用于实体瘤治疗的EphA3抗体的制作方法

专利名称:用于实体瘤治疗的EphA3抗体的制作方法
用于实体瘤治疗的EphA3抗体
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本申请要求享有2007年3月8日提交的美国临时申请号60/893，848的权益，该申请以参考的方式并入本文。
发明背景
Eph受体酪氨酸激酶(Ephs)属于一大类受体酪氨酸激酶(RTKs)，即在酪氨酸残基上磷酸化蛋白的激酶。Ephs和它们的膜结合ephrin配体(ephrins)控制细胞定位和组织结构(Poliakov, et al. , Dev Cell 7 :465-80, 2004)。与其他受体酪氨酸激酶相反，Eph受体活化不仅需要配体结合和二聚化，而且需要预先形成的配体寡聚体的参与。因此，Eph受体的酪氨酸磷酸化需要ephrin配体以它们的聚集或膜粘附形式存在(Davis et al. ,Science266:816-819,1994)。功能和生化Eph应答在更高的配体寡聚状态时发生(Stein et al.，Genes Dev 12 :667-678,1998)。
在其他模式功能中，各种Ephs和ephrins已被证明在血管发育中起作用。EphB4和ephrin_B2的敲除导致缺乏将毛细血管床重建成血管的能力(Poliakov, et al.,上文)及胚胎致死性。在新形成的成人微血管中还观察到一些Eph受体和ephrins的持续表达(Brantley-Sieders, et al. , Curr Pharm Des 10 :3431-42, 2004 ；Adams, J Anat 202 105-12,2003)。
在成年人中还观察到一些ephrins及其受体不受调节(de_regulated)的再现导致肿瘤侵袭、转移和新生血管发生(Nakamoto, et al.，MicroscRes Tech 59 :58-67, 2002 ；Brantley-Sieders, et al.,上文)。此外，已经发现一些Eph家族成员在多种人类肿瘤的肿瘤细胞上过表达(Brantley-Sieders, D. et al.,上文)；Marme, Ann Hematol 81 Suppl2 S66,2002 ；Booth,et al.，Nat Med 8 :1360-1,2002)。
显性失活的可溶性EphA2或A3蛋白在体外显示对ephrin诱导的内皮细胞功能的作用，在体内显示对肿瘤血管发生和进展的作用(Brantley,et al Oncogene 21 :7011-26,2002 ；Cheng,et al Neoplasia5 :445-56,2003 ；Dobrzanski,et al Cancer Res 64 :910-9,2004)。但是，因为ephrin-A家族成员对Eph A受体不具备特异性,这些研究没有指示EphA3自身是否在肿瘤或者正常组织的血管内皮中起作用。
总之，在本发明之前，一直没有证据显示EphA3在肿瘤血管中存在的内皮细胞上表达。事实上，在EphA3敲除小鼠中没有报道过血管异常(参见，例如，Vaidya et al. Mol.Cell. Biol. 23 :8092-8098，2003)。因此，尽管某些Eph受体和印hrins已经被提及在血管发生及肿瘤形成和进展中发挥作用，但一直没有靶向于肿瘤内皮细胞上EphA3表达的特异性疗法。因此本发明提供了新的治疗靶标及肿瘤治疗方法。
发明概述
本发明基于EphA3在实体瘤的血管上表达这一发现。因此，一方面，本发明提供一种抑制不在肿瘤细胞上表达EphA3的实体瘤的生长的方法，该方法包括施用抗EphA3抗体。在一些实施方案中，抗EphA3抗体在表达EphA3的细胞(尤其是肿瘤血管的内皮细胞)表面，通过例如Fe受体结合来聚集EphA3。在一些实施方案中，EphA3抗体活化EphA3，即使EphA3结合了天然配体。
本发明还提供一种抑制肿瘤生长的方法，包括给患有实体瘤的患者施用a)例如通过Fe受体结合聚集EphA3的抗EphA3抗体，和b)癌症治疗剂。在一些实施方案中，癌症治疗剂破坏微管蛋白组装。所述治疗剂可以与抗EphA3抗体同时施用，或在用抗EphA3抗体治疗后施用。在一些实施方案中，所述治疗剂与抗EphA3抗体共价连接。在其他实施方案中，所述治疗剂是不与EphA3抗体连接的单独的分子。在一些实施方案中，抗EphA3抗体与单克隆抗体IIIA4(mAb IIIA4)竞争结合EphA3并聚集EphA3。在一些实施方案中，所述抗体活化EphA3。
另一方面，本发明提供一种包括具有活性人类同种型的抗EphA3抗体的组合物，其中所述抗体例如通过Fe受体结合聚集EphA3。在一个实施方案中,抗EphA3抗体与mAbIIIA4竞争结合EphA3。在一些实施方案中，所述抗体与mAb IIIA4竞争结合EphA3，并且不阻断ephrin (例如ephrin-A5)与EphA3的结合。在另一个实施方案中，所述抗体结合EphA3并聚集EphA3，但不与mAb IIIA4竞争结合EphA3。在一些实施方案中，所述抗体活化EphA3。本发明的组合物还可以包括抑制肿瘤生长的另一种药剂，例如抑制微管蛋白组装的药剂。
用于本发明方法和/或组合物的抗EphA3抗体可以是重组或嵌合抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是人类抗体，例如，humaneered抗体或人源化抗体。在再一个实施方案中，所述抗体是多克隆抗体。可选择地，所述抗体可以是单克隆抗体。在另外一个实施方案中，所述抗体是包含抗体片段(即Fab，Fab'或Fv)的多价抗体。在另一个实施方案中，所述抗体具有结合免疫效应细胞上的Fe受体的活性人类同种型，例如，IgGl、IgG3、IgM、IgA或IgE。因此，在一些实施方案中，所述抗体包含人类重链恒定区，例如，IgGl或IgG3 Y区。在一些实施方案中，所述抗体可以是化学地交联的IgG。
在一些实施方案中，用于本发明方法和/或组合物的抗体包括mAbIIIA4的Vh和/区。在其他实施方案中，所述抗体包含mAb IIIA4的VH&'区⑶R1、⑶R2和⑶R3。在其他实施方案中，所述抗体包括mAb IIIA4的乂11区⑶R3和'区⑶R3。在一些实施方案中，所述抗体包含表I的重链⑶R1XDR2和⑶R3及表I的轻链⑶R1XDR2和⑶R3。在其他实施方案中，所述抗体包括表I的重链CDR3和表I的轻链CDR3。
本发明还提供通过施用单体的、非积聚的抗体制品抑制实体瘤(不管肿瘤细胞是否表达EpA3)生长的方法，其中所述抗体可聚集EphA3。这种抗体，例如，具有活性同种型，例如，具有人类IgGl或IgG3 Y区。在一些实施方案中，所述抗体活化EphA3。所述抗体可以是重组或嵌合抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是人类抗体，例如,humaneered抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体是多价形式的Fab、Fab'或Fv,例如tri_Fab。在一些实施方案中，用于本发明方法和/或组合物的抗体包含mAb IIIA4的VH和VL区。在其他实施方案中，所述抗体包含mAb IIIA4的Vh和/区⑶R1XDR2和⑶R3 ;或表I的重链⑶R1、⑶R2和⑶R3及表I的轻链⑶R1、⑶R2和⑶R3。在其他实施方案中，所述抗体包含mAb IIIA4的Vh区⑶R3和/区⑶R3。在其他实施方案中，所述抗体包含表I的重链⑶R3和表I的轻链⑶R3。
在一些实施方案中，本发明提供通过施用一种EphA3抗体抑制实体瘤生长的方法,所述抗体例如通过Fe受体结合聚集肿瘤血管内皮细胞上存在的EphA3，条件是抗体不与诸如放射金属(radiometal)或毒素的治疗剂偶联。在一些实施方案中，所述抗体活化EphA3。
在一些实施方案中，本发明提供通过施用化学交联的EphA3抗体抑制实体瘤生长的方法。
另一方面，本发明提供治疗实体瘤的方法，包括施用与靶向于肿瘤细胞表面上的蛋白的治疗方式相比更低剂量的抗体。该方法靶向于肿瘤血管内皮细胞上存在的EphA3受体。因此，可以施用剂量低于约1. Omg/kg，优选低于约O. 5mg/kg，或低于O. lmg/kg的抗体以抑制肿瘤生长。这种抗体可以是本文描述的结合并聚集EphA3的本发明任意抗体。在一些实施方案中，所述抗体活化EphA3。
本发明还提供通过施用EphA3结合剂，例如支架蛋白的多价形式，或特异性结合EphA3并聚集EphA3受体的抗体来抑制肿瘤生长的方法。在典型实施方案中，即使当天然配体(例如诸如ephrin-A5的ephrin)结合了 EphA3时，由诸如抗体的EphA3结合剂诱导的聚集也可以发生。所述结合剂可以是结合EphA3的支架蛋白的多价形式。在一些实施方案中，EphA3结合剂与mAb IIIA4竞争结合EphA3。通过使用抗EphA3抗体来举例说明给肿瘤施用抗EphA3结合剂。但是，本文描述的方法还可以用于其他抗EphA3结合剂。
本发明的EphA3结合剂，例如聚集EphA3受体的EphA3抗体，还可以用于包括新生血管形成在内的其他疾病的治疗。例如，与本文所述相关的EphA3抗体可用于治疗诸如与老化相关的黄斑变性或其他眼内新生血管综合征的视网膜血管病。因此，可以用本文描述的EphA3药剂治疗的其他非肿瘤病症包括风湿性关节炎、银屑病、动脉粥样硬化、糖尿病和其他增殖性视网膜病(包括早产视网膜病，晶体后纤维增生症，新生血管青光眼，老化相关的黄斑变性)、甲状腺增生(包括格雷夫氏病)、血管瘤、角膜及其他组织移植、先兆子痫和慢性炎症。

附图概述
图la-lc.利用EphA3单`克隆抗体IIIA4(mAb IIIA4)检测(a)人恶性黑色素瘤切片,或(b)利用流式细胞术分析各种内皮细胞系,和(C)通过IP/Western Blot分析亲代或过表达EphA3的HEK293T细胞、SK-Mel黑色素瘤细胞、TEC-28肾肿瘤内皮细胞、脑微血管内皮细胞(b-MVEC)或子宫肌层MVECS (m-MVEC)中EphA3。
图2a_2b.子宫内膜内皮细胞上EphA3的表达在延长的组织培养期间消失，(a)通过流式细胞术检查图4中利用免疫细胞化学分析检测的各种细胞表面标记物以及EphA3的表达。显示EphA3/HEK-293T细胞的EphA3表达模式进行比较，(b)在子宫内膜来源的MVECS的连续传代中对EphA3表达的IP/Western印迹分析，如所示(P4-P9)。利用IIIA4-Sepharose从全细胞裂解物免疫沉淀EphA3,并用抗EphA3多克隆抗体进行Western印迹检测。
图3.通过定量实时PCR估计EphA3mRNA表达水平。从分离自各种子宫内膜组织样品的mMVECS中提取总mRNA。平行测定β -肌动蛋白的水平作为内部参照，而ΗΕΚ293Τ细胞的mRNA作为EphA3表达的阳性对照，表示为β -肌动蛋白与EphA3mRNA水平的比率。显示了 3个独立样品的平均值和SD。
图4a_4c.人22RV1前列腺癌细胞中EphA3的表达，(a)通过流式细胞术检查EphA3表达，利用mAb IIIA4和荧光素偶联的抗小鼠抗体进行检测，(b)通过全细胞裂解物的IP/Western Blot分析估算EphA3表达水平，并与EphA3/HEK293T细胞中的表达进行比较。在平行样品中，细胞经预聚集的ephrin-A5Fc或ch_IIIA4刺激后,其EphA3酪氨酸磷酸化利用用于Western印迹分析的抗PY EphA3多克隆抗体进行评价，(c) 22RV1细胞在包被纤维连接蛋白的玻璃载片上培养，并如所述在存在或不存在ephrin-A5Fc的条件下与AleXa546IIIA4温育。固定和渗透化处理细胞的肌动蛋白细胞骨架用Alexa488PhalIoidin染色。
图5a_5b.抗EphA3抗体在体内抑制EphA3抗原阴性肿瘤异种移植物的生长。用嵌合IIIA4抗体(10mg/kg ;1. p.)或载体对照治疗载有人DU-145前列腺癌细胞的裸鼠，每周两次共6周，a)直至治疗结束后50天的平均肿瘤体积(利用游标卡尺测定)，b)治疗结束后50天解剖时的肿瘤重量(平均值+标准偏差)。
图6a_6b.抗EphA3抗体在体内抑制EphA3抗原阳性肿瘤异种移植物的生长。用嵌合IIIA4抗体(10mg/kg ;1. p.)或载体对照治疗载有人LNCaP前列腺癌细胞的裸鼠，每周两次共6周，a)直至治疗结束后22天的平均肿瘤体积(利用游标卡尺测定)，b)治疗结束后22天解剖的肿瘤重量(平均值+标准偏差)。
发明详述
定义
本文使用的“实体瘤”是指组织的异常肿块。实体瘤可以是良性或恶性的。可以利用本发明的方法和组合物治疗的实体瘤的特征在于新生血管形成。肿瘤血管(又称为微血管)的特征在于内皮细胞快速增殖，壁结构差，对血浆蛋白的通透性增加，及响应需要时增加血流的能力有限。肿瘤血管允许肿瘤团的肿瘤细胞获得相对正常细胞的生长优势。实体瘤根据形成它们的细胞类型进行命名。实体瘤的实例是肉瘤、癌(上皮细胞瘤)、黑色素瘤和恶性胶质瘤。
在本发明的背景中“抑制肿瘤的生长”是指减缓肿瘤生长和/或减少肿瘤大小。因此“抑制肿瘤的生长”包括杀死肿瘤细胞以及减缓或遏制肿瘤细胞生长。
本文使用的术语“肿瘤细胞”是指赘生性细胞。该术语包括良性以及恶性的癌细胞。致瘤性转化与肿瘤细胞相对于其来源的细胞类型的表型改变有关。所述改变可以包括接触抑制的消失，形态改变和异常生长(参见，Freshney, Culture of Animal Cells aManual of BasicTechnique (第3版，1994)。在本发明的背景中，“肿瘤细胞”不是指肿瘤血管的细胞。
本文使用的“肿瘤血管内皮细胞”是存在于肿瘤血管内的内皮细胞。
本文使用的“EphA3”是指Eph受体A3。该受体还被称作“人胚胎激酶”、“hek”、“eph样酪氨酸激酶l”、“etkl”*“tyro4”。EphA3属于蛋白酪氨酸激酶家族中的ephrin受体亚家族。EPH和EPH-相关受体已经被暗示介导发育事件。EPH亚家族的受体通常具有单个激酶结构域和I个胞外区，所述胞外区包含I个Cys富集域和2个纤维连接蛋白III型重复。基于ephrin受体的胞外结构域序列的相似性及它们结合ephrin-A和ephrin_B配体的亲和力，ephrin受体被分成两组。EphA3结合ephrin-A配体。EphA3核酸和蛋白序列是已知的。示例性的人EphA3氨基酸序列可以通过登录号(EAW68857)获得。
在本发明中，EphA3的“活化”引起EphA3的磷酸化，并且通常导致细胞变圆。
本文使用的EphA3的“聚集”或“交联”是指EphA3分子在细胞表面的交联。聚集通常会形成活性信号复合体，该复合体引起EphA3的磷酸化。“聚集”通常是EphA3活化的ο
本文使用的涉及到具有活性同种型的抗体制品时的术语“非积聚的(non-aggregated) ”是指有低于约5%的抗体,在一些实施方案中低于约2%,或低于约1%的抗体处于积聚的形式(即，不是单体的形式)。
本文使用的“单体”抗体是指具有两个抗原结合位点的二价抗体。
本文使用的“多价”抗体或“多价”结合剂是指具有超过两个抗原结合位点的抗体或蛋白。
本文使用的“肿瘤细胞上不表达EphA3的实体瘤”是指具有低于约25%的在肿瘤细胞上表达EphA3的细胞的实体瘤。在一些实施方案中，实体瘤具有低于约15%，或低于10%，或低于5%的在肿瘤细胞上表达EphA3的细胞。在其他实施方案中，不表达EphA3的肿瘤细胞是指通过例如免疫组织化学检测，几乎没有或没有可检测的EphA3表达的肿瘤细胞。“几乎没有可检测的EphA3表达”是指表达的量低于不表达EphA3的对照细胞背景的2倍。
在本发明中，“EphA3抗体”或“抗EphA3抗体”可以互换使用来表示结合EphA3的抗体。在一些实施方案中，所述抗体例如通过Fe受体结合聚集EphA3。该术语包括在存在ephrin配体(例如，ephrin_A5)结合的情况下结合EphA3的抗体，以及能够结合配体结合位点的抗体。
“在存在ephrin配体结合的情况下结合EphA3的EphA3抗体”是指不显著阻止诸如ephrin_A5的ephrin配体与EphA3结合的抗体。在包含EphA3和ephrin配体(例如ephrin-A5)的结合反应中，这种抗体的存在使ephrin配体与EphA3的结合减少低于约30%，通常低于20%或10%。
术语“mAb III A4”是指单克隆抗体IIIA4，其最初被激发抗LK63人急性前B白血病细胞以便亲和分离EphA3(Boyd，et al. J Biol Chem267 :3262-3267,1992) 0mAb IIIA4结合天然 EphA3 球状 ephrin 结合结构域(例如，Smith, et al. , J. Biol. Chem 279 :9522-9531,2004)。它被保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of AnimalCellCultures)，登录号为 91061920 (参见，例如，EP 专利号 EP0590030)。
本文使用的“具有活性同种型的抗体”是指具有能够结合免疫效应细胞上存在的Fe受体的人Fe区O的抗体。“活性同种型”包括IgGl、IgG3、IgM、IgA和IgE。该术语涵盖具有包含修饰的人Fe区的抗体,所述修饰是诸如突变或糖组成和/或糖基化水平的改变，能够调节Fe效应物功能。
“Fe区”是指除去第一恒定区免疫球蛋白结构域的抗体恒定区。因此，Fe是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域,IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，及到这些结构域的柔性铰链N端。对IgA和IgM来说，Fe可以包括J链。对于IgG来说，Fe包括免疫球蛋白结构域C Y 2和C Y 3及C Y I和C Y之间的铰链。在本领域应理解Fe区的边界可以变化，但是，人IgG重链Fe区通常被定义为包括残基C226或P230到其羧基端，利用的编号是根据 Kabat 等(1991,NTH Publication 91-3242,National TechnicalInformationService, Springfield, Va.)中的EU索引。术语“Fe区”可以表示分离的该区域，或表示在抗体或抗体片段背景下的该区域。“Fe区”包括天然存在的Fe区等位基因变体以及调节效应物功能的修饰。Fe区还包括不引起生物功能改变的变体。例如，可以从免疫球蛋白Fe区的N端或C端去除一个或多个氨基酸而基本上不损失生物功能。可以根据本领域已知的一般规则选择这类变体以便对活性的影响最小(参见,例如，Bowie, et al.，Science 247 :306-1310,1990)
本文使用的“抗体”是指一种蛋白，其从功能上被界定为一种结合蛋白；从结构上被界定为包含这样的氨基酸序列，该氨基酸序列被技术人员公认为来源于生成所述抗体的动物的免疫球蛋白编码基因的框架区。抗体可以由一个或多个多肽组成，所述多肽基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码。公认的免疫球蛋白基因包括K、λ、α、Υ、δ、e和μ恒定区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分为K或者λ。重链被分为Y、μ、α、δ或者e，分别依次定义免疫球蛋白类型，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
已知典型的免疫球蛋白(抗体)结构单位包括四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(大约25kD)和一条“重”链(大约50-70kD)。每条链的N端限定一个大约100到110个或者更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语可变轻链和可变重链(Vh)分别表示这些轻链和重链。
本文使用的术语“抗体”包括保留结合特异性的抗体片段。例如，存在大量已被良好表征的抗体片段。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区的二硫键处消化抗体产生F(ab)' 2，它是Fab的二聚体，其自身是通过二硫键与Vh-ChI连接的轻链。在温和条件下F(ab) , 2可以被还原以断裂铰链区的二硫键从而将(Fab' )2 二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体基本上是具有部分铰链区的Fab (参见，Fundamental Immunology (基础免疫学)，W. E. Paul,ed.，Raven Press, N. Y. (1993)对于其他抗体片段更详细的说明)。尽管各种抗体片段是根据完整抗体的消化来限定，技术人员理解片段可以化学合成或利用重组DNA方法重新合成。因此，本文使用的术语抗体还包括通过完整抗体的修饰产生的抗体片段或利用重组DNA方法合成的抗体片段。
抗体包括Vh-Vl 二聚体，包括诸如单链Fv抗体(sFv或scFv)的单链抗体(作为单条多肽链存在的抗体)，其 中一个可变重链区和一个可变轻链区被直接地或通过肽接头连接到一起形成连续多肽。单链Fv抗体是共价连接的Vh-V1j,其可以从直接连接或通过肽编码接头连接的包括Vh-和编码序列的核酸表达(例如，Huston, et al. Proc. Nat. Acad.Sci USA, 85 :5879-5883,1988)。尽管Vh和Vl作为单条多肽链互相连接，但Vh和Vl结构域是非共价结合的。可选择地，抗体可以是另一种片段。例如，还可以利用重组技术，以可溶性蛋白或得自展示方法的片段来产生其他片段。抗体还可以包括双抗体(diantibodies)和微型抗体。本发明的抗体还包括诸如羊驼(camelids)的抗体的重链二聚体。为了本发明的目的，所用抗体的形式可以聚集内皮细胞表面上存在的EphA3。因此，在一些实施方案中，抗体处于具有活性同种型的形式。在其他实施方案中，抗体处于多价形式，例如，可以交联EphA3的三价或四价形式。
本文使用的“V-区”是指包括框架1、⑶R1、框架2、⑶R2和框架3部分的抗体可变区结构域，包括⑶R3和框架4，所述部分由于B细胞分化期间重链和轻链V-区基因的重排被添加到V-部分。
本文使用的“互补决定区(OTR) ”是指每条链的三个高变区，其将由轻链和重链可变区确定的4个“框架”区分隔开。CDRs主要负责与抗原表位的结合。每条链的CDRs通常从N端开始连续编号被称为⑶R1、⑶R2和⑶R3，并且通常按照具体⑶R所处的链来识别。因此，Vh⑶R3位于发现其的抗体的重链可变域，而' ⑶Rl是来自发现其的抗体的轻链可变域的⑶R1。
在一个物种内不同轻链或重链的框架区序列是相对保守的。抗体的框架区(组成性轻链和重链的组合框架区)用于在三维空间内定位和排列CDRs。
CDRs和框架区的氨基酸序列可以利用本领域各种公知的定义来确定，例如，Kabat, Chothia,国际 ImMunoGeneTics 数据库(IMGT),和 AbM(参见,例如，Johnson et al.，上文；Chothia & Lesk, 1987, Canonical structures for the hypervariable regionsof immunoglobulins (免疫球蛋白高变区的典型结构).J. Mol. Biol. 196,901-917 ；ChothiaC. et al. ,1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions (免疫球蛋白高变区的构象)· Nature 342,877-883 ；Chothia C. et al. , 1992, structuralrepertoire of the human VH segments (人 VH 部分的结构组成)· J. Mol. Biol. 227,799-817 ；A1-Lazikani et al. , J. Mol. Biol 1997，273 (4))。抗原结合部位的定义还描述于下列文献Ruiz et al. , IMGT,国际 ImMunoGeneTics 数据库· Nucleic Acids Res. , 28,219-221 (2000)；和 Lefranc, Μ. -P.1MGT,国际 ImMunoGeneTics 数据库· Nucleic AcidsRes. Jan I ；29 (I) :207-9(2001) ；MacCallum et al. , Antibody-antigen interactions Contact analysis and binding site topography (抗体-抗原相互作用接触分析和结合位点拓扑图)，J. Mol. Biol.，262 (5)，732-745 (1996);和 Martin et al.，Proc. NatlAcad.Sd.USA,86,9268-9272(1989) ；Martin, etal., Methods Enzymol,203,121-153，(1991) ；Pedersen et al. , Immunomethods, 1,126, (1992);和 Rees et al. , In SternbergM. J. E. (ed.)，Protein Structure Prediction(蛋白结构预测)· Oxford UniversityPress, Oxford,141-1721996)。
“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上与抗体结合的部位。表位可以由邻接氨基酸形成，或由通过蛋白的三级折叠而紧靠的 非邻接氨基酸形成。当暴露于变性溶剂时由邻接氨基酸形成的表位通常被保留，而由三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常丢失。表位通常包括处于独特空间构象的至少3个氨基酸，更常见的，至少5或8-10个氨基酸。确定表位空间构象的方法包括,例如,X-射线晶体衍射法和2维核磁共振。参见，例如，EpitopeMapping Protocols in Methods inMolecular Biology(分子生物学方法的表位作图实验步骤)，Vol. 66，Glenn E. Morris, Ed (1996)。
本文使用的“嵌合抗体”是指一种免疫球蛋白分子，其中(a)恒定区或其一部分被改变、取代或交换，使得抗原结合位点(可变区)与不同的或改变的类型、效应物功能和/或物种的恒定区连接，或与赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物，等等)连接；或(b)可变区或其一部分被改变、取代或与具有不同或突变抗原特异性的可变区或其部分交换；或与另一物种或另一抗体类型或亚类的相应序列交换。
本文使用的“人源化抗体”是指一种免疫球蛋白分子，其中受体人类抗体的CDRs被供体非人类抗体的CDRs取代。人源化抗体的框架序列中还可以包括来源于供体的残基。人源化抗体还可以包括人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。人源化抗体还可以包括既不存在于受体抗体又不存在于引入的CDR或者框架序列中的残基。可以利用本领域已知的方法进行人源化(例如，Jones et al.，Nature 321 :522-525 ； 1986 ；Riechmann et al.，Nature 332 :323-327,1988 ；Verhoeyen et al. , Science239 :1534-1536,1988) ；Presta,Curr· Op. Struct. Biol. 2 :593-596,1992 ;美国专利号 4，816，567)，包括诸如“超级人源化”抗体(Tan et al.，J.1mmunol. 169 :1119,2002)和“表面再建”(例如，Staelens et al.，Mol.1mmunol. 43 :1243, 2006 JPRoguska et al. , Proc. Natl. Acad. Sci USA91 :969,1994)的技术。
在本发明的背景下“humaneered”抗体是指具有参照抗体的结合特异性的改造人抗体。该术语是指包含最小的源自参照抗体的序列的免疫球蛋白分子。通常，通过将编码结合特异性决定簇(BSD)(来自参照抗体重链的CDR3区)的DNA序列与人Vh部分序列连接，及将参照抗体的轻链⑶R3BSD与人/部分序列连接,从而使抗体“humaneered”。美国专利申请公开号20050255552和美国专利申请公开号20060134098提供了用于humaneering的方法。
本文使用的“人”抗体涵盖人源化和humaneered抗体，以及利用已知技术获得的人单克隆抗体。
当涉及到核酸部分时，使用的术语“异源的”表示该核酸包括两个或更多个通常在自然界彼此之间不具有相同联系的子序列。例如，通常通过重组产生的核酸，其具有例如来自无关基因的两个或更多个序列，经排列形成新的功能性核酸。类似地，异源蛋白是指两个或更多个在自然界彼此之间不具有相同联系的子序列。
当涉及到例如细胞，或核酸、蛋白或载体时，使用的术语“重组的”表示所述细胞，核酸，蛋白或载体，已经通过异源核酸或蛋白的导入或天然核酸或蛋白的改变被改造，或所述细胞来源于这样改造过的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中不存在的基因，或者表达否则是异常表达、低表达或者根本不表达的天然基因。本文的术语“重组核酸”表示最初通过核酸的操作，例如利用聚合酶和核酸内切酶在体外形成的核酸，所述核酸处于通常未在自然界发现的形式。采用这种方式可以实现不同序列的可操作连接。因此，线性形式的分离的核酸，或通过将通常不连接的DNA分子连接O在一起而体外形成的表达载体，都被认为是用于本发明目的的重组。应理解一旦重组核酸被制备并再导入宿主细胞或生物体，它 将非重组地复制，即，利用宿主细胞的体内细胞机构而不是体外操作；但是，这种核酸，一旦是重组产生的，尽管随后是非重组地复制，仍被认为是用于本发明目的的重组。类似地，“重组蛋白”是利用重组技术，即通过如上文所述的重组核酸的表达制备的蛋白。
当涉及到蛋白或肽时，短语“特异性(或选择性)结合”抗体或“特异性(或选择性)与...免疫反应”是指确定诸如细胞提取物的异源蛋白群体中存在某种蛋白的结合反应。因此，在指定的免疫分析条件下，特定抗体与具体蛋白序列的结合是背景的至少两倍，更常见的是背景的10到100倍以上。
如本文使用的，“癌治疗剂”是指当给患有癌症的患者施用治疗有效量的药剂时，该药剂将治愈或至少部分遏制疾病的症状及与该疾病有关的并发症。
在两种或更多种多肽(或核酸)序列的背景中，术语“相同的”或者百分比“相同度”是指两个或更多个序列或子序列(例如，抗体序列)，通过使用如下所述缺省参数的BLAST或者BLAST 2. O序列比较算法，或者通过人工比对和目测(参见，例如，NCBI网站)测定出它们是相同的或具有特定百分比的相同氨基酸残基(或核苷酸)(即，当在比较窗口或者指定区域内进行最大对应性的比较和比对时，在特定区域有约60%相同度，优选的70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或者更高的相同度)。然后这种序列被称为“基本上相同的”。“基本上相同的”序列还包括具有缺失和/或添加的序列，以及那些具有取代的序列，以及天然存在的变体，例如，多态性或等位基因变体和人造变体。如下所述，优选的算法能够解决缺口等等。优选的，蛋白序列相同度存在于至少为约25个氨基酸长度的区域，或更优选的为50-100个氨基酸长度的区域，或蛋白的全长。
本文使用的“比较窗口 ”包括参照邻接位点数目(选自通常20到600，通常约50到约200，更常见的约100到约150)之一的部分，其中在两个序列被最佳地对位排列后，序列可以与相同数目的邻接位置的参照序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。可以通过如下方法进行用于比较的序列最适比对，例如，Smith &Waterman的局部同源性算法，Adv. Appl. Math. 2 :482(1981)，Needleman & Wunsch的同源性比对算法，J. Mol. Biol. 48 443 (1970), Pearson & Lipman 的搜索相似性方法，Proc. Nat'1. Acad.Sci USA85 :2444(1988)，这些算法的计算机化实施方式(GAP，BESTFIT，FASTA，and TFASTAin the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group,575ScienceDr. ,Madison, WI),或通过人工比对和目测(参见,例如,Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel et al. , eds. 1995supplement)。
适用于确定百分比序列相同度和序列相似性的算法的优选实例包括BLAST和BLAST 2.0 算法，它们在 Altschul et al.，Nuc. Acids Res. 25 :3389-3402(1977)和Altschul et al. , J. Mol. Biol. 215 =403-410 (1990)中有描述。利用本文描述的参数通过BLAST和BLAST 2. O确定本发明核酸和蛋白的百分比序列相同度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用以下缺省字长(W)为11，期望值(E)为10，M = 5,N = -4和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以 下缺省字长为3，期望值(E)为10，和BL0SUM62评分矩阵(参见 Henikoff&HenikofT，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 89 :10915(1989))比对(B)为50，期望值(E)为10，M = 5，N = -4，和两条链的比较。
两条多肽基本上相同的一个标志是第一个多肽与激发抗第二个多肽的抗体有免疫交叉反应性。因此，一个多肽与第二个多肽通常是基本上相同的，例如，当两个肽仅仅是因为保守取代而不同时。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”是指实质上或基本上不含在天然状态下通常与之相伴的组分的物质。通常利用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相层析法的分析化学技术确定纯度和均质性。在制品中以优势种存在的蛋白是基本上纯化的。在一些实施方案中术语“纯化的”表示在电泳凝胶中蛋白基本上只产生一个条带。优选的，这表示该蛋白至少为85%纯，更优选的至少为95%纯，最优选的至少为99%纯。
涉及氨基酸残基的聚合物时，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可以互换使用。这些术语适用于其中一种或者多种氨基酸残基是相应天然存在氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，也适用于包含修饰残基的天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸功能类似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸，以及那些之后被修饰的氨基酸，例如，羟脯氨酸，Y-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，例如，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如，高丝氨酸，正亮氨酸，甲硫氨酸亚砜，甲硫氨酸甲基锍。这种类似物可以具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或者修饰的肽框架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指一种化合物，其结构不同于氨基酸的一般化学结构，但功能类似于天然存在的氨基酸。
氨基酸可以用它们公知的3字母代号或者IUPAC-1UB BiochemicalNomenclatureCommission(生化命名委员会)推荐的I字母代号表示。同样地，核苷酸可以用它们公认的单字母代码表示。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。就具体核酸序列而言，保守修饰的变体表示那些编码相同或者基本上相同氨基酸序列的核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时，表示基本上相同或相关(例如，天然邻接的)序列。因为遗传密码的简并性，很多功能相同的核酸编码大部分蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子表示丙氨酸的各个位置，该密码子可以被改变为另一个所述对应密码子而不改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，这是一种保守修饰的变异。本文编码多肽的每个核酸序列还描述了该核酸的沉默变异。技术人员清楚在一定情境下，核酸中每个密码子(除了 AUG，其通常是唯一的甲硫氨酸密码子，和TGG，其通常是唯一的色氨酸密码子)可以被改变以产生功能相同的分子。因此，对于表达产物来说描述的序列通常隐含编码多肽的核酸的沉默变异，但这不适用于实际使用的探针序列。
对于氨基酸序列而言，技术人员将明白对核酸、肽、多肽或蛋白序列的单个取代、缺失或添加(其改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小部分氨基酸)是“保守修饰的变体”，其中所述改变导致氨基酸被化学类似的氨基酸取代。提供功能相似氨基酸的保守取代表格是本领域公知的。这种保守修饰的变体附加于本发明的多态性变体、种间同系物和等位基因，但并不排除它们。通常保守取代在以下彼此之间进行1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G) ；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E) ；3)天门冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)，赖氨酸⑷；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W) ；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见，例如Creighton, Proteins(1984))。
`[0073]前言
本发明涉及通过给患有实体瘤的患者施用抗EphA3抗体来抑制肿瘤生长的方法。本发明部分基于这样的发现，即EphA3在实体瘤血管的内皮细胞上表达并可用做抑制肿瘤生长的靶标，甚至在不存在表达EphA3的肿瘤细胞情况下。因此，在本发明中，施用的抗EphA3抗体结合肿瘤血管。
本发明的方法包括施用聚集EphA3的抗EphA3抗体。在一些实施方案中，这种抗体活化EphA3酪氨酸激酶活性。不受理论束缚，这引起美国专利申请20060140957中描述过的导致细胞骨架重排和细胞变圆的信号转导。
在一些实施方案中，用于本发明的抗EphA3抗体不阻断EphA3与ephrin (例如，ephrin-A5)的结合,并能够聚集ephrin受体。在一些实施方案中，所述抗体与mAb IIIA4竞争结合EphA3。这种抗体通常与Mab IIIA4结合相同的表位。在其他实施方案中，所述抗体具有活性同种型，其中重链恒定区可以结合免疫效应细胞上存在的Fe受体。[0077]本文描述的抗EphA3抗体还可以用于治疗除了在血管表达EphA3外还在肿瘤细胞表面表达EphA3的肿瘤。
抗EphA3 抗体
各种抗EphA3抗体都可用于本发明的方法。这类抗体结合EphA3并聚集受体。在一些实施方案中，所述抗体活化EphA3。本发明的抗EphA3抗体可以被激发抗EphA3蛋白或片段，或通过重组产生。许多技术都可用于测定抗体结合特异性。参见，例如，Harlow &Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)中描述的可用于测定抗体特定免疫反应性的免疫分析形式及条件。
在一些实施方案中，抗EphA3抗体是多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是技术人员已知的(例如，Harlow & Lane, Antibodies, ALaboratory manual (1988) ；Methods inImmunology) 0可以在哺乳动物中通过一次或多次注射免疫剂及佐剂(如果需要)激发多克隆抗体。所述免疫剂包括EphA3受体蛋白或其片段。
在一些实施方案中，抗EphA3抗体是单克隆抗体。单克隆抗体可以利用诸如Kohler & Milstein描述的方法(Nature 256:495(1975))的杂交瘤方法制备。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其他合适的宿主动物以引发淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能够产生特异性结合该免疫剂的抗体。可选择地，可以在体外免疫淋巴细胞。
人单克隆抗体可以利用本领域已知的各种技术产生，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227 :381 (1991) ；Marks etal. , J. Mol. Biol. 222 581(1991))。Cole等和Boerner等的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole et al.,Monoclonal Antibodies and CancerTherapy (单克隆抗体和癌症疗法)，ρ· 77 (1985)and Boerner et al. , J. Tmmunol. 147 (I) :86-95 (1991))。类似地，可以通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物(例如，其中内源免疫球蛋白基因已经被部分或完全灭活的小鼠)制备人抗体。在攻击时观察到人抗体的产生，其在各个方面与在人类中观察到的非常类似，包括基因重排、组装 和抗体各项功能。该方法描述于例如，美国专利号5，545，807、5，545，806,5, 569，825,5, 625，126,5, 633，425,5, 661，016，和下列科学出版物Marks etal.，Bio/Technology 10 :779-783(1992) ；Lonberg et al.，Nature 368 :856-859(1994)；Morrison, Nature 368 :812-13 (1994) ；Fishwild et al. , NatureBiotechnology 14:845-51 (1996) ；Neuberger, Nature Biotechnologyl4 :826(1996) ；Lonberg & Huszar,Intern. Rev. Tmmunol. 13 :65-93(1995)。
在一些实施方案中，抗EphA3抗体是嵌合或人源化的单克隆抗体。如上文所述，抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白，其中人抗体的CDR被具有所需特异性、亲和力及能力的非人物种(诸如小鼠、大鼠或兔)的CDR取代。
本发明使用的抗体可以采用多种形式。在一些实施方案中，抗体可以包括Fe区，例如人Fe区。例如，这种抗体包括结合EphA3并具有活性同种型的IgG抗体。在一些实施方案中，所述抗体可以是抗体的活性(即，它可以聚集EphA3)片段或衍生物，诸如Fab、Fab'、F(ab' ) 2、Fv、scFv或单结构域抗体("dAb")。可用于本发明的抗体的其他示例性实施方案包括活化纳米抗体(nanobodies)或活化羊驼抗体。此外还可以利用本领域技术人员公知的方法将这种抗体重组改造。如上所述，这种抗体可以利用已知的技术产生。本领域技术人员理解，在一些实施方案中，当抗体采用可以是单价的形式(例如，Fv或Fab形式)时，该抗体以诸如三价或四价抗体的多价抗体使用。例如，可以使用三价Fab。产生多价抗体的方法是已知的(参见，例如，King et al. , Cancer Res. 54 :6176-6185,1994)。此夕卜，如果使用诸如F(ab' )2片段的二价片段，这种片段处于能够聚集细胞表面上EphA3受体的形式，例如，所处于的抗体形式中可以与效应分子相互作用的区域，比如二价抗体与活性Fe区连接的区域被保留，其中所述活性Fe区可以结合免疫效应细胞(诸如T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞等等)上存在的Fe受体。
在许多实施方案中，用于本发明的抗体具有Fe恒定区，该Fe恒定区具有效应子作用，例如，结合免疫效应细胞上存在的Fe受体。示例性的“效应子作用”包括Clq结合；补体依赖性的细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调，等等。这类效应子作用通常需要Fe区与结合结构域(例如，抗体可变域)组合，并可以利用已知的分析法进行评价(参见，例如，下文引用的参考文献)。
不受理论束缚，具有活性同种型的抗EphA3抗体(例如，能够结合Fe受体)可以在体内诱导表达EphA3的内皮细胞的细胞变圆，导致肿瘤血管的直接破坏。普遍认为由于肿瘤内的高静水压，内皮细胞的变圆导致血管管状结构的破坏和毛细血管的萎缩。
具有活性同种型并结合效应细胞(诸如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和NK细胞)上Fe受体的抗EphA3抗体还可以通过抗体介导的细胞毒性(ADCC)诱导肿瘤血管的破坏。
Fe区可以来自于天然存在的IgGl，或其他活性同种型，包括IgG3、IgM、IgA和IgE。“活性同种型”包括这样的抗体，这些抗体的Fe区包含增加与Fe受体的结合或者提高抗体功效的修饰。这种Fe恒定区可以包括那些增加与Fe受体结合的修饰，诸如突变，糖基化水平的改变等等。存在许多本领域已知的修饰Fe区的方法。例如，美国专利申请公开号20060039904描述了具有增强的效应子作用的Fe受体的变体，包括对一个或多个Fe配体(例如，FcyR, Clq)的结合亲和力被改变。此外，这种Fe变体具有改变的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。其他Fe变体包括以下文献公开的那些变体Ghetie et al.，Nat Biotech. 15 :637-40,1997 ；Duncan et al.，Nature 332 :563-564,1988 ；Lund et al.，J.1mmunol147 :2657-2662,1991 ；Lund et al.，Mol Immunol 29 :53-59,1992 ；Alegreet al.，Transplantation 57 1537-1543，1994 ;Hutchins et al.，Proc NatlAcad Sci USA 92 :11980-11984,1995 ；Jefferis et al.，Immunol Le tt. 44 :111-117,1995 ；Lund et al.，FASEB J 9:115-119，1995 ；Jefferis et al.，Immunol Lett 54 :101-104,1996 ；Lund et al.，J Immunol 157 4963-4969,1996 ；Armour et al. ,Eur J Immunol 29 :2613-2624,1999 ；Idusogie et al.，JImmunol 164 :4178-4184,200 ;Reddy et al. , J Immunol 164 :1925-1933,2000 ；Xu etal.，Cell Immunol 200 16-26,2000 ；Idusogie et al.，J Immunol166 :2571-2575,2001 ；Shields et al.，J Biol Chem 276 :6591-6604,2001 ;Jefferis et al., Immunol Lett 82 57-65. 2002 ；Presta et al.，Biochem SocTrans 30 :487-490,2002 ；Lazar et al.，Proc.Natl Acad. Sc1. USA103 :4005-4010, 2006 ;美国专利号 5，624，821、5，885，573、5，677，425、6，165，745、6，277，375、5，869，046、6，121，022、5，624，821、5，648，260、6，194，551、6，737，056、6，821，505、6，277，375、7，335，742 和 7，317，091 ；以及 PCT 公开 WO 94/2935、W099/58572、WO 00/42072、WO 02/060919 和 WO 04/029207。
在一些实施方案中，Fe区的糖基化可以被改变，例如，改变可以是去糖基化，例如，通过改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点。这种方法更详细地描述于美国专利号5，714，350和6，350，861。还可以制备具有糖基化类型被改变的Fe区，诸如果糖残基量降低的低果糖化Fe变体或二等分GIcNAc结构增加的Fe变体。这类碳水化合物改变可以通过，例如在具有改变的糖基化机构的宿主细胞中表达所述抗体来实现。具有改变的糖基化机构的细胞(包括酵母和植物)在本领域中已有描述，可以用做宿主细胞，以表达本发明的重组抗体从而产生糖基化改变的抗体。用于改变糖基化的技术包括下列公开的那些，例如，Umana et al.，Nat. Biotechnol 17 :176-180,1999 ；Davies, et al.，Biotechnol Bioeng. 74 :288-294,2001 ；Shields et al. , J Biol Chem277 :26733-26740,2002 ；Shinkawa et al., J Biol Chem 278 :3466-3473,2003 ；Niwa et al Cline. CancerRes.1- :6248-6255,2004 ；Presta et al., Biochem Soc Trans 30 :487-490,2002 ；Kandaet al. ,Glycobiologyl7 :104-118, 2006 ;美国专利号 6，602，684,6, 946,292 和 7，214，775 ；美国专利申请公开号 20070248600、20070178551、20080060092、20060253928 ；PCT 公开 WO00/61739,WO 01/292246,WO 02/311140 和 WO 02/30954 ;以及 Potillegent 技术(Biowa,Inc. Princeton, N. J.)；和 GlycoMAb 糖基化工程技术(GLYCART biotechnology AG,Zurich, Switzerland)。
在本发明的一些实施方案中，抗体还被改造以降低免疫原性，例如，以便抗体适合于重复施用。用于产生免疫原性降低的抗体的方法包括人源化和humaneering方法及诸如脱免疫的修饰技术，其中抗体在例如一个或多个框架区被进一步改造以去除T细胞表位。
在一些实施方案中,抗体是humaneered抗体。humaneered抗体是具有参照抗体之结合特异性的改造人抗体，通过以下方式获得将编码参照抗体重链的CDR3区的结合特异性决定簇(BSD)的DNA序列与人Vh部分序列连接，将参照抗体的轻链CDR3 BSD与人/部分序列连接。用于huma neering的方法提供于美国专利申请公开号20050255552和美国专利申请公开号20060134098。
抗体可以被进一步脱免疫，以从抗体的V区去除一个或多个预测的T细胞表位。这种方法描述于，例如WO 00/34317。
在一些实施方案中，可变区由人V基因序列组成。例如，可变区序列与人类种系V基因序列具有至少80%相同度，或至少85%或至少90%相同度。
本发明使用的抗体可以包括人恒定区。轻链恒定区可以是人K或λ恒定区。重链恒定区通常是Y链恒定区，例如，Y-1或Υ-3恒定区。
在一些实施方案中，例如，当抗体是片段时，该抗体可以被偶联到另一分子(诸如聚乙二醇(聚乙二醇化)或血清白蛋白)，例如，以提供延长的体内半衰期。抗体片段PEG化的实例提供于Knight et al. ,Platelets 15 :409, 2004(针对abciximab) ；Pedley et al.,Br. J. Cancer70 :1126,1994(针对抗 CEA 抗体);和 Chapman et al. , Nature Biotech. 17 780，1999。
抗体特异性
用于本发明的抗体结合EphA3，其通常导致EphA3的聚集。适用于本发明的示例性抗体是mAb IIIA4。该抗体结合天然EphA3球状ephrin-结合结构域(Smith et al. , J. BiolChem. 279 :9522-9531,2004 ;和 Vearing et al.，Cancer Res. 65 :6745-6754,2005)。结合EphA3表面的高亲和mAb IIIA4对ephrin_A5与EphA3相互作用的总亲和力几乎没有影响。
在一些实施方案中，使用与mAb IIIA4竞争结合EphA3的单克隆抗体，或与mAbIIIA4结合相同表位的单克隆抗体。可以使用大量竞争性结合分析法中的任一种测量两种抗体与相同抗原结合之间的竞争。例如，为了这个目的可以使用夹心ELISA分析法。在示例性的分析法中，利用捕获抗体包被孔的表面来进行ELISA。然后向捕获表面添加亚饱和浓度的标记抗原。该蛋白将通过特异性的抗体抗原相互作用结合抗体。清洗后，向ELISA中添加连接有可检测部分的二抗。如果该抗体与捕获抗体结合抗原上的相同位点，或干扰与该位点的结合，则该抗体将不能结合靶蛋白，因为所述位点已不再用于结合。但是如果该二抗识别抗原上的不同位点，则它将能够结合。通过对结合的可检测标记物进行定量，可以检测结合。利用单个抗体作为捕获和检测抗体来确定背景，而通过用抗原特异性抗体捕获及利用针对抗原上的标签的抗体进行检测来确定最大信号。利用背景和最大信号作为参照，可以采用配对方式评价抗体以确定特异性。通常通过这种竞争分析法确定特定抗体与另一抗体识别相同表位的能力。
利用如上所述的任意一项分析法，在第一抗体存在的条件下，如果第二抗体与抗原的结合被降低至少30 %，通常至少约40 %、50 %、60 %或75 %，经常是至少约90 %，则第一抗体被认为竞争性抑制第二抗体的结合。
结合亲和力
在一些实施方案中，适用于本发明的抗体对人EphA3具有高的亲和力结合。对于本发明的目的来说，如果抗体的解离常数(Kd) <约ΙΟηΜ，例如，约5nM，或约2nM，或约InM，或更低，则抗体和抗原间存在高亲和力结合。可以使用诸如表面等离子体共振分析法，饱和分析法，或诸如ELISA或RIA的免疫分析法的多种方法测定抗体对其靶抗原的结合亲和力，这些都是本领域技术人员公知的。用于测定结合亲和力的示例性方法是如Krinner等(2007) ,Mol.1mmunol. Feb ；44(5) :916-25. (2006 年 5 月 11 日电子出版)所述，在 BIAcore 2000装置(Biacore AB, Freibu rg, Germany)上利用CM5传感芯片进行表面等离子体共振分析。
抗EphA3抗体可以结合EphA3的任意区域。通常,该抗体聚集EphA3。聚集EphA3的抗体具有诸如IgGl、IgG3、IgM、IgA或IgE的活性人同种型。聚集EphA3的抗体还可以是多价的，即，在本发明的背景中，具有两个以上的抗原结合位点，包括被交联或者多聚化形成多价抗体的单体形式。在一些实施方案中，抗EphA3抗体活化EphA3。
在一些实施方案中，用于本发明的抗体不与EphA3配体竞争结合EphA3，而在其他实施方案中，用于本发明的EphA3抗体可以竞争EphA3配体(诸如ephrin,例如，ephrin-A5)与EphA3的结合。可以利用如上所述的技术鉴定与配体竞争结合EphA3的抗体，其中使用诸如ephrin-A5的ephrin配体替代另一种抗体进行竞争分析。
在示例性的实施方案中，抗EphA3抗体包含mAb IIIA4的 '和Vh区。在其他实施方案中，抗EphA3抗体包含mAb IIIA4的⑶Rsl、2和3。在一些实施方案中，抗EphA3抗体包含mAb IIIA4的⑶R3。表I提供了与mAb IIIA4结合相同表位的抗体的⑶R序列(根据Kabat编号限定)。通过ELISA测定对EphA3抗原的亲和力。因此本发明的抗体可以具有表I所示的重链和/或轻链⑶Rs。[0105]表I
权利要求
1.能聚集EphA3的抗EphA3抗体在制备用于抑制肿瘤细胞上不表达EphA3的实体瘤的生长的药物中的用途。
2.如权利要求
1所述的用途，其中所述抗EphA3抗体能活化EphA3。
3.如权利要求
2所述的用途，其中所述抗EphA3抗体与能抑制微管蛋白组装的癌症治疗剂联合给药。
4.单体的、非积聚的抗EphA3抗体在制备用于抑制实体瘤生长的药物中的用途，其中所述抗EphA3抗体能聚集并活化EphA3。
5.如权利要求
4所述的用途，其中所述抗体以低于约O.lmg/kg的剂量施用。
6.抗EphA3抗体在制备用于抑制肿瘤细胞上不表达EphA3的实体瘤的药物中的用途。
7.如权利要求
6所述的用途,其中所述抗EphA3抗体在存在或不存在ephrin配体结合时结合EphA3。
8.前述权利要求
中任一项所述的用途，其中所述抗EphA3抗体与mAbIIIA4竞争EphA3彡口口
9.前述权利要求
中任一项所述的用途，其中所述抗EphA3抗体是重组或嵌合抗体。
10.前述权利要求
中任一项所述的用途，其中所述抗EphA3抗体是人抗体。
11.前述权利要求
中任一项所述的用途，其中所述抗EphA3抗体是单克隆抗体。
12.前述权利要求
中任一项所述的用途，其中所述抗EphA3抗体是包含抗体片段的多价抗体，所述抗体片段是Fab、Fab'或Fv。
13.前述权利要求
中任一项所述的用途，其中所述抗EphA3抗体包含人Fe区。
14.如权利要求
13所述的用途，其中所述抗EphA3抗体包含活性人YI或γ3同种型。
15.前述权利要求
中任一项所述的用途，其中所述抗EphA3抗体包含表I中的VHgCDR3和Vl区⑶R3。
16.如权利要求
15所述的用途，其中所述VHgCDR3和'区CDR3来自于mAb IIIA4。
17.如权利要求
15所述的用途，其中所述抗EphA3抗体包含选自表I所示Vh区⑶R序列的CDRHl、CDRH2和CDRH3 ;和选自表I所示/区CDR序列的CDRLl、CDRL2和CDRL3。
18.如权利要求
16所述的用途，其中所述抗EphA3抗体包含mAbIIIA4的Vh和/区CDR1、CDR2 和 CDR3。
19.如权利要求
18所述的用途，其中所述抗EphA3抗体包含mAbIIIA4的Vh和 '区。
20.组合物，包含具有活性同种型的单体抗EphA3抗体，其中所述抗体能聚集并活化血管内皮细胞表面存在的EphA3。
21.如权利要求
20所述的组合物，其中所述抗EphA3抗体与mAbIIIA4竞争结合EphA3。
22.如权利要求
20或21所述的组合物，其中所述抗EphA3抗体是重组或嵌合抗体。
23.如权利要求
20到22中任一项所述的组合物，其中所述抗EphA3抗体包含活性人重链恒定Y I或Y3同种型。
24.如权利要求
20到23中任一项所述的组合物，其中所述抗EphA3抗体是人抗体。
25.如权利要求
20到24中任一项所述的组合物，其中所述抗EphA3抗体是单克隆抗体。
26.如权利要求
20到25中任一项所述的组合物，其中所述抗EphA3抗体包含表I的Vh区 CDR3 和 / 区 CDR3。
27.如权利要求
26所述的组合物，其中所述Vh区⑶R3和'区⑶R3来自于mAbIIIA4。
28.如权利要求
26所述的组合物，其中所述抗EphA3抗体包含选自表I所示Vh区⑶R序列的CDRHl、CDRH2和CDRH3 ;和选自表I所示/区CDR序列的CDRLl、CDRL2和CDRL3。
29.如权利要求
27所述的组合物，其中所述抗EphA3抗体包含mAbIIIA4的V1^P'区CDR1、CDR2 和 CDR3。
30.如权利要求
29所述的组合物，其中所述抗EphA3抗体包含mAbIIIA4的Vh和/区。
专利摘要
本发明提供用于实体瘤治疗的包含抗EphA3抗体的方法和组合物。
文档编号A61K39/395GKCN101641115 B发布类型授权 专利申请号CN 200880007626
公开日2013年4月24日 申请日期2008年3月10日
发明者马丁·莱克曼, 安德鲁·马克·斯科特, 克里斯托弗·R·贝炳东, 杰弗里·T·亚兰东 申请人:卡罗拜奥斯制药公司, 莫纳什大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (2),