/孔后观察到肿瘤细胞对纤连蛋白粘附的最大减少(37％)(图12)。
实施例5在该体外研究中，确定了磷脂对胃癌细胞与胞外基质组分的粘附的影响1.肿瘤细胞人胃癌细胞系NUGC-4购买于日本癌症研究资源库(日本东京)。细胞以单层保持在组织培养瓶(75cm2，Falcon，Becton Dikinson-Gambil，Heidelberg，德国)中补加10％胎牛血清(GIBCO)、青霉素和链霉素(GIBCO)的RPMI 1640培养基(GIBCO，Karlsruhe，德国)中。将细胞培养物在5％CO2的湿润空气中37℃孵育。用0.125％胰蛋白酶处理细胞6分钟后将细胞传代。将细胞以200g离心10分钟后沉淀，重悬在20ml PBS中，并再次沉淀。将细胞沉淀物重悬浮在30ml完全培养基中并以1∶3的分裂比接种。仅来源于三次传代的细胞用于实验。
2.细胞外基质(ECM)组分将平底聚苯乙烯微量滴定板(Becton Dickinson，Heidelberg，德国)包被后用于粘附实验。将纯化的ECM组分溶于具有下面浓度的PBS中coll IV-2.5μg/ml(Biomol，Hamburg，德国)、fn-10μg/ml(Boehringer，Mannheim，德国)和ln-50μg/ml(Boehringer，Mannheim，德国)。将它们加入孔中并在5％CO2的湿润空气中在4℃孵育24小时(coll IV，fn)，或者37℃孵育45分钟(ln)。通过加入1％(w/v)BSA(4℃，12h)并用Hepes缓冲液冲洗孔阻断对包被的孔的非特异蛋白质结合。
3.粘附测定对于粘附实验，将胃癌细胞用胶原酶I(Worthington，Freehold，USA)37℃下处理15min使其解离并用RPMI 1640洗涤一次，离心(200g10分钟)，重悬浮在RPMI 1640中，并在5％CO2的湿润空气(37℃)中预孵育30分钟。将100μl培养基中的50,000个肿瘤细胞接种于每个孔中。用结晶紫染色根据Aumeilley等人，和Tietze等人(Aumailley等人，Exp Cell Res 1989；181(2)463-474；和Tietze等人，ExpMol Pathol 1999；66(2)131-139)描述的方法实施粘附细胞的评估。孵育30分钟后，通过用温热的RPMI 1640洗涤两次除去含有未粘附的细胞的上清液。
在室温下用30％(v/v)甲醇/乙醇固定粘附细胞15min。将细胞用0.1％(w/v)结晶紫(Sigma，Hamburg，德国)染色，用蒸馏水充分洗涤，并在室温干燥。将染料用50μl 0.2％(v/v)Triton X-100/孔重悬浮并在ELISA读出器中590nm下(Titertek Multiscan Plus MKII，Flow Laboratories GmbH，Meckenheim，德国)测量颜色产生。光密度(OD)显示与每孔1×103到1×105个细胞的细胞量的线性关系，所述细胞量为通过稀释系列确定的。没有细胞的BSA/聚苯乙烯的对照染色得到0.01-0.07的光密度(OD)值。从实验中所得的那些值减去这些值。
4.磷脂完全制备肿瘤细胞悬浮液后，将磷脂溶液以下面的浓度加入0.05、0.1、0.5、0.75、和1mg/100μl培养基。所用的浓度与随后的体内实验相关。
5.统计学分析所有实验都一式四份地进行三次。数据表达为平均值+/-平均值的标准误(SEM)。用单因素ANOVA进行统计学分析，根据成对比较进行对比。根据Bonferroni将显著性水平调节到α/10＝0.005。
6.结果肿瘤细胞对BSA1％的粘附导致590nm的平均消光为0.27±0.013。用层粘连蛋白(ln)和纤连蛋白(fn)包被导致肿瘤细胞的粘附增加近两倍，平均值分别为0.56±0.09(ln)和1.17±0.1(fn)。癌细胞显示出与胶原IV(coll IV)的最显著的粘附，平均消光为0.97±0.05。
加入PL后所记录的肿瘤细胞对ln的粘附显著减少。与对照相比，该效果是依赖浓度的。甚至最小量的0.05mgPL/100μl都导致0.4±0.02的降低的消光。用0.1或者0.5mg PL/100μl处理揭示消光值分别为0.33±0.05和0.28±0.04。与对照相比肿瘤细胞对层粘连蛋白粘附的相对减少达到59％。用1mg PL/100μl处理不再显示出肿瘤细胞粘附的进一步减少。其平均消光为0.26±0.02。统计学评估揭示与对照组相比对于所有磷脂浓度的显著差异(p＜0.0001)(图13a，b；14)。
低的磷脂浓度不能显著减少肿瘤细胞对fn的粘附。加入0.05mgPL/100μl和0.1mg PL/100μl导致消光的轻微减少，平均值为0.59±0.018和0.6±0.009。然而，用0.5mg PL/100μl(ext.0.44±0.023)以及0.75mg PL/100μl(ext.0.41±0.025)、和1mgPL/100μl(ext.0.39±0.02)处理后可以观察到肿瘤细胞粘附的显著减少。我们发现与ln相似的情况，用0.75mg PL/100μl和1mg PL/100μl PL处理得到相同的结果，表明达到了对粘附的最大影响。与对照值相比肿瘤细胞粘附的相对减少达到35％(图15)。NUGC-4胃癌细胞对胶原IV的粘附与所有其他检查的细胞外基质组分相比增加了。磷脂对coll IV的细胞粘附的影响也是依赖于浓度的。该减少从施用0.05mgPL/100μl后平均消光0.9±0.02到使用1mg PL/100μl后的最大效果，其平均值为0.46±0.03。发现了从0.1到1mg PL/孔的显著差异(p＜0.0001)。与对照值相比，这意味着粘附的肿瘤细胞的最大减少为53％(图16)。
总之，所提供的实验证据表明腹膜内PL具有减少大鼠中结肠肿瘤细胞、裸小鼠中胃癌细胞的粘附的作用，并且抑制胃癌细胞以及直肠癌细胞对用胶原IV、层粘连蛋白和纤连蛋白包被的微量滴定板的粘附。从而这些结果表明PL抑制腹膜肿瘤细胞粘附并且从而适于减少肿瘤转移。
权利要求
1.两亲性脂质在制备减少肿瘤转移的药物组合物中的用途，其中所述两亲性脂质是磷脂和/或鞘磷脂。
2.根据权利要求1的两亲性脂质的用途，其中磷脂为磷酸甘油酯、半乳糖脂、糖基甘油酯和/或磷脂酰胆碱。
3.根据权利要求1或2的两亲性脂质的用途，其中一种单一的特定类型的两亲性脂质或者不同两亲性脂质的组合用于制备药物组合物。
4.根据权利要求1的两亲性脂质的用途，其中肿瘤转移减少是由于肿瘤细胞粘附的抑制、转移细胞粘附的抑制和/或肿瘤转移生长的抑制。
5.根据权利要求1到4之一的两亲性脂质的用途，其中通过肿瘤，特别是恶性肿瘤，例如，胃肠癌，如胃癌、结肠癌或胰腺癌和泌尿生殖系统癌如卵巢癌或者膀胱癌的腹膜内复发的预防性治疗减少肿瘤转移。
6.根据权利要求5的两亲性脂质的用途，其中所述两亲性脂质用作制备用于减少肿瘤转移的药物组合物的唯一活性化合物或者所述两亲性脂质与一种或多种其他活性化合物联合用于制备该药物组合物。
7.根据权利要求1到6之一的两亲性脂质的用途，其中用于制备所述药物组合物的一种或多种其他活性化合物选自抗肿瘤药物和放射活性药物。
8.根据权利要求1到7之一的两亲性脂质的用途，其中磷脂用于患者的治疗性或者预防性治疗。
9.根据权利要求8的两亲性脂质的用途，其中所述患者已经经历治疗性或者缓解性切除。
10.根据权利要求8或9的两亲性脂质的用途，其中患者是哺乳动物。
11.根据权利要求10的两亲性脂质的用途，其中患者是人。
12.根据权利要求1到11之一的两亲性脂质的用途，其中两亲性脂质是磷脂，其作为含有0.05％到25％(w/v)磷脂的水溶液存在。
13.根据权利要求12的用途，其中磷脂作为含有0.5％到20％(w/v)磷脂的水溶液存在。
14.根据权利要求13的用途，其中磷脂作为含有1.5％到10％(w/v)磷脂的水溶液存在。
15.根据权利要求12到14之一的磷脂的用途，其中将磷脂配制成用于局部施用，如滴注或者注射，优选用于腹膜内施用的溶液。
16.制备用于减少肿瘤转移的药物组合物的方法，该方法包括将两亲性脂质与水溶液混合的步骤，其中该两亲性脂质为磷脂和/或鞘磷脂。
17.根据权利要求16的方法，其中磷脂是半乳糖脂或者另一种糖基甘油酯和/或磷脂酰胆碱。
18.根据权利要求16的方法，其中所述两亲性脂质分散在水溶液中。
19.根据权利要求16到18之一的方法，其中分散通过高压匀浆得到。
20.根据权利要求16到20任一项的方法，其中由于肿瘤细胞粘附的抑制、转移细胞粘附的抑制和/或肿瘤转移生长的抑制，肿瘤转移减少。
21.根据权利要求16到20任一项的方法，其中通过肿瘤，特别是恶性肿瘤，例如，胃肠癌，如胃癌、结肠癌或胰腺癌和泌尿生殖系统癌如卵巢癌的腹膜内复发的预防性治疗减少肿瘤转移。
全文摘要
本发明涉及两亲性脂质的用途，用于制备减少肿瘤转移的药物组合物，优选通过肿瘤，特别是恶性肿瘤，例如，胃肠癌，如胃癌、结肠癌、胰腺癌和泌尿生殖系统癌如卵巢癌和膀胱癌的腹膜内复发的预防性治疗减少了肿瘤转移。
文档编号A61K31/688GK1744901SQ200380109417
公开日2006年3月8日 申请日期2003年12月1日 优先权日2002年12月3日
发明者E·施罗策尔, T·韦恩海姆, M·延森, K·-H·特罗伊特纳 申请人:弗雷森纽斯卡比德国有限责任公司