肿瘤特异的抗体和其用途

肿瘤特异的抗体和其用途
【专利摘要】所提供的是分离的抗体、其片段和衍生物，其结合肿瘤抗原。还提供的是组合物和输试剂，其包括所公开的抗体和其片段和衍生物；细胞，其生产所公开的抗体和其片段和衍生物；方法，其用于生产所公开的抗体和其片段和衍生物；方法，其使用所公开的抗体和其片段和衍生物检测、靶向和/或治疗肿瘤和/或源自其中的转移性细胞，和/或肿瘤干细胞；和方法，其用于在对象中预测癌症的复发。
【专利说明】肿瘤特异的抗体和其用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]此申请为提交于2010年10月8日的美国专利申请系列号12/924，952的部分继续申请，其本身要求提交于2009年10月8日的美国临时专利申请系列号61/249，634的权益。这些申请的每个公开通过引用以其整体并入本文。
[0003]涉及序列表
[0004]与本公开相关的序列表以创建于2011年5月25日并命名为〃1276_5PCT_ST25.txt"的21千字节的ASCII文本文件电子提交至作为国际受理局的美国专利及商标局。通过EFS-网提交的序列表通过引用以其整体并入本文。
发明领域
[0005]本文公开的主题涉及结合存在于肿瘤中的抗原非人分离的抗体或其片段或衍生物，和其使用方法。在一些实施方案中，本文公开的主题涉及分离的抗体或其片段或衍生物(其结合上皮粘蛋白家族成员MUC1)，并涉及用于使用所述抗体或其片段或衍生物检测、靶向和治疗肿瘤和肿瘤细胞的方法，所述细胞包括但不限于，循环肿瘤细胞(CTC)和癌症干细胞(CSC)。
[0006]发明背景
[0007]胰腺癌分别为男性和女性癌症相关死亡的第四和第五主导诱因，在男性中排在肺癌、结肠癌和前列腺癌之后，在女性中排在肺癌、乳腺癌、结肠癌和卵巢癌之后。患者通常表现为晚期疾病，令治疗困难。手术是唯一的治愈性治疗，而在超过80%的患者中发生伴有或不伴有散播至远端器官的局部疾病复发。试图以更好的方式治疗是必要的，其为了改善此疾病的结果。
[0008]通常，致瘤性转化导致在肿瘤细胞中不同的多肽表达改变。例如，某些粘蛋白和突变形式的K-ras原癌基因多肽在90%的胰腺导管腺癌(以下称为"PDA")中过表达，并已成为治疗干预的靶标。然而，至今靶向这些多肽的疫苗仍未特别成功地临床应用。疫苗无法产生长期免疫记忆，可能至少部分是由于肿瘤适应，使得它们逃避免疫识别和杀伤。已临床测试了若干可调节免疫耐受的药剂，但仅具有中度应答，可能是由于药剂的量不足够到达肿瘤位点和/或因为药剂本身涉及(例如可源自它们与正常细胞的结合)不需要的副作用。
[0009]另外，在肿瘤学中不仅治疗患者的原发疾病，而且预防发生转移是主要的挑战。目前相信，转移性疾病可源自成瘤细胞(通常称为肿瘤干细胞或癌症干细胞)从原发肿瘤位点向其它位点的迁移，在那里它们可浸润所述位点并形成新的肿瘤(见，例如，Bonne和Dick, 1997 ；Reya 等人，2001 ；A1-Hajj 等人，2003 ；Pardal 等人，2003 ；Dontu 等人，2004 ；Singh等人，2004 ;Brabletz等人，2005)。因此，当它们存在于患者中时能够鉴定并消灭这些细胞将是有益的。
[0010]因此，需要新的用于检测、靶向和治疗肿瘤和由其衍生的细胞的化合物和方法。
[0011]发明概述[0012]本概述列出本文公开的主题的若干实施方案，并且在许多情况下列出这些实施方案的变化和排列。本概述仅为大量和不同的实施方案的示例。提及的给定实施方案的一或多个代表性的特征同样也是示例性的。这样的实施方案一般可具有或不具有提及的特征；同样，那些特征可应用于本文公开的主题的其它实施方案，不论是否在本概述中列出。为了避免过多重复，本概述不列出这样的特征全部可能的组合。
[0013]在不同的实施方案中，本文公开的主题提供下列:
[0014]分离的抗体，以及其片段和衍生物，其特异性地结合存在于上皮性肿瘤中的粘蛋白-1 (MUCl)和/或突变的K-ras原癌基因多肽。
[0015]分离的核酸，其编码本文公开的主题的分离的抗体和/或其子序列。
[0016]抗体，例如单克隆抗体、和/或肽、片段、和/或其衍生物，其特异性结合肿瘤，例如上皮肿瘤，包括胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、乳腺肿瘤、结肠直肠肿瘤、和源自它们的转移病灶。
[0017]抗体，以及其片段和衍生物，其特异性结合存在于MUCl多肽和/或突变体K-raf多肽中的表位，在某些实施方案中结合存在于人MUCl多肽中的表位。在一些实施方案中，表位存在于SEQ ID NO: 1-3任一中。
[0018]抗体，以及其片段和衍生物，其特异性结合使用来自小鼠模型的蛋白裂解物产生的MUCl (在一些实施方案中为人MUC1)和突变的K-rasG12D，所述小鼠模型将MUCl和突变的K-rasG12D作为肿瘤相关的抗原呈递。
[0019]包含抗体的嵌合分子，以及其片段和衍生物，其连接于效应子和/或免疫调节剂，其中抗体(或其片段或衍生物)特异地结合在MUCl多肽和/或突变的K-ras多肽中存在的表位。在一些实施方案中，效应子选自:表位标签、第二抗体(或其片段或衍生物)、标记、细胞毒素、脂质体、放射性核素、药物、前药(prodrug)和螯合物，并且其中免疫调节剂选自，例如表3中列出的物质。`
[0020]抗体，以及其片段和衍生物，其偶联于免疫调节剂；例如，表3中列出的免疫调节剂。
[0021]抗体，以及其片段和衍生物，其偶联于诊断剂。
[0022]抗体，以及其片段和衍生物，其被制备于包含一或多种药物学可接受的载体和/或赋形剂的组合物中。
[0023]用于诱导免疫应答的方法，其在一些实施方案中包括将本文公开的抗体，其片段和/或衍生物，和/或组合物引入至对象，例如但不限于，人。
[0024]用于检测癌性细胞的方法，其包括将偶联于可检测的标记的抗体或其片段或衍生物引入到对象(例如但不限于人)中，所述抗体或其片段或衍生物可特异性结合MUCl多肽和/或突变的K-ras多肽。
[0025]杂交瘤细胞，其产生本文公开的主题的抗体、片段和/或衍生物，例如但不限于单克隆抗体，其可特异性结合MUCl多肽、突变的K-raf多肽或两者。
[0026]针对上皮癌症的疫苗，其包含本文公开的主题的抗体、片段和/或衍生物，以及一或多种药物学可接受的载体和/或赋形剂，任选地另外包含一或多种免疫调节剂。
[0027]更具体地，在一些实施方案中，本文公开的主题提供了分离的抗体或其片段或衍生物，其包含TAB-004单克隆抗体的互补决定区(⑶R)。在一些实施方案中，分离的抗体或其片段或衍生物为多克隆的。在一些实施方案中，分离的抗体或其片段或衍生物为单克隆的。在一些实施方案中，分离的抗体或其片段或衍生物为人的或人源化的。在一些实施方案中，分离的抗体或其片段或衍生物选自(a)由2010年12月16日以登录号PTA-11550保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC), 10801University Boulevard,Manassas, Virginia,20110-2209, United States of America的杂交瘤细胞系TAB-004产生的单克隆抗体；(b)嵌合抗体，或其片段或衍生物；(c)人源化抗体，或其片段或衍生物；(d)人抗体，或其片段或衍生物；(e)单链抗体，或其片段或衍生物；和(f)Fab片段；其中所述嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体或Fab片段包含单克隆抗体TAB-004的CDR。在分离的抗体或其片段或衍生物的一些实施方案中，所述⑶R包括下述的一或多种:(i)包含SEQ ID N0:8的重链 CDRl ； (ii)包含 SEQ ID NO:9 的重链 CDR2 ；(iii)包含 SEQ ID NO: 10 的重链 CDR3 ；iv)包含 SEQ ID NO: 11 的轻链 CDRl ；v)包含 SEQ ID NO: 12 的轻链 CDR2 ;和(vi)包含 SEQ IDNO: 13的轻链CDR3 ;在分离的抗体或其片段或衍生物的一些实施方案中，重链可变区域包含SEQ ID N0:5或由包含SEQ ID NO:4的核酸分子编码；和/或轻链可变区域包含SEQ IDNO:7或由包含SEQ ID NO:6的核酸分子编码。
[0028]本文公开的主题还提供了包含本文公开的抗体或其片段或衍生物以及一或多种药物学可接受的载体和/或赋形剂的组合物。在一些实施方案中，一或多种药物学可接受的载体和/或赋形剂对在人中使用是可接受的。
[0029]本文公开的主题还提供了包含本文公开的与活性剂缀合的抗体或其片段或衍生物的组合物。在一些实施方案中，活性剂选自放射性分子、放射性核素、敏化剂分子、成像剂、放射性同位素、毒素、细胞毒素、抗生血管剂、抗肿瘤剂、化疗剂、免疫调节剂、细胞因子、报告基团和它们的组合。在一些实施方案中，放射性同位素选自kK211A^212PIk212BI125K1311、35S和3H。在一些实施方案中，免疫调节剂选自吲哚胺_2，3-双加氧酶(IDO)抑制剂，任选地1-甲基-DL-色氨酸(IMT) ;EP2/EP4受体拮抗剂；环氧合酶抑制剂，任选地吲哚美辛(indomethacin);和树突状细胞活化剂,任选地CpG寡脱氧核苷(CpG 0DN)。
[0030]本文公开的主题还提供了包含本文公开的抗体或其片段或衍生物的试剂盒。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒包括本文公开的抗体或其片段或衍生物的使用说明书。
[0031]本文公开的主题还提供了用于将活性剂靶向输送到肿瘤细胞的输送载体(vehicle)。在一些实施方案中,本文公开的输送载体包括一或多种祀向剂,其包含本文公开的抗体或其片段或衍生物。在一些实施方案中，活性剂包括放射性分子、放射性核素、敏化剂分子、成像剂、放射性同位素、毒素、细胞毒素、抗生血管剂、抗肿瘤剂、化疗剂、免疫调节剂、细胞因子、报告基团和它们的组合。
[0032]本文公开的主题还提供了可产生本文公开的抗体或其片段或衍生物的分离的细胞。在一些实施方案中，分离的细胞为可产生本文公开的抗体的杂交瘤细胞。在一些实施方案中，杂交瘤为在布达佩斯条约的条款下在2010年12月16日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC), 10801Uni versity Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, UnitedStates of America的ATCC登录号为PTA-11550的杂交瘤细胞系。
[0033]本文公开的主题还提供了用于检测生物学样品中单克隆抗体TB-004所结合的表位的存在的方法。在一些实施方案中，所述方法包括:使生物学样品与一或多个本文公开的分离的抗体或其片段或衍生物接触；和检测生物学样品中单克隆抗体TAB-004所结合的表位的存在。在一些实施方案中，分离的抗体或其片段或衍生物可与存在于粘蛋白(MUCl)多肽中的表位和/或存在于K-ras多肽，任选地突变体K-ras多肽中的表位相结合。
[0034]本文公开的主题还提供了用于制备抗体或其片段或衍生物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在所述抗体，其片段或衍生物表达的条件下培养本文公开的主题的分离的细胞或本文公开的主题的杂交瘤；和从所述细胞或杂交瘤和/或从所述细胞或杂交瘤生长的环境中回收所述抗体或其片段或衍生物。
[0035]本文公开的主题还提供了用于检测对象中的肿瘤和/或癌细胞方法。在一些实施方案中，所述方法包括在足以使本文公开的抗体或其片段或衍生物结合生物学样品中，如果存在，存在于肿瘤和/或癌细胞上的表位的条件下，使对象中的或分离自对象的生物学样品与包含本文公开的抗体或其片段或衍生物的组合物接触；和检测本文公开的抗体或其片段或衍生物与表位的结合，其中检出结合表明在对象中存在肿瘤和/或癌细胞。在一些实施方案中，肿瘤和/或癌细胞为胰腺肿瘤、乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、结肠肿瘤或直肠肿瘤，和/或源自其中的转移性细胞，其任选地表达MUC1、突变体K-ras或两者。在一些实施方案中，本文公开的抗体或其片段或衍生物与可检测的标记缀合，所述标记包含成像剂，其在一些实施方案中选自顺磁性、放射性和荧光离子。在一些实施方案中，放射性成像剂选自伽马发射体、正电子发射体和X射线发射体。在一些实施方案中，放射性成像剂选自43K、52Fe,57C0、67Cu、67Ga、68Ga、77Br、81Rb/81MKr、87MSr、99MTC、mIn、113In、1231、1251、127Cs、129Cs、1311、1321、197Hg、2°3Pb和2tl6Bi。在一些实施方案中，生物学样品为血液样品或源自其中的级分。
[0036]本文公开的主题还提供了用于治疗对象中的肿瘤的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向对象施用包含与活性剂缀合的本文公开的抗体或其片段或衍生物的组合物，由此所述活性剂与肿瘤接触，从而治疗肿瘤。在一些实施方案中，活性剂包含治疗剂，任选地为化疗剂、毒素、放疗剂或其组合。在一些实施方案中，化疗剂选自抗肿瘤药物、细胞因子、抗代谢物、烷化剂、激素、氨甲喋呤、多柔比星、柔红霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、美法仑、苯丁酸氮芥、氮芥、环磷酰胺、顺钼、长春地辛、长春花生物碱、丝裂霉素、博莱霉素、嘌呤硫素、巨毛霉素、1，4-苯醌衍生物、三亚胺醌、类固醇、氨基蝶呤、蒽环类抗生素、秋水仙胺、依托泊苷、光辉霉素、多柔比星、柔红霉素、长春新碱、新制癌菌素、巨毛霉素、a -鹅膏蕈碱、及它们的组合。在一些实施方案中，毒素选自拉塞尔氏蝰蛇毒、活化的因子IX、活化的因子X、凝血酶、磷脂酶C、眼镜蛇毒因子、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、假单胞菌外毒素、白喉毒素、牛胰核糖核酸酶、美洲商陆抗病毒蛋白、相思子毒素、相思子毒素A链、白树毒素、皂草素、蒴莲根毒素、槲寄生凝集素、蒴莲素、和它们的组合。在一些实施方案中，放疗试剂选自 47SC、67Cu、9°Y、1(l9Pd、1231、1251、1311、186Re、188Re、199Au、211At、212Pb、212B1、32P、33P、71Ge、77As、ici3PtKici5RKmAgj19SlK121SrK 131Cs,143Pr^161Tb,177Lu^191Os,193MPt 和 197Hg。
[0037]本文公开的主题还提供了用于在对象中抑制肿瘤生长的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向携带有肿瘤的对象施用包含单克隆抗体TAB-004的互补决定区域(CDR)的分离的抗体或其片段或衍生物。在一些实施方案中，肿瘤为胰腺肿瘤、乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、结肠肿瘤或直肠肿瘤，和/或源自其中的转移性细胞，其任选地表达MUC1、突变体K-ras或两者。在一些实施方案中，TAB-004的⑶R包括下述的一或多种:包含SEQ IDNO:8的重链CDRl ;包含SEQ ID NO:9的重链CDR2 ;包含SEQ ID NO: 10的重链CDR3 ;包含SEQ ID NO: 11 的轻链 CDRl ;包含 SEQ ID NO: 12 的轻链 CDR2 ;和 / 或包含 SEQ ID NO: 13 的轻链⑶R3。在一些实施方案中，重链可变区域包含SEQ ID NO:5或由包含SEQ ID NO:4的核酸分子编码；和/或轻链可变区包含SEQ ID NO:7或由包含SEQ ID NO:6的核酸分子编码。
[0038]对本文公开的治疗方法而言，在一些实施方案中，所述方法还包括向对象施用一或多种常规抗肿瘤治疗。在一些实施方案中，所述一或多种抗肿瘤治疗选自放疗、化疗、另外的免疫疗法、抗炎症治疗，和它们的组合。在一些实施方案中，抗炎症治疗包括向对象施用环加氧酶抑制剂，任选地为环加氧酶-2特异的抑制剂。一或多种另外的抗肿瘤治疗包括向对象施用吉西他滨(4-氨基-1-[2_脱氧-2，2 二氟-0 -D-赤式-戍呋喃糖基)口密P定-2 (IH)-酮-2’, 2’ - 二氟-2’ -脱氧胞苷))和塞来昔布(4-[5- (4-甲基苯基)-3- ( 二氟甲基)吡唑-1-基]苯磺酰胺)，或其任一或两者的药物学可接受的盐。
[0039]本文公开的主题还提供了用于纯化癌症干细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括提供疑似包含癌症干细胞的细胞群；鉴定结合包含单克隆抗体TAB-004的CDR的抗体或其片段或衍生物的细胞亚群；和纯化所述亚群。在一些实施方案中，所述细胞群包括分离自具有肿瘤和/或癌症的对象的循环细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法还包括在鉴定步骤之前和/或纯化步骤之后从细胞群中移除谱系阳性(Iin+)细胞。
[0040]本文公开的主题还提供了在对象中用于将活性剂靶向至循环癌症干细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使循环癌症干细胞与包含本文公开的抗体或其片段或衍生物和一或多种活性剂的组合物相接触，所述抗体或其片段或衍生物包含单克隆抗体TAB-004的CDR，任选地其中所述一或多种活性剂包含治疗剂，任选地为化疗剂、毒素、放疗剂或其组合。在一些实施方案中，所述治疗剂包括免疫调节剂，任选地其中的免疫调节剂选自吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)抑制剂，任选地1-甲基-DL-色氨酸(IMT) ;EP2/EP4受体拮抗剂；和树突状细胞活化剂，任选地CpG寡脱氧核苷酸(CpG 0DN)。
[0041]本文公开的主题还提供了用于预后之前治疗过癌症的对象中的癌症复发的方法。在一些实施方案中，所述方法包括分离来自患有癌症的对象的包含循环细胞的生物学样品；在足以使本文公开的抗体或其片段或衍生物结合生物学样品中，如果存在，存在于肿瘤和/或癌细胞上的表位的条件下，使所述生物学样品与本文公开的抗体或其片段或衍生物相接触；和鉴定生物学样品中结合所述抗体或其片段或衍生物的一或多种循环细胞，从而在对象中预后癌症的复发。在一些实施方案中，生物学样品包括血样、淋巴样品或其级分。在一些实施方案中，癌症为胰腺癌或乳腺癌。在一些实施方案中，抗体或其片段或衍生物选自由在布达佩斯条约的条款下于2010年12月16日在美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801University Boulevard, Manassas, Virginia,20110-2209, United Statesof America保藏为登录号PTA-11550的杂交瘤细胞系TAB-004产生的单克隆抗体；嵌合抗体，或其片段或衍生物；人源化抗体，或其片段或衍生物；人抗体，或其片段或衍生物；单链抗体，或其片段或衍生物；和Fab片段，以及其中所述嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体或Fab片段包含单克隆抗体TAB-004的互补决定区CDR。在一些实施方案中，单克隆抗体TAB-004的⑶R包括下述的氨基酸序列:包含SEQ ID NO: 8的重链⑶Rl ;包含SEQ IDNO:9的重链CDR2 ;包含SEQ ID NO: 10的重链CDR3 ;包含SEQ ID NO: 11的轻链CDRl ;包含SEQ ID NO: 12的轻链⑶R2 ;和包含SEQ ID NO: 13的轻链⑶R3。在一些实施方案中，重链可变区域包含SEQ ID NO:5或由包含SEQ ID NO:4的核酸分子编码；和/或轻链可变区包含SEQ ID N0:7或由包含SEQ ID N0:6的核酸分子编码。[0042]本文公开的主题还提供了用于在对象中预后癌症进展的方法。在一些实施方案中，所述方法包括分离来自患有癌症的对象的包含循环细胞的生物学样品；在足以使本文公开的抗体或其片段或衍生物结合生物学样品中，如果存在，存在于肿瘤和/或癌细胞上的表位的条件下，使所述生物学样品与本文公开的主题的抗体或其片段或衍生物相接触；和鉴定生物学样品中结合所述抗体或其片段或衍生物的一或多种循环细胞，从而在对象中预后癌症进展。在一些实施方案中，生物学样品包括血样、淋巴样品或其级分。在一些实施方案中，癌症为胰腺癌或乳腺癌。在一些实施方案中，抗体或其片段或衍生物选自由根据布达佩斯条约的条款于2010年12月16日在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard, Manassas， Virginia，20110-2209， United States ofAmerica保藏为登录号PTA-11550的杂交瘤细胞系TAB-004产生的单克隆抗体；嵌合抗体，或其片段或衍生物；人源化抗体，或其片段或衍生物；人抗体，或其片段或衍生物；单链抗体，或其片段或衍生物；和Fab片段，以及其中所述嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体或Fab片段包含单克隆抗体TAB-004的互补决定区CDR。在一些实施方案中，单克隆抗体TAB-004的⑶R包括下述的氨基酸序列:包含SEQ ID NO: 8的重链⑶Rl ;包含SEQ IDNO:9的重链CDR2 ;包含SEQ ID NO: 10的重链CDR3 ;包含SEQ ID NO: 11的轻链CDRl ;包含SEQ ID NO: 12的轻链⑶R2 ;和包含SEQ ID NO: 13的轻链⑶R3。在一些实施方案中，重链可变区域包含SEQ ID NO:5或由包含SEQ ID NO:4的核酸分子编码；和/或轻链可变区包含SEQ ID N0:7或由包含SEQ ID N0:6的核酸分子编码。在一些实施方案中，癌症进展包括癌症在对象中转移。
[0043]本文公开的主题还提供了核酸分子，其包含SEQ ID N0:4和6中的何一，和/或编码SEQ ID N0:5和7-13中的任一。在一些实施方案中，分离的核酸分子存在于载体中，其在一些实施方案中为表达载体。在一些实施方案中，分离的核酸分子存在于可操作地连接于一或多种另外编码抗体分子子序列的核苷酸序列的表达载体中，从而在将表达载体引入适当的宿主内时，宿主细胞表达完整的包含SEQ ID NO:5和7-13的一或多个的重组抗体，或其片段或衍生物。
[0044]因此，本文公开的`主题的目的是提供结合存在于肿瘤中的抗原的分离的抗体、和其片段和衍生物。
[0045]上文陈述了本文公开的主题的目的，其通过本文公开的组合物和方法完整或部分地实现，当结合本文下述最佳描述的附图，随着描述进行，其它目的将变得明显。
[0046]附图简述
[0047]图1A和IB为描绘了本文公开的主题的示例性抗体与人或鼠的胰腺肿瘤特异性结合的一系列显微照片。画栏(panel)中深色染色表明示例性抗体与样品中存在的细胞的阳
性结合。
[0048]图1A为描绘了示例性抗体与0期(作为阴性对照的正常胰腺组织)和2-4期的人肿瘤结合的一系列显微照片。
[0049]图1B为描绘了本文公开的主题的示例性抗体与携带了人MUCl转基因和K-rasG12D突变的6、16、26和34周大的转基因小鼠的胰腺中存在的自发性肿瘤结合的一系列显微照片。
[0050]图2A-2C为描绘了本文公开的主题的示例性抗体与人乳腺肿瘤组织(图2A和2B)特异性结合但不与毗邻的正常乳腺组织结合(图2C)的一系列显微照片。
[0051]图3为显示了创建在胰腺中表达Cre重组酶、突变体K-ras原癌基因多肽和人MUCl多肽的三转基因鼠株系的途径原理图(左上栏)。此鼠发展出胰腺癌，其细胞用于产生原代肿瘤细胞系KCM(下栏)。KCm细胞系用于测试本文公开的主题的单独或缀合CpG寡脱氧核苷酸(CpG 0DN)的示例性抗体(图中表示为“TAB”并在本公开中为“TAB-004”)的结合。确定未缀合的和缀合的抗体以相等亲和力结合KCM胰腺细胞系(右上栏)。
[0052]图4A和4B为显示了本文公开的主题的示例性抗体(TAB-004)增强了天然杀伤细胞(NK)的细胞毒性以杀伤靶标肿瘤细胞。抗体与CpG ODN的缀合也增强了此效果，从而证明示例性抗体能够在体内增强抗肿瘤免疫应答。
[0053]图4A为线图，显示了示例性TAB-004抗体相对于阴性对照(无TAB-004抗体)，以不同的效应子(NK细胞)与靶的比值(E:T比值)增强了 KCM肿瘤细胞特异性裂解。
[0054]图4B为柱状图，显示了相对于未缀合的抗体，示例性TAB-004抗体与CpG ODN的缀合以不同E:T比值进一步增强了肿瘤细胞特异性裂解。
[0055]图5A和5B展示了为测试本文公开的主题的示例性抗体(TAB-004)和其缀合物在MUCl转基因(MUClTg)小鼠中降低所建立的KCM肿瘤的肿瘤体积的能力而设计的实验的结果。
[0056]图5A为线图，其显示了在用磷酸盐缓冲液(PBS)单独处理(阴性对照；实心方块)、CpG ODN单独处理(X)，未缀合的TAB-004抗体(空心圆圈)，或TAB-004-CpG ODN缀合物(实心圆圈)处理的小鼠中所测量的肿瘤体积(用游标卡尺测量的毫米)。
[0057]图5B为柱状图，其 显不了在施用最终处理后19和27天小鼠中肿瘤体积的变化。值得注意的是，当与对照小鼠(即PBS单独，CpG单独，或TAB-004单独处理)相比时，观察到在处理后19和27天，用TAB-004-CpG ODN处理的小鼠中的肿瘤体积没有增加。*:p〈0.5。PBS单独(阴性对照；白色柱)；CpG ODN单独(阴影柱)；未缀合的TAB-004抗体(黑色柱);TAB-004-CpG ODN缀合物(交叉阴影柱)。
[0058]图6为本文公开的主题的示例性组合物和其示例性用途的原理图。ADCC-抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；CDC-补体依赖性细胞毒性；ADEPT-抗体导向的酶前药疗法。
[0059]图7A和7B为CD133+ (图7A)比对CD24+/CD44+/EpCAM+ (图7B)细胞的荧光激活细胞分选(FACS)分离物和本文公开的TAB-004抗体与这些群体结合的程度的直方图。每栏左侧的线对应用阴性对照抗体分选，而每栏右侧的线对应用TAB-004抗体分选。
[0060]图8A-8D为FACS散点图，显示了 TAB-004抗体与胰腺肿瘤(“肿瘤I ”)和毗邻的正常组织(“正常”)的结合，其使用TAB-004抗体和直接针对CXC趋化因子受体4(CXCR4)的抗体。MUCl:TAB-004抗体；CXCR4:抗-CXCR4抗体；FL1_H:荧光染色I度(荧光-FITC)；FL2-H:荧光染色2度(藻红蛋白-PE) ；SSC-H:侧向散射度；FSC_H:前向散射度；FL4_H:荧光染色4度(藻蓝蛋白-APC)。
[0061]图8A为散点图，其显示了在缺乏任一抗体下的细胞的分布。图8B为散点图，其显示了用同种型对照染色的细胞的分布。图8C为一系列散点图，其显示了在正常组织中用TAB-004抗体与CXCR4抗体染色的细胞分布的比对。图8D为一系列散点图，其显示了在胰腺癌组织中用TAB-004抗体与CXCR4抗体染色的细胞分布的比对。
[0062]图9A-9C为一系列FACS点图，其显示了本文公开的主题的TAB-004抗体在胰腺癌患者中检测循环肿瘤细胞优于标准EpCAM抗体。未染色的细胞(最左侧黑色线)；EpCAM-PE (0.lmg/ml)染色的细胞(深灰色线)；TAB-004_PE (0.lmg/ml)染色的细胞(最右侧黑线)；TAB-004-PE(0.02mg/ml)染色的细胞(浅灰色线)；TAB-004_PE (0.004mg/ml)染色的细胞(中等灰色线)。“-PE”表示为了分选的目的，抗体标记有藻红蛋白。
[0063]在图9A中，TAB-004-PE抗体检测到PANCl胰腺癌细胞系细胞。在图9B和9C中，TAB-004-PE抗体在来自2个患者(分别为患者号I和患者号2)的血液中(见图9B中最右侧黑色线和图9C中最右侧的黑色和浅灰色线)检测到循环肿瘤细胞存在，但目前使用的EpCAM-PE抗体(见图9B和9C中浅灰色线)检测不到。
[0064]图10为酶免疫测定(EIA)中CA15-3抗原特异的抗体与TAB-004在血浆中检测癌症细胞表现的比较柱状图。白色框:TAB-004抗体。黑色框:CA15-3。虚线:TAB-004正常阈值；点线:CA15-3正常阈值。
[0065]图11与基于CA15-3的EIA相比，TAB-004用于检测胰腺癌患者血浆中作为分期的函数的释放的(shed)MUCl水平的酶免疫测定中的表现的柱状图。白色框:TAB_004抗体。黑色框:CA15-3。
[0066]序列表简述
[0067]SEQ ID NO:1为人MUCl基因产物的氨基酸序列。它对应于GENBANK?登录号 AAA60019。
[0068]SEQ ID NO: 2为人K-ras原癌基因产物的氨基酸序列。它对应于GENBANKf)登录号 NP_004976。
[0069]SEQ ID NO: 3为本文公开的TAB-004抗体在ELISA测定中可结合的肽的氨基酸序列。因此所述肽包括TAB-004抗体特异性结合的表位。
[0070]SEQ ID NO:4和5分别为本文公开的TAB-004抗体的重链的核苷酸和所编码的氨
基酸序列。
[0071]SEQ ID N0:6和7分别为本文公开的TAB-004抗体的轻链的核苷酸和所编码的氨
基酸序列。
[0072]SEQ ID N0:8-10分别为本文公开的TAB-004抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3氨
基酸序列。
[0073]SEQ ID勵:11-13分别为本文公开的了48-004抗体的轻链的0)1?1、0)1?2和0)1?3氨基酸序列。
[0074]发明详述
[0075]现在将通过参考所附附图和实施例更完整地在下文描述本文公开的主题，其中显示了本文公开的主题的代表性的实施方案。然而，本文公开的主题可以以不同的形式实施，并不应该被解释为局限于本文列出的实施方案内。相反，提供这些实施方案使得这项公开是彻底的和完整的，也能向本领域的技术人员完全传达本文公开的主题的范围。
[0076]1.定义
[0077]本文所用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，并不是为了限制本文公开的主题。
[0078]可相信下述术语将被本领域普通技术人员很好地理解，列出下述定义以便于解释本文公开的主题。
[0079]除非下文另有定义，本文使用的所有的技术和科学术语应当具有如本领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。提及引用本文所采用的技术意指如本领域通常所理解的，其包括对本领域技术人员将是显而易见的这些技术的变化或等效的替代技术。可相信下述术语将被本领域普通技术人员很好地理解，列出下述定义以便于解释本文公开的主题。
[0080]为了描述本文公开的主题，应理解将公开许多技术和步骤。这些技术中每种都具有各自的益处并每种还可与一或多种，或在一些情况下，全部其它公开的技术联合使用。
[0081]因此，为了清楚起见，本说明书将避免以不必要的方式重复单个步骤的每个可能的组合。然而，应以理解这样的组合完全在本文公开的领域和主张的主题的范围内的方式阅读本说明书和权利要求书。
[0082]遵循长期以来的专利法惯例，当在本申请中，包括权利要求中使用时，术语“a”、“an”和“the”指“一或多个”。例如，短语“抗体”指一或多个抗体，包括相同抗体的复数形式。相似地，当本文采用短语“至少一个”指代实体时，意指，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100或更多该实体，包括但不限于1-100之间和大于100的
所有数字值。
[0083]除非另有说明，在本说明书和权利要求书中所使用的所有表达成分量、反应条件等的数字在所有情况下应被理解为被术语“大约”所修饰。如本文中所用，当指可测量的值例如质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的量的时候，术语“大约”意指涵盖对特定数值的在一些实施方案中±20%,在一些实施方案中±10%,在一些实施方案中国±5%、在一些实施方案中±1%，在一些实施方案中±0.5%和在一些实施方案中±0.1%的变化，因为这样的变化是适合于进行公开的方法和 /或采用公开的组合物。因此，除非有相反表示，说明书和所附权利要求书中表述的数字参数均为近似值，其可能有所不同，取决于本文公开的主题试图获取的所需特性。
[0084]如本文中所用，当用于一系列实体的上下文中时，术语“和/或”意指单独地或组合地表示的实体。因此，例如，短语“A、B、C和/或D”，单独地包括A、B、C和D，但还包括A、B、C和D的任何和全部组合和亚组合。
[0085]术语“包含(comprising)”,与“包括(including) ”、“含有(containing) ” 或“特征在于”是同义的，其为包含性或开放式的，并不排除另外的、未例举的元素和/或方法步骤。“包含(comprising)”为专用术语，意指存在所述的元素和/或步骤，但还可添加其它元素和/或步骤，并仍落入相关主题的范围中。
[0086]如本文中所用，短语“由……组成”排除了任何没有特别引用的元素、步骤或成分。应注意，当短语“由……组成”出现于权利要求的主体的从句而不是立即在前导语(preamble)之后时，它仅限制该从句中所列出的元素；其它元素不从所述权利要求整体中排除。
[0087]如本文中所用，短语“基本上由……组成”将相关公开或权利要求的范围限制为特定的物质和/或步骤，加上那些不对本公开和/或权利要求主题的基本的和新颖的特征构成实质影响的物质和/或步骤。例如，药物学组合物可“基本上由”药物学活性剂或多种药物学活性剂组成，其指所记载的药物学活性剂为存在于所述药物学组合物中仅有的药物学活性剂。然而，应注意载体、赋形剂和/或其他非活性试剂可能并很可能存在于这样的药物学组合物中。
[0088]考虑到术语“包括”、“由……组成”和“基本由……组成”，这3个术语中的一个在本文使用时，本文公开和所要求的主题可包括另外2个术语中任一的使用。例如，在一些实施方案中，本文公开的主题涉及包含抗体的组合物。本领域普通技术人员在浏览本公开后应理解，本文公开的主题因此涵盖基本由本文公开的主题的抗体组成的组合物，以及由本文公开的主题的抗体组成的组合物。
[0089]如本文中所用，术语“对象”指任何无脊椎动物或脊椎动物物种的成员。因此，在一些实施方案中，术语“对象”旨在涵盖动物界(Kingdom Animalia)的任何成员，包括但不限于，脊索动物门(例如，硬骨鱼纲(Osteichythyes)(硬骨鱼)、爬行纲(Reptilia)(爬行类)、鸟纲(Aves)(鸟)和哺乳纲(Mammalia)(哺乳动物)的成员)和其中涵盖的所有目和科。
[0090]本文公开的主题的组合物和方法对温血脊椎动物是特别有用的。因此，在一些实施方案中，本文公开的主题涉及哺乳动物和鸟类。更具体提供的是组合物和方法，其源自和/或用于哺乳动物例如人和其它灵长类，以及对人类是由于受到威胁而重要的(例如西伯利亚虎)、具有经济重要性的(农场饲养的用于人类消费的动物)和/或具有社会重要性的(作为宠物或在动物园中的动物)那些哺乳动物，例如人类之外的其它肉食动物(例如猫和狗)、猪(猪、家猪和野猪)、反会动物(例如牛、公牛、羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼)、啮齿动物(例如小鼠、大鼠和兔子)、有袋类动物和马。还提供的是所公开的方法和组合物用于鸟的用途，其包括那些危险的、存于动物园的鸟，以及飞禽，和更特别驯化的飞禽，例如，家禽，如火鸡，鸡，鸭，鹅，珍珠鸡等，因为它们是对人类也具有经济重要性。因此，还提供的是所公开的方法和组合物用于家畜的用途，其包括但不限于驯化的猪(猪和家猪)、反刍动物、马、家禽等等。
[0091]相似的，本文公开的所有基因、基因名称和基因产物旨在对应来自任何物种的同系物和/或同源物，对于所 述同系物和/或同源物本文公开的其它方法是可用的。因此，所述术语包括但不限于，来自人和小鼠的基因和基因产物。应理解，除非上下文清楚地表示，当来自特定物种的基因或基因产物被公开时，此公开仅是为了示例性的，并不被解释为限制。因此，例如对于GENBANK g'登录号:AAA60019和NP_004976代表的基因，公开的人
氨基酸序列旨在涵盖来自其他动物，包括但不限于其它哺乳动物、鱼、两栖动物、爬行动物和鸟的同源基因和基因产物。还涵盖的是任何和所有编码了所公开的氨基酸序列的核苷酸序列，包括但不限于那些公开于相应的GENBANK⑩条目的那些(即分别为J05582.1和NM_004985)。
[0092]术语“癌症”和“肿瘤”在本文中可互换地使用，并指对象中任何组织的原发和转移性实体肿瘤和癌，包括但不限于，乳腺、结肠、直肠、肺、口咽、下咽、食道、胃、胰腺、肝、胆囊、胆管、小肠；泌尿道包括肾脏、膀胱和尿道上皮；女性生殖道包括子宫颈、子宫、卵巢(例如，绒毛膜癌和妊娠滋养细胞疾病)；男性生殖道包括前列腺、储精囊、睾丸和精子细胞肿瘤；内分泌腺包括甲状腺、肾上腺和垂体；皮肤(例如，血管瘤和黑色素瘤)、骨或软组织；血管(例如，卡波济氏肉瘤)；大脑、神经、眼睛和脑膜(例如，星形细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、成视网膜细胞瘤、神经瘤、成神经细胞瘤、神经鞘瘤和脑膜瘤)。如本文中所用，术语“癌症”和“肿瘤”还指多细胞肿瘤以及单个新生物(neoplastic)细胞或前新生物(pre-neoplastic)细胞。在一些实施方案中，癌症或肿瘤包括上皮组织癌症或肿瘤例如但不限于癌。在一些实施方案中，肿瘤为腺癌，其在一些实施方案中为胰腺、乳腺、卵巢、直肠或结肠腺癌，和/或源自它们的转移性细胞。
[0093]如本文中在分子的上下文中所用，术语“效应子”指任何分子或分子的组合，期望其活性能输送进入和/或定位于细胞。效应子包括但不限于，标记、细胞毒素、酶、生长因子、转录因子、药物等。
[0094]如本文中在免疫系统的细胞上下文中所用，术语“效应子”指免疫系统细胞，其可被诱导以实现与对刺激的免疫应答相关的特定功能。示例性的效应子细胞包括但不限于，天然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T细胞(TC细胞)。
[0095]如本文中所用，术语“表达载体”指DNA序列，其能够在适当的宿主细胞中指导特定核苷酸序列的表达，其包括可操作地与感兴趣的核酸序列连接的启动子，所述序列可操作地连接于终止信号。通常它还包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。包括感兴趣的核苷酸序列的构建体可为嵌合体。构建体还可为天然存在的，但以可用于异源表达的重组形式获得。在一些实施方案中，表达载体包括本文公开的主题的分离的核酸分子，其在一些实施方案中包括SEQ ID N0:4和6的任何一个，或编码SEQ ID NO: 5和7_13的任何一个。在一些实施方案中，分离的核酸分子存在于可操作地连接于一或多种另外编码抗体分子子序列的核苷酸序列的表达载体中，从而在将表达载体引入适当的宿主内时,宿主细胞会表达完整的包含SEQ ID NO: 5和7-13的一或多个的重组抗体，或其片段或衍生物。
[0096]如本文中所用，术语“杂交瘤”指在实验室中由融合产抗体淋巴细胞和不产抗体癌细胞而产生的细胞或细胞系(通常为骨髓瘤或淋巴瘤细胞)。如本领域普通技术人员所知的，杂交瘤可增殖并持续供应产生特定单克隆抗体。用于产生杂交瘤的方法为本领域已知的(见例如，Harlow&Lane, 1988)。
[0097]如本文中所用，术语“可操作`地连接”和“可操作的连接”指转录调节元件(例如但不限于，启动子序列、转录终止序列等)以核苷酸序列的转录被所述转录调控元件控制和调节的方式与核酸序列(例如，编码序列或开放读码框)连接。相似地，将核苷酸序列称为在它所可操作地连接的启动子的“转录控制”下。用于将启动子区域可操作地连接于核酸分子的技术为本领域已知的。
[0098]如本文中所用，术语“前药”指药物(例如，细胞毒性剂)的类似物和/或前体，其基本上缺乏所述药物(例如，细胞毒活性)的生物学活性，直至经历活化步骤。活化步骤可包括酶切割、化学活化步骤例如暴露于还原剂，和/或物理活化步骤例如光解。在一些实施方案中，活化在对象身体中体内发生。
[0099]I1.抗体和其片段和衍生物，以及其产生方法
[0100]I1.A.概述
[0101]在一些实施方案中，本文公开的主题提供了分离的抗体，以及其片段和衍生物，其与存在于肿瘤中的抗原结合，例如但不限于存在于MUCl多肽中的抗原。
[0102]如本文中所用，术语“抗体(antibody) ”和“抗体(antibodies) ”指蛋白质,其包含基本由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段所编码的一或多种多肽。免疫球蛋白基因通常包括卡帕U)、兰不达(λ)、阿尔法(α)、伽马U)、德尔塔(δ)、宇普西隆(ε)和缪(U)恒定区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为K或X。在哺乳动物中，重链分类为Y、U、a、S或e ,其反过来定义了免疫球蛋白型别,分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。其它物种具有其它轻链和重链基因(例如，某些鸟类产生的称为IgY的，其为母鸡在它们的蛋的卵黄质中存储的免疫球蛋白类型)，其相似地由本文公开的主题所涵盖。在一些实施方案中，术语“抗体”指特异性结合表位的抗体，所述表位存在于肿瘤抗原上，所述肿瘤抗原包括但不限于MUCl多肽和/或突变体K-ras多肽。在一些实施方案中，术语“抗体”指特异性结合SEQ ID NO: 1-3任一中存在的表位的抗体。
[0103] 已知典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由2对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(平均分子质量约25千道尔顿(kDa))和一条“重”链(平均分子量约50-70kDa)。两对相同的多肽链以二聚体形式通过存在于重链区的二硫键保持在一起。每条链的N端定义了约100-110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别(有时称为“互补位”)。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻和重链。
[0104]抗体通常以完整的免疫球蛋白或可由不同的肽酶消化产生的大量良好表征的片段存在。例如，用木瓜蛋白酶消化抗体分子在二硫键的N端位置切割抗体。这产生了 3个片段:2个相同的“Fab”片段，其具有轻链和重链的N末端，和“Fe”片段，其包括由二硫键保持在一起的重链的C末端。另一方面，胃蛋白酶在铰链区二硫键的C末端消化抗体，产生称为“F(ab)’ 2”的片段，其为由二硫键连接的Fab片段的二聚体。可在温和的条件下还原F(ab) ’ 2片段以打破铰链区的二硫键，从而将F(ab) ’ 2 二聚体转变为2个“Fab’ ”单体。Fab’单体基本上为Fab片段，伴有部分铰链区(见例如，Paul, 1993中对其它抗体片段更详细的描述)。对于这些不同片段，Fab、F(ab’)2和Fab’片段包括至少一个完整的抗原结合结构域(互补位)，并因此能够结合抗原。
[0105]尽管根据完整抗体的消化定义出不同的抗体片段，技术人员将理解，可通过化学或利用重组DNA方法体外合成各种的这些片段(包括但不限于Fab’片段)。因此，如本文中所用，术语“抗体”还包括由修饰整个抗体和/或使用重组DNA方法体外合成而产生的抗体片段。在一些实施方案中，术语“抗体”包括具有至少一个抗原结合结构域(互补位)的片段。
[0106]抗体可为多克隆的和单克隆的。如本文中所用，术语“多克隆”指共同存在于给定的抗体集合中的抗体，并源自不同的产抗体细胞(例如B细胞)。示例性的多克隆抗体包括但不限于，结合特定抗原的抗体以及在动物对抗原产生免疫应答后发现于所述动物血液中的抗体。然而，应理解还可通过混合不相同的至少2种抗体人工制备多克隆抗体制备物。因此，多克隆抗体一般包括不同的抗体，其针对(即，结合)任何给定抗原的相同和/或不同表位(有时指“抗原决定簇”或仅“决定簇”)。
[0107]如本文中所用，术语“单克隆”指单个抗体种类和/或单个抗体种类的基本上均质的群体。换句话说，“单克隆”指单种抗体或单种抗体的群体，其中抗体在特异性和亲和性上是相同的，除了可能自然发生的可少量存在的突变。一般地，单克隆抗体OnAb或moAb)通过单个B细胞或其后代细胞产生(尽管本文公开的主题也涵盖如本文描述的通过分子生物学技术产生的“单克隆”抗体)。单克隆抗体OnAb或moAb)通常是高度特异地针对单个抗原性位点的。另外，与多克隆抗体制备物相反，给定的mAb通常是针对抗原上的单个表位。
[0108]除了它们的特异性，mAb还对一些目的是有利的，其中它们可合成而不被其它抗体污染。然而，修饰语“单克隆”不应被解释为要求抗体由任何特定的方法所产生。例如，在一些实施方案中，使用首次由Kohler等人，1975描述的杂交瘤方法制备本文公开的主题mAb,而在一些实施方案中，在原核或真核细胞中使用重组DNA方法制造(见例如，美国专利号4，816，567，其整体内容通过引用并入本文)。还可使用例如描述于Clackson等人，1991和Marks等人,1991的技术从曬菌体抗体库分离mAb。
[0109]本文公开的主题的抗体、片段和衍生物还可包括嵌合抗体。如本文中所用，在抗体的上下文中，术语“嵌合”和其语法变形指抗体衍生物，其具有基本上或完全来自一个物种恒定区的恒定区，和基本上或完全来自另一物种可变区序列的可变区。
[0110]可变区允许抗体选择性地识别和特异性地结合抗原上的表位。这就是说，抗体的VL结构域和VH结构域，或这些可变结构域中互补决定区(OTR)的子集相组合形成定义了三维抗原结合位点的可变区。此四元抗体结构形成了存在于抗体的每个臂末端的抗原结合位点。更具体的，抗原结合位点由在VH和VL链每个上面的3个CDR所定义。在一些例子中(例如，源自骆驼科物种或基于骆驼科免疫球蛋白工程改造的某些免疫球蛋白分子)，完整的免疫球蛋白分子可无轻链而仅由重链组成(见例如，Hamers-Casterman等人，1993)。
[0111]在天然存在的抗体中，在每个抗原结合结构域存在有6个CDR，其为短的、非连续的氨基酸序列，被特异地定位以在抗体采用其在水性环境中的三维构型时形成抗原结合结构域。在抗原结合结构域中剩下的氨基酸称为“框架”区，显示较少的分子间可变性。框架区多数采用β折叠构象，并且⑶R形成连接β折叠结构，并在一些情况下形成β折叠结构的部分的环。因此，框架区作用是形成脚手架，其通过链间非共价相互作用使得⑶R以正确方向定位。由定位的CDR形成的抗原结合结构域定义出与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这个互补表面促进了抗体与其同源表位的非共价结合。对任何给定的重链或轻链可变结构域，包含CDR和框架区的氨基酸分别可容易地由本领域普通技术人员鉴定，因为他们已被准确地定义(见例如，Chothia和Lesk, 1987;Kabat等人，1991 ；Martin, 1996 ；Johnson 和 Wu,2000)。
`[0112]特定种类的嵌合抗体为“人源化”抗体，其中抗体通过例如用鼠抗体的CDR取代人抗体的⑶R产生(见例如，PCT国际专利申请出版号W01992/22653)。因此，在一些实施方案中，人源化抗体具有除了基本或完全来自人抗体相应区域的CDR之外的恒定区和可变区，和基本或完全来自除了人之外的哺乳动物的CDR。
[0113]本文公开的主题抗体、片段和衍生物还可为单链抗体和单链抗体片段。单链抗体片段包含具有本文描述的完整抗体的至少一个可变区和/或CDR的氨基酸序列，但缺乏那些抗体的恒定结构域的一些或全部。这些恒定结构域对抗原结合是非必须的，但构成完整抗体结构的主要部分。
[0114]单链抗体片段可克服一些与使用包含部分或全部恒定结构域的抗体相关的问题。例如，单链抗体片段倾向于没有不想要的生物学分子和重链恒定区间的相互作用和其它不想要的生物学活性。另外，单链抗体片段远小于完整抗体并因此具有比整个抗体更高的毛细血管通透性的特征，其允许单链抗体片段更有效地定位和结合靶抗原结合位点。另外，抗体片段可在原核细胞中相对大规模地生产，从而便于它们的生产。另外，相对小的单链抗体片段使它们比完整抗体更不可能在受体中激起免疫应答。本文公开的主题的单链抗体片段包括但不限于，单链可变区(scFv)抗体和其衍生物，例如但不限于，串联二 scFv、串联三scFv、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体和微体。
[0115]Fv片段对应于免疫球蛋白重链和轻链的N端可变片段。Fv片段的两条链似乎比Fab片段具有更低的相互作用能能量。为了稳定VH和VL结构域的关联，可用肽(见例如，Bird 等人，1988 ；Huston 等人，1988)、二硫桥(见例如，Glockshuber 等人，1990)和 / 或“knob in hole”突变体(见例如,Zhu等人，1997)连接它们。可通过本领域技术人员公知的方法生产ScFv片段(见例如，Whitlow等人，1991 ；Huston等人，1993)。
[0116]可在细菌细胞如大肠杆菌或在真核细胞中生产scFv。scFv的一个潜在的不利是产物的单价性(其妨碍由于多价结合而提高亲和力)和它们的短半衰期。克服这些问题的尝试包括通过化学偶联从包含另外的C端半胱氨酸的scFv产生二价(scFv’)2(见例如，Adams等人，1993 ；McCartney等人，1995),或通过包含未配对的C端半胱氨酸残基的scFv自发的位点特异性二聚化产生二价(scFv’)2(见例如，Kipriyanov等人，1995)。
[0117]另外，可通过缩短肽接头至3-12残基强制scFv形成多聚体而形成“双抗体”(见例如，Holliger等人，1993)。缩减接头还另外可获得scFv三聚体(“三抗体”;见例如Kortt等人，1997)和四聚体(“四抗体”;见例如Le Gall等人，1999)。还可通过与蛋白质二聚化基序遗传融合形成“微抗体”(见例如，Pack等人，1992)和“微体”(见例如，Hu等人，1996)来实现二价scFv分子的构建。可通过第三肽接头连接两个scFv单元产生scFv-scFv串联((ScFv)2)(见例如，Kurucz 等人，1995)。
[0118]双特异性双抗体可以通过2个单链融合产物的非共价连接产生，所述单链融合产物由通过短接头与另一个抗体的VL结构域相连接的来自一个抗体的VH结构域组成(见例如，Kipriyanov等人，1998)。这样的双特异性双抗体的稳定性可通过如上文描述地引入二硫桥或“knob in hole”突变,或通过形成单链双抗体(scDb)(其中通过肽接头连接2个杂交scFv片段)来增强(见例如，Kontermann等人，1999)。
[0119]可产生四价双特异性分子，例如通过将scFv片段融合至IgG分子的CH3结构域或融合至通过铰链区Fab片段(见例如，Coloma等人，1997)。或者，通过融合双特异性单链双抗体创建四价双特异性分子(见例如，Alt等人，1999)。还可通过用包含螺旋-环-螺旋基序的接头二聚化scFv-scFv串联体(DiBi微抗体；见例如Muller等人，1998),或以阻止分子内配对的顺序包含四个抗体可变结构域(VH和VL)的单链分子(串联双抗体；见例如，Kipriyanov等人，1999)形成更小的四价双特异性分子。
[0120]可通过Fab’片段的化学偶联或通过亮氨酸拉链的异源二聚化创建双特异性F(ab’)2片段(见例如，Shalaby等人，1992 ;Kostelny等人，1992)。还可用的是分离的VH和VL结构域(见例如，美国专利号6，172，197,6, 248，516和6，291，158)。
[0121]本文公开的主题还包括本文公开的主题的抗体的功能性等效物。如本文中所用，短语“功能性等效物”指抗体，其指具有与给定抗体相当的结合特性的分子。在一些实施方案中，将嵌合抗体、人源化抗体和单链抗体，以及其片段认为是其所基于的对应抗体的功能性等效物。在一些实施方案中，本文公开的主题提供本文公开的TAB-004mAb的功能性等效物。
[0122]功能性等效物还包括具有与本文公开的主题的抗体的可变或超变区氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽。如本文中所用，对核酸和/或氨基酸序列，短语“基本上相同”指生物序列与另一个核酸和/或氨基酸序列具有在一些实施方案中至少80%，在一些实施方案中至少85%，在一些实施方案中至少90%，在一些实施方案中至少91%，在一些实施方案中至少92%，在一些实施方案中至少93%，在一些实施方案中至少94%，在一些实施方案中至少95%，在一些实施方案中至少96%，在一些实施方案中至少97%，在一些实施方案中至少98%,在一些实施方案中至少99%的序列相同性,如参考Pearson和Lipman, 1988,通过FASTA搜索方法所确定的。在一些实施方案中，对本文公开的主题抗体的核酸和/或氨基酸序列全长计算相同性百分比。
[0123]在一些实施方案中，核苷酸序列的功能性等效物为编码相同氨基酸序列的序列(即包括一或多个功能性等效密码子)。功能性等效密码子的列表示于表1。
[0124]表1
[0125]功能性等效密码子
【权利要求】
1.分离的抗体或其片段或衍生物，其包含单克隆抗体TAB-004的互补决定区(CDR)。
2.权利要求1的分离的抗体或其片段或衍生物，其中所述分离的抗体或其片段或衍生物为多克隆的。
3.权利要求1的分离的抗体或其片段或衍生物，其中所述分离的抗体或其片段或衍生物为单克隆的。
4.权利要求1的分离的抗体或其片段或衍生物，其中所述分离的抗体或其片段或衍生物为人的或人源化的。
5.权利要求1的分离的抗体或其片段或衍生物，其选自由杂交瘤细胞系TAB-004产生的单克隆抗体，所述细胞系在2010年12月16日以登录号PTA-11550保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC);嵌合抗体，或其片段或衍生物；人源化抗体，或其片段或衍生物；人抗体，或其片段或衍生物；单链抗体，或其片段或衍生物；和Fab片段，其中所述嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体或Fab片段包含单克隆抗体TAB-004的CDR。
6.权利要求1的分离的抗体或其片段或衍生物，其中所述单克隆抗体TAB-004的CDR包括包含SEQ ID NO:8的重链CDRl ;包含SEQ ID NO:9的重链CDR2 ;包含SEQ ID NO: 10的重链CDR3 ;包含SEQ ID NO: 11的轻链CDRl ;包含SEQ ID NO: 12的轻链CDR2 ;和包含SEQID NO: 13 的轻链 CDR3。
7.权利要求6的分离的抗体或其片段或衍生物，其中所述抗体或其片段或衍生物的重链包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:5或由包含SEQ IDNO:4的核酸分子编码；所述轻链可变区包含SEQ ID NO:7或由包含SEQ ID NO:6的核酸分子编码。
8.组合物，其包含权利要求1 的抗体或其片段或衍生物和药物学可接受的载体，任选地其中所述药物学可接受的载体对于在人中使用是可接受的。
9.组合物，其包含缀合于活性剂的权利要求1的抗体或其片段或衍生物。
10.权利要求9的组合物，其中所述活性剂选自放射性分子、放射性核素、敏化剂分子，成像剂、放射性同位素、毒素、细胞毒素、抗血管生成剂、抗肿瘤剂、化疗剂、免疫调节剂、细胞因子、报告基团、和它们的组合。
11.权利要求10的组合物，其中所述放射性同位素选自1QB、211At、212Pb、212B1、1251、m1、35S 和 3H。
12.权利要求10的组合物，其中所述免疫调节剂选自吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)抑制剂，任选地为1-甲基-DL-色氨酸(IMT)) ;EP2/EP4受体拮抗剂；环氧合酶抑制剂，任选地为吲哚美辛；和树突状细胞活化剂，任选地为CpG寡脱氧核苷酸(CpG 0ND)。
13.试剂盒，其包含权利要求1的抗体或其片段或衍生物，以及其使用说明书。
14.输送载体，其用于将活性剂靶向输送至肿瘤细胞，所述输送载体包含靶向剂，其包含权利要求1的分离的抗体或其片段或衍生物。
15.权利要求14的输送载体,其中所述活性剂选自放射性分子、放射性核素,敏化剂分子，成像剂、放射性同位素、毒素、细胞毒素、抗血管生成剂、抗肿瘤剂、化疗剂、免疫调节剂、细胞因子、报告基团、和它们的组合。
16.分离的细胞，其产生权利要求1的抗体或其片段或衍生物。
17.产生权利要求1的抗体的杂交瘤，任选地其中所述杂交瘤为在2010年12月16日在布达佩斯条约的条款下保藏于美国典型培养物保藏中心的杂交瘤细胞系ATCC登录号PTA-11550。
18.方法，其用于检测生物学样品中单克隆抗体TAB-004结合的表位的存在，所述方法包括: (a)使所述生物学样品与权利要求1的分离的抗体或其片段或衍生物相接触；和 (b)检测所述生物学样品中单克隆抗体TAB-004结合的表位的存在。
19.权利要求18的方法，其中权利要求1的分离的抗体或其片段或衍生物结合存在于粘蛋白(MUCl)多肽或K-ras多肽上的表位，任选地突变体K-ras多肽上的表位。
20.方法，其用于制备抗体或其片段或衍生物，所述方法包括: (a)在使得所述抗体或其片段或衍生物表达的条件下培养权利要求16的分离的细胞或权利要求17的杂交瘤；和 (b)从所述细胞或杂交瘤和/或从所述细胞或杂交瘤生长的环境中回收所述抗体或其片段或衍生物。
21.方法，其用于检测对象中的肿瘤和/或癌症细胞，所述方法包括: (a)在足以使权利要求1的抗体或其片段或衍生物与生物学样品中，如果存在，存在于肿瘤和/或癌症细胞上的表位结合的条件下，使对象中的或分离自对象的生物学样品与包含权利要求1的抗体或其片段或衍生物的组合物相接触；和 (b)检测权利要求1的抗体或其片 段或衍生物与所述表位的结合， 其中检出代表对象中存在肿瘤和/或癌症细胞。
22.权利要求21的方法，其中所述肿瘤和/或癌症细胞为胰腺肿瘤、乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、结肠肿瘤或直肠肿瘤，和/或源自其中的转移性细胞，其任选地表达MUCl、突变体K-ras或两者。
23.权利要求21的方法，其中所述抗体或其片段或衍生物与可检测的标记缀合，所述可检测的标记包含选自顺磁性、放射性和荧光离子的成像剂。
24.权利要求23的方法，其中所述放射性成像剂选自Y-发射体、正电子发射体和X射线发射体。
25.权利要求24的方法，其中放射性的成像剂选自43K、52Fe、57Co、67Cu、67Ga、68Ga、77Br81Rb/81MKr,87MSr,99mTc,111In,113In, 1231 , 1251 , 127Cs,129Cs, 1311 , 1321 , 197Hg^203Pb 和 206Bio
26.权利要求21的方法，其中所述生物学样品为血液样品或源自其中的级分。
27.方法，其用于治疗对象中的肿瘤，所述方法包括向所述对象施用包含与活性剂缀合的权利要求1的抗体或其片段或衍生物的组合物，由此所述活性剂与肿瘤接触从而治疗所述肿瘤。
28.权利要求27的方法，其中所述活性剂包含治疗剂，任选地为化疗剂、毒素、放疗剂、或它们的组合。
29.权利要求28的方法，其中化疗剂选自抗肿瘤药物、细胞因子、抗代谢物、烷化剂、激素、氨甲喋呤、多柔比星、柔红霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、5-氟尿嘧唳、美法仑、苯丁酸氮芥、氮芥、环磷酰胺、顺钼、长春地辛、长春花生物碱、丝裂霉素、博莱霉素、嘌呤硫素、巨毛霉素、1，4-苯醌衍生物、三亚胺醌、类固醇、氨基蝶呤、蒽环类抗生素、秋水仙胺、依托泊苷、光辉霉素、多柔比星、柔红霉素、长春新碱、新制癌菌素、巨毛霉素、a -鹅膏蕈碱、及它们的组合。
30.权利要求28的方法，其中所述毒素选自拉塞尔氏蝰蛇毒、活化的因子IX、活化的因子X、凝血酶、磷脂酶C、眼镜蛇毒因子、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、假单胞菌外毒素、白喉毒素、牛胰核糖核酸酶、美洲商陆抗病毒蛋白、相思子毒素、相思子毒素A链、白树毒素、皂草素、蒴莲根毒素、槲寄生凝集素、蒴莲素、和它们的组合。
31.权利要求28的方法，其中所述放疗剂选自41、6701、9°￥、，(1、1231、1251、1311、1861、188Re,199Au,211At,212Pb,212Bi,32P^33PJ1Ge,77As,103Pb,105Rh,111Ag^119Sb,121Sn^131Cs,143Pr,161Tb,177Liu 191Os、193MPt 和 197Hg。
32.方法，其用于在对象中抑制肿瘤生长，所述方法包括向携带肿瘤的对象施用有效量的包含单克隆抗体TAB-004的互补决定区(CDR)的分离的抗体或其片段或衍生物。
33.权利要求32的方法，其中所述肿瘤为胰腺肿瘤、乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、结肠肿瘤或直肠肿瘤，和/或源自其中的转移性细胞，其任选地表达MUC1、突变体K-ras或两者。
34.权利要求27-33任一项的方法，其还包括向所述对象施用一或多种另外的抗肿瘤治疗。
35.权利要求34的方法，其中一或多种另外的抗肿瘤治疗选自放疗、化疗、另外的免疫疗法、抗炎症治疗、和它们的组合。
36.权利要求35的方法，其中所述抗炎症治疗包括向所述对象施用环加氧酶抑制剂，任选地为环加氧酶-2特异的抑制剂。
37.权利要求35的方法，其中所述一或多种另外的抗肿瘤疗法包括向对象施用吉西他滨(4-氨基-1- (2-脱氧-2，2- 二氟-P -D-赤式-戊呋喃糖基)嘧啶-2 (IH)-酮-2’，2’ - 二氟-2’-去氧胞苷)和塞来昔布(4-[5-(4_甲基苯基)-3-(三氟甲基)吡唑-1-基]苯磺酰胺)，或其任一或两者的药物学可接受的盐。
38.权利要求32的方法，其中所述单克隆抗体TAB-004的⑶R包括:包含SEQID NO: 8的重链CDRl ;包含SEQ ID N0:9的重链CDR2 ;包含SEQ ID NO: 10的重链CDR3 ;包含SEQ IDNO: 11的轻链CDRl ;包含SEQ ID NO: 12的轻链CDR2 ;和包含SEQ ID NO: 13的轻链CDR3。
39.权利要求38的方法，其中所述抗体或其片段或衍生物包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID N0:5或由包含SEQ ID NO:4的核酸分子编码；所述轻链可变区包含SEQ ID N0:7或由包含SEQ ID N0:6的核酸分子编码。
40.方法，其用于纯化癌症干细胞，所述方法包括: (a)提供疑似包含癌症干细胞的细胞群； (b)鉴定所述细胞的亚群，其结合包含单克隆抗体TAB-004的CDR的抗体或其片段或衍生物；和 (c)纯化所述亚群。
41.权利要求40的方法，其中所述细胞群包含分离自患有肿瘤和/或癌症的对象的循环细胞。
42.权利要求40的方法，其另外包括在鉴定步骤之前和/或在纯化步骤之后从所述细胞群中移除谱系阳性(Iin+)细胞。
43.方法，其用于将活性剂靶向至对象中的循环癌症干细胞，所述方法包括使所述循环癌症干细胞与包含抗体或其片段或衍生物和活性剂的组合物相接触，所述抗体或其片段或衍生物包含单克隆抗体TAB-004的⑶R，任选地其中所述活性剂包含治疗剂，任选地为化疗剂、毒素、放疗剂、或它们的组合。
44.权利要求43的方法，其中所述治疗剂包含免疫调节剂，任选地其中所述免疫调节剂选自吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)抑制剂，任选地为1-甲基-DL-色氨酸(IMT)) ；EP2/EP4受体拮抗剂；树突状细胞活化剂，任选地为CpG寡脱氧核苷酸(CpG 0ND)。
45.方法，其用于预后之前治疗过癌症的对象中的癌症复发，所述方法包括: (a)从患有癌症的对象中分离包含循环细胞的生物学样品； (b)在足以使权利要求1的抗体或其片段或衍生物与生物学样品中，如果存在，存在于肿瘤和/或癌症细胞上的表位结合的条件下，使所述生物学样品与权利要求1的抗体或其片段或衍生物相接触；和 (c)在生物学样品中鉴定一或多种结合权利要求1的抗体或其片段或衍生物的循环细胞， 从而预后所述对象中癌症的复发。
46.权利要求45的方法,其中生物学样品包括血液样品、淋巴样品，或其级分。
47.权利要求45的方法，其中所述癌症为胰腺癌或乳腺癌。
48.权利要求45的方法，其中所述抗体或其片段或衍生物选自由杂交瘤细胞系TAB-004产生的单克隆抗体，所述细胞系在2010年12月16日以登录号PTA-11550保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC);嵌合抗体，或其片段或衍生物；人源化抗体，或其片段或衍生物；人抗体，或其片段或衍生物；单链抗体，或其片段或衍生物；和Fab片段，其中所述嵌合抗体、人源化抗体、人`抗体、单链抗体或Fab片段包含单克隆抗体TAB-004的CDR,并进一步其中所述嵌合抗体、人源化的抗体、人抗体、单链抗体或Fab片段包含单克隆抗体TAB-004的互补决定区(OTR)。
49.权利要求48的方法，其中所述单克隆抗体TAB-004的⑶R包括:包含SEQID NO: 8的重链CDRl ;包含SEQ ID N0:9的重链CDR2 ;包含SEQ ID NO: 10的重链CDR3 ;包含SEQ IDNO: 11的轻链CDRl ;包含SEQ ID NO: 12的轻链CDR2 ;和包含SEQ ID NO: 13的轻链CDR3。
50.权利要求49的方法，其中所述抗体或其片段或衍生物包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID N0:5或由包含SEQ ID NO:4的核酸分子编码；所述轻链可变区包含SEQ ID N0:7或由包含SEQ ID N0:6的核酸分子编码。
51.方法，其用于预后对象中的癌症进展，其包括: (a)从患有癌症的对象中分离包含循环细胞的生物学样品； (b)在足以使权利要求1的抗体或其片段或衍生物与生物学样品中，如果存在，存在于肿瘤和/或癌症细胞上的表位结合的条件下，使所述生物学样品与权利要求1的抗体或其片段或衍生物相接触；和 (C)在生物学样品中鉴定一或多种结合权利要求1的抗体或其片段或衍生物的循环细胞， 从而预后对象中的癌症进展。
52.权利要求51的方法,其中生物学样品包括血液样品、淋巴样品,或其级分。
53.权利要求51的方法，其中所述癌症为胰腺癌或乳腺癌。
54.权利要求51的方法，其中所述抗体或其片段或衍生物选自由杂交瘤细胞系TAB-004产生的单克隆抗体，所述细胞系在2010年12月16日以登录号PTA-11550保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC);嵌合抗体，或其片段或衍生物；人源化抗体，或其片段或衍生物；人抗体，或其片段或衍生物；单链抗体，或其片段或衍生物；和Fab片段，其中所述嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体或Fab片段包含单克隆抗体TAB-004的CDR,并进一步其中所述嵌合抗体、人源化的抗体、人抗体、单链抗体或Fab片段包含单克隆抗体TAB-004的互补决定区(OTR)。
55.权利要求54的方法，其中单克隆抗体TAB-004的⑶R包括:包含SEQID NO: 8的重链CDRl ;包含SEQ ID NO:9的重链CDR2 ;包含SEQ ID NO: 10的重链CDR3 ;包含SEQ IDNO: 11的轻链CDRl ;包含SEQ ID NO: 12的轻链CDR2 ;和包含SEQ ID NO: 13的轻链CDR3。
56.权利要求55的方法，其中所述抗体或其片段或衍生物包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:5或由包含SEQ ID NO:4的核酸分子编码；所述轻链可变区包含SEQ ID NO:7或由包含SEQ ID NO:6的核酸分子编码。
57.权利要求51的方法，其中所述癌症的进展包含所述癌症在对象中的转移。
58.分离的核酸分子，其包含SEQID N0:4和6中的任何一个，或编码SEQ ID NO:5和7-13中的任一个。
59.权利要求58的分尚的核酸分子,其中分尚的核酸分子存在于载体中，任选地存在于表达载体中。
60.权利要求59的分尚的核酸分子,其中所述分尚的核酸分子存在于表达载体中，其可操作地连接于一或多个另外的编码抗体分子子序列的核苷酸序列，从而在将所述表达载体引入适当的宿主内时，宿主细胞表达包含SEQ ID NO:5和7-13中的一或多个的完整重组抗体或其片段或衍生物。
【文档编号】C12P21/08GK103492417SQ201180059040
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2011年5月25日 优先权日:2010年10月8日
【发明者】P·慕克吉 申请人:北卡罗来纳大学夏洛特分校