一种用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的新型核酸染料的制备
【专利摘要】本发明用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的新型核酸染料制备，依次反应为：其中：为4-甲基喹啉，为6-溴己酸；其中为2-(甲硫基)苯并噻唑，为对甲苯磺酸甲酯，DMF为N,N-二甲基甲酰胺，Et3N为三乙胺，HCl(conc.)为浓盐酸，其中：为2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TSTU)，DIPEA为N,N-二异丙基乙胺，为牛磺酸，为产品。从分子结构上做改进，容易渗透到高密集程度的高聚物中，保持核酸染料的高敏感性和高稳定性，解决了作为核酸凝胶染料的荧光染料很难渗透进去的技术难题和通常核酸染料所具有的高毒性难题。
【专利说明】
一种用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的新型核酸染料的制备
技术领域
[0001] 本发明涉及荧光染料领域，具体涉及一种用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的新型核酸染 料的制备。
【背景技术】
[0002] 现有的用在琼脂糖凝胶中的安全无毒的染料，如美国b i〇 t ium公司生产的 gelgreen染料由于分子量过大，不能应用在聚丙烯酰胺凝胶电泳。导致的原因是:聚丙烯酰 胺凝胶密是密集程度更高的三维空间的高聚物。这种高密集聚合物结构，使得在分离不同 大小范围、不同浓度范围的的核酸分子时，作为核酸凝胶染料的荧光染料特别是大分子很 难渗透进去以致核酸染色效果不佳。
[0003] 用于核酸电泳常见的凝胶成像仪，一般分为两种波段，即紫外和488nm左右的凝胶 激光扫描仪。凝胶电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质。后者聚丙烯酰胺 凝胶密是密集程度非常高的高聚物。这种高密集结构，作为核酸凝胶染料的荧光染料在染 色分离的核酸分子时很难渗透进去以致核酸染色效果不佳。
[0004] 聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应、浓缩效应、电荷效应，对于小 片段DNA(5bp-500bp)的分离效果最好。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨 率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，而且进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。本
【申请人】在 2014年4月份（申请号为201410149438.6,发明创造名称为一种新型核酸染料的制备及其应 用）的一份专利申请中，提及一种新型的核酸染料，这种染料在保持了作为优良核酸染料的 高敏感性、高稳定性、同现有检测仪器兼容的情况下，从分子结构上做了改进，从而可以很 容易的渗透到聚丙烯酰胺凝胶这种高密集程度的高聚物中。但是这种染料仅能用在以 254nm为基础的紫外凝胶扫描仪上，不能兼容以488nm为基础的紫外凝胶扫描仪。
【发明内容】
[0005] 为解决上述技术问题，我们提出了一种用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的新型核酸染料 的制备，本发明从分子结构上做了改进，从而可以很容易的渗透到这种高密集程度的高聚 物中。
[0006] 为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
[0007] -种用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的新型核酸染料的制备，共分为下列四步反应获 得：
[0008] 一、第一步反应
[0009] 1.1反应方程式
[0010]
[0011]其中：
[0012]
[0013]
[0014]
[0015] 二、第二步反应
[0016] 2.1反应方程式
[0017]
[0018] 其中：
[0019]
(甲硫基)苯并噻唑
[0020]'对甲苯磺酸甲酯 〇
---------
[0021]为中间体II
I TsO
[0022] 三、第三步反应
[0023] 3.1反应方程式 I'sQ
[0027] DMF为N，N-二甲基甲酰胺
[0028] Et3N为三乙胺
[0029] Nal为碘化钠 [0030] HCl(conc.)为浓盐酸
[0031]
:为中间体III
[0032]四、第四步反应 [0033] 4.1反应方程式
[0037]
-为2-琥珀酰亚胺基-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TSTU)
[0034]
[0035]
[0036]
[0038] DMF 为N，N-二甲基甲
[0039] 酰胺
[0040] DIPEA为N，N-二异丙基乙胺
[0041 ]
为牛磺酸
[0042] Et3N为三乙胺
[0043] H9〇^7k
[0044]
?为产品化合物。
[0045] 优选的，所述1.1步骤的反应操作如下：在100mL双颈瓶中加入4-甲基喹啉和6-溴 己酸，用橡胶塞封口后加热130 °C反应3h，随后升温至150 °C反应12h; TLC跟踪反应，展开剂： 15 %MeOH/CH2Cl2;热的反应液倒入150mL乙腈中，搅拌，加入1 OOmL乙酸乙酯，有固体析出，过 滤;所得固体中加入150mL乙酸乙酯，搅拌2h;过滤，固体干燥得中间体I。
[0046] 优选的，所述2.1步骤的反应操作如下：在装有机械搅拌的250mL反应瓶中加入2-(甲硫基)苯并噻唑和对甲苯磺酸甲酯，加热60°C反应过夜，随后升温至120°C反应2h;TLC跟 踪反应完成，展开剂:异丙醇：丙酮:水：乙酸:氨水=35: 25: 25:14:8;加入乙酸乙酯100mL， 回流反应1 h，冷却后过滤，固体干燥得中间体II。
[0047]优选的，所述3.1步骤的反应操作如下:在100mL圆底烧瓶中加入中间体I和DMF，滴 加入Et3N，常温搅拌15min;在20min内逐份加入中间体II，完毕后常温搅拌过夜反应;TLC跟 踪反应完成，展开剂:20 %MeOH/CH2Cl2;反应液倒入150mL水中，搅拌，加入Nal，随后加入浓 盐酸，搅拌2h;过滤，固体干燥得中间体III。
[0048]优选的，所述4.1步骤的反应操作如下：在50mL茄形瓶中，加入中间体III、DMF和 DIPEA，在冰浴下搅拌0.5h，分批加入TSTU，继续冰浴条件下反应lh; TLC跟踪反应完成，展开 剂:MeOH: DCM= 1:5;配制0.6g牛磺酸/20mL H2〇的溶液，并将其放置于冰浴中冷却0.5h，随 后向牛磺酸溶液中加入三乙胺并缓慢滴加入以上的反应液，搅拌过夜反应。TLC跟踪反应完 成，展开剂:MeOH: DCM = 1:10;过滤，水洗(20mL X 3)，冻干得产品化合物。
[0049] 通过上述技术方案，本发明不仅保持了作为优良核酸染料的高敏感性、高稳定性、 而且解决了作为核酸凝胶染料的荧光染料很难渗透进去以致核酸染色效果不佳的技术难 题。产品可以用在带有SYBR Green滤光片的紫外凝胶成像仪或者具有可见光激发器的凝胶 成像仪，如Dark Re ad er拍照系统或48 8nm激光器为基础的凝胶扫描仪。另外本产品亦解决 了通常核酸染料所具有的高毒性问题。从而达到了设计新颖、反应操作合理、且应用效果好 的目的。
【附图说明】
[0050] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以 根据这些附图获得其他的附图。
[0051] 图1为本发明实施例所公开的一种用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的新型核酸染料的制 备时的质谱图。
【具体实施方式】
[0052] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0053] 下面结合实施例和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0054] 实施例.
[0055]如图1所示，一种用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的新型核酸染料，其特征在于，共分为 下列四步反应获得：
[0056] 一、第一步反应 [0057] 1.1反应方程式
[0063] 1.2反应操作[0064] 在100mL双颈瓶中加入4-甲基喹啉和6-溴己酸，用橡胶塞封口后加热130°C反应
[0058]
[0059]
[0060]
[0061]
[0062] 3h，随后升温至150°C反应121UTLC跟踪反应，展开剂：15%MeOH/CH2Cl2。热的反应液倒入 150mL乙腈中，搅拌，加入lOOmL乙酸乙酯，有固体析出，过滤。所得固体中加入150mL乙酸乙 酯，搅拌2h。过滤，固体干燥得中间体I。
[0065]第一步反应得到的实验数据为：
[0066] 4-甲基喹啉投料量:6.8mL
[0067] 6-溴己酸投料量：10g
[0068] 中间体I的产量为：12.4g理论值为：13.24g
[0069] 二、第二步反应 [0070] 2.1反应方程式
[0071]
[0072]
[0073]
[0074]
[0075] ! TsC)
[0076] 2.2反应操作
[0077]在装有机械搅拌的250mL反应瓶中加入2_(甲硫基）苯并噻唑和对甲苯磺酸甲酯， 加热60 °C反应过夜，随后升温至120 °C反应21UTLC跟踪反应完成，展开剂:异丙醇:丙酮:水： 乙酸:氨水=35:25:25:14:8。加入乙酸乙酯lOOmL，回流反应lh，冷却后过滤，固体干燥得中 间体Π 。
[0078]第二步反应得到的实验数据为：
[0079] 2_(甲硫基)苯并噻唑投料量:19.8g
[0080] 对甲基苯磺酸甲酯投料量:24.4g
[0081 ]中间体II的产量为:38 · 54g理论值为:40 · 43g
[0082] 三、第三步反应
[0083] 3.1反应方程式
[0084] 其中：
[0085]
[0086]
为中间体Π
[0087] DMF为Ν，Ν-二甲基甲酰胺
[0088] Et3N为三乙胺
[0089] Nal为碘化钠
[0090] HCl(conc.)为浓盐酸
[0091]
为中间体III
[0092] 3.2反应操作
[0093] 在100mL圆底烧瓶中加入中间体I和DMF，滴加入Et3N，常温搅拌15min。在20min内 逐份加入中间体Π ，完毕后常温搅拌过夜反应。TLC跟踪反应完成，展开剂：20 %MeOH/ CH2C12。反应液倒入150mL水中，搅拌，加入Nal，随后加入浓盐酸，搅拌2h。过滤，固体干燥得 中间体III。
[0094]第三步反应得到的实验数据为：
[0095]中间体I投料量:7.13g
[0096] 中间体II投料量:7.72g
[0097] DMF 投料量：50mL
[0098] 三乙胺投料量：5.85mL
[0099] 碘化钠投料量:3.15g
[0100] 浓盐酸投料量:3.5mL
[0101] 中间体III产量:9.28g理论值为：11.19g
[0102] 四、第四步反应
[0103] 4.1反应方程式
[0104]
[0105]
[0106]
[0107]
32-琥珀酰亚胺基-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TSTU)
[0108] DMF为N，N-二甲基甲酰胺
[0109] DIPEA为N，N-二异丙基乙胺
[0110]
[为牛磺酸
[0111] Et3N为三乙胺
[0112] H20 为水
[0113]
〖产品化合物
[0114] 4.2反应操作
[0115] 在5OmL茄形瓶中，加入中间体III、DMF和DITOA，在冰浴下搅拌0.5h，分批加入 TSTU，继续冰浴条件下反应lhJLC跟踪反应完成，展开剂:MeOH:DCM=l:5。配制0.6g牛磺 酸/20mL H20的溶液，并将其放置于冰浴中冷却0.5h，随后向牛磺酸溶液中加入三乙胺并缓 慢滴加入以上的反应液，搅拌过夜反应。TLC跟踪反应完成，展开剂:MeOH: DCM= 1:10。过滤， 水洗(20mL X 3)，冻干得产品化合物。
[0116] 第四步反应得到的实验数据为：
[0117] 中间体III投料量：1.6g
[0118] TSTU 投料量：lg
[0119] DIPEA 投料量：lmL
[0120] DMF 投料量:20mL
[0121] 牛磺酸投料量:0.6g
[0122] 水投料量:20mL
[0123] 三乙胺投料量：lmL
[0124] 产品化合物产量:1.5g，理论值为：1.92g
[0125] 通过上述反应操作过程，本发明得到的产品，不仅保持了作为优良核酸染料的高 敏感性、高稳定性，而且解决了作为核酸凝胶染料的荧光染料很难渗透进去以致核酸染色 效果不佳的技术难题。同时，产品可以用在带有SYBR Green滤光片的紫外凝胶成像仪或者 具有可见光激发器的凝胶成像仪，如Dark Reader拍照系统或488nm激光器为基础的凝胶扫 描仪。另外本产品亦解决了通常核酸染料所具有的高毒性问题。从而达到了设计新颖、反应 操作合理、且应用效果好的目的。
[0126] 以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明 的保护范围。
【主权项】
1. 一种用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的新型核酸染料的制备，其特征在于，共分为下列四 步反应获得： 一、第一步反应 1.1反应方稈式DMF为N，N-二甲基甲酰胺 Et3N为三乙胺 NaI为碘化钠 HCl(cone.)为浓盐酸111 (TSTU) 3-四甲基脲四氟硼酸酯DMF为N，N-二甲基甲酰胺DIPEA为N，N-二异丙基乙I 3牛磺酸 Et3N为三乙胺 H2O为水2. 根据权利要求1所述的一种用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的新型核酸染料的制备，其特 征在于，所述1.1步骤的反应操作如下： 在IOOmL双颈瓶中加入4-甲基喹啉和6-溴己酸，用橡胶塞封口后加热130°C反应3h，随 后升温至150°C反应12h;TLC跟踪反应，展开剂：15%Me0H/CH2Cl2;热的反应液倒入150mL乙 腈中，搅拌，加入IOOmL乙酸乙酯，有固体析出，过滤;所得固体中加入150mL乙酸乙酯，搅拌 2h;过滤，固体干燥得中间体I。3. 根据权利要求，1所述的一种用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的新型核酸染料的制备，其特 征在于，所述2.1步骤的反应操作如下： 在装有机械搅拌的250mL反应瓶中加入2-(甲硫基）苯并噻唑和对甲苯磺酸甲酯，加热 60°C反应过夜，随后升温至120°C反应2h; TLC跟踪反应完成，展开剂：异丙醇：丙酮：水：乙 酸:氨水=35:25: 25:14:8;加入乙酸乙酯IOOmL，回流反应Ih，冷却后过滤，固体干燥得中间 体II 〇4. 根据权利要求1所述的一种用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的新型核酸染料的制备，其特 征在于，所述3.1步骤的反应操作如下： 在IOOmL圆底烧瓶中加入中间体I和DMF，滴加入Et3N,常温搅拌15min;在20min内逐份加 入中间体II，完毕后常温搅拌过夜反应;TLC跟踪反应完成，展开剂:20%MeOH/CH2Cl2;反应 液倒入150mL水中，搅拌，加入NaI，随后加入浓盐酸，搅拌2h;过滤，固体干燥得中间体III。5. 根据权利要求1所述的一种用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的新型核酸染料的制备，其特 征在于，所述4.1步骤的反应操作如下： 在50mL茄形瓶中，加入中间体III、DMF和DIPEA，在冰浴下搅拌0.5h，分批加入TSTU，继 续冰浴条件下反应Ih; TLC跟踪反应完成，展开剂:MeOH: DCM= 1: 5;配制0.6g牛磺酸/20mL H2O的溶液，并将其放置于冰浴中冷却0.5h，随后向牛磺酸溶液中加入三乙胺并缓慢滴加入 以上的反应液，搅拌过夜反应。TLC跟踪反应完成，展开剂：MeOH: DCM= 1:10 ;过滤，水洗 (20mL X 3)，冻干得产品化合物。
【文档编号】C07D417/06GK106008495SQ201610412156
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月13日
【发明人】夏继波, 聂承斌, 钱近春, 赵育明, 赵文俊
【申请人】苏州宇恒生物科技有限公司