专利名称：：一种电泳用聚丙烯酰胺预制凝胶的缓冲系统的制作方法
技术领域：
：本发明属于凝胶电泳
技术领域：
，具体涉及用于预制胶电泳的聚丙烯酰胺凝胶的缓冲系统。
背景技术：
：聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成分及浓度，使之具有比较好的分辨率。聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种最常用的蛋白质分离和鉴定的电泳方法，被广泛应用于生物化学、分子生物学、免疫学、临床化学、药学等学科的研究。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶具有由酰胺侧链的碳-碳聚合物形成的网状格子，没有或很少带有侧基离子，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。由于这种分子筛作用，在电泳过程中凝胶并不仅是单纯的支持物。丙烯酰胺称单体，甲撑双丙烯酰胺称交联剂，在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝胶。在聚丙烯酰胺凝胶形成的反应过程中，需要有催化剂参加，催化剂包括引发剂和加速剂两部分。引发剂在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应，加速剂则可加快引发剂释放自由基的速度。凝胶形成的孔径与总浓度有关，总浓度愈大，孔径相应变小，机械强度增强，当总浓度不变时，甲叉双丙烯酰胺(Bis)的浓度在5%(w/v)时孔径最小，高于或低于此值时，聚合体孔径都相对变大，凝胶孔径在凝胶电泳中是一个重要的参数，它往往决定了电泳的分离效果。常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳为不连续的电泳系统，采用了两种或两种以上的缓冲液，PH值和凝胶网孔，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。例如Laemmli缓冲系统((1970)Nature227，680-686)，在分离凝胶中含有0.375mol/L三羟基甲基氨基甲烷(Tris)，用HCl滴定pH至8.8。浓缩凝胶含有0.125mol/L三羟基甲基氨基甲烷，用HCl滴定pH至6.8。阳极和阴极电泳缓冲液中含有0.024mol/L三羟基甲基氨基甲烷和0.192mol/L甘氨酸。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH。HCl在一定PH条件下易解离出Cl-，它在电场中迁移率大，走在最前面，故称为快离子或前导离子。电极缓冲液中的甘氨酸在PH8.3的缓冲液中解离度很小，仅为0.1-1%，因而在电场中迁移率很小，称为慢离子或尾随离子。大多数蛋白质Pl在5.0左右，在pH8.8或6.8时均带负电荷，在电场中均移向正极，其有效迁移率介于快慢离子之间，于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面处，被浓缩成极窄的区带。当进入PH8.8的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此氯离子和甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，由于其分子的大小不同而被分离成多个区带。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于三个主要因素凝胶孔隙度的大小、它所带净电荷以及分子的大小和形状。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那么电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。目前常用的阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原。十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，由于它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质-SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都不一样，这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可以用于测定蛋白质的分子量。为蛋白质分离和鉴定最常用的的电泳方法。虽然聚丙烯酰胺凝胶电泳已经成为实验室的最常规实验方法，但其制备过程复杂而且耗时。需要准备的试剂多，工序繁琐，准备时间也长，而且每一次跑出来结果可能都不一样，造成实验效率低。因为丙烯酰胺具有神经毒性，且易造成环境污染及危害实验人员的健康。目前一些国外公司推出了多种电泳预制胶，预制胶因为是大规模生产的，所以胶与胶之间重复性好，不像手工灌胶那样结果差异大。且即开即用，不用再配制多种溶液、灌胶、等胶凝固，节省了宝贵的时间。预制电泳凝胶都是由供应商制成成品，然后运输到实验室进行电泳。因此预制胶必须具有较长时间的保质期，能够在整个运输和储存过程中保持其性能。由高PH凝胶缓冲液系统制备的凝胶，由于丙烯酰胺水解，胶易降解，所以只能保存12周。另外，未聚合的丙烯酰胺在电泳过程中可能与蛋白质发生反应，进而可能干扰随后的蛋白质分析，如多肽测序等。
发明内容本发明目的是为了克服上述现有技术十实验室配制时工序繁琐，耗时长，易造成污染，实验效率低，以及现有预制电泳凝胶保质期不能满足长时间运输的缺陷，提供一种制造成本低廉、凝胶统一、快捷、储存12各月以上蛋白质分离能力和凝胶形状保持稳定的预制凝胶的缓冲系统统。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种电泳用聚丙烯酰胺预制凝胶的缓冲系统，包括阳极电泳槽缓冲液、阴极电泳槽缓冲液、分离凝胶和浓缩凝胶，其特征在于所述浓缩凝胶和分离凝胶含有100300mmol/L三羟基甲基氨基甲烷和0.10.4%(w/v)十二烷基硫酸钠，并以柠檬酸滴定pH至6.56.9；所述阳极电泳槽缓冲液和阴极电泳槽缓冲液中含有80120mmol/L三羟基甲基氨基甲烷-N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸和0.10.4%(w/v)十二烷基硫酸钠，pH值调至7.58。进一步一，所述浓缩凝胶和分离凝胶含有200mmol/L三羟基甲基氨基甲烷及0.2%(w/v)十二烷基硫酸钠，以柠檬酸(Citrate)滴定pH至6.8；所述阳极电泳槽缓冲液和阴极电泳槽缓冲液中含有lOOmmol/L三羟基甲基氨基甲烷-N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸和0.2%(w/v)十二烷基硫酸钠，pH值调至7.8。本发明另一目的是提供一种制备电泳用聚丙烯酰胺预制凝胶的缓冲系统的方法，其特征在于(1)、将30%ACr-O.8%Bis凝胶贮液与三羟基甲基氨基甲烷-柠檬酸缓冲液，pH6.8，10%(w/v)十二烷基硫酸钠及10%过硫酸铵混勻，将N，N，N’，N’-四甲基乙二胺入混合液，混勻；分离胶含有8%(ν/ν)凝胶贮液、200mmol/L三羟基甲基氨基甲烷、0.2%(w/v)十二烷基硫酸钠，0.05%(w/v)过硫酸铵及0.01%(v/v)TEMED；浓缩胶分别4%(ν/ν)凝胶贮液、200mmol/L三羟基甲基氨基甲烷、0.2%(w/v)十二烷基硫酸钠，0.05%(w/v)过硫酸铵及0.01%(v/v)TEMED；(2)、将配置好的分离胶溶液缓慢加入制胶板之间，其上覆盖厚度为0.4-0.8cm的正丁醇层至凝胶完全聚合。(3)、分离胶聚合后，倒除正丁醇，用蒸馏水冲洗分离胶胶面两次，用滤纸吸去残液，用滴管将浓缩胶溶液加在分离胶面上，充满制胶板，插入样品梳；(4)、配阳极电泳槽缓冲液和阴极电泳槽缓冲液，向槽中加注电极缓冲液，阳极和阴极电泳槽缓冲液中含有lOOmmol/L三羟基甲基氨基甲烷-HEPES和0.2%(w/v)十二烷基硫酸钠，PH7.8。本发明相比现有技术，本发明凝胶分离缓冲系统在中性pH值条件下，蛋白质保持完整。蛋白质中的氨基酸不太容易与未聚合的丙烯酰胺或其他相关的阻断剂发生反应。此夕卜，相对于较高PH值环境，巯基基团不易被氧化，聚丙烯酰胺本身也不易被水解。该凝胶体系增加了凝胶基质和缓冲液的稳定。由于丙烯酰胺水解比较缓慢，根据这一系统制备的凝胶可以在冰箱中储存一年多而不降低其性能。此外，减少了蛋白的修饰，改善了Westernblot的分析结果。本发明配置方法采用相同的缓冲系统配制的分离凝胶和浓缩凝胶，分辨率更高，且电泳速度更快。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述。实施例1一种电泳用聚丙烯酰胺预制凝胶的缓冲系统，包括阳极电泳槽缓冲液、阴极电泳槽缓冲液、分离凝胶和浓缩凝胶。浓缩凝胶和分离凝胶含有200mmol/L三羟基甲基氨基甲烷及0.2%(w/v)十二烷基硫酸钠，以柠檬酸(Citrate)滴定pH至6.8；阳极电泳槽缓冲液和阴极电泳槽缓冲液中含有lOOmmol/L三羟基甲基氨基甲烷-N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸和0.2%(w/v)十二烷基硫酸钠，pH值调至7.8。实施例2电泳用聚丙烯酰胺预制凝胶的缓冲系统的组成凝胶贮液丙烯酰胺(Acr)28.38g，双丙烯酰胺(Bir)1.62g.ddH20,定容至100ml过滤后于4°C避光保存。缩凝胶，8%的凝胶贮液，lOOmmol/L三羟基甲基氨基甲烷、0.1%(w/v)十二烷基硫酸钠，并以柠檬酸滴定PH至6.5；分离胶，4%的凝胶贮液，lOOmmol/L三羟基甲基氨基甲烷、0.1%(w/v)十二烷基硫酸钠，并以柠檬酸滴定PH至6.5；阳极电泳槽缓冲液lmol/LH3P04，67mlH3PO4用ddH20，定容至1L，加80mmol/LTris-HEPES和0.1%(w/v)十二烷基硫酸钠；阴极电泳槽缓冲液lmol/LNaOH,40gNaOH用ddH20,定容至1L，加80mmol/LTris-HEPES和0.1%(w/v)十二烷基硫酸钠；PH值调至7.5。实施例3浓缩凝胶和分离凝胶含有300mmol/L三羟基甲基氨基甲烷和0.4%(w/v)十二烷基硫酸钠，并以柠檬酸滴定PH至6.9；阳极电泳槽缓冲液和阴极电泳槽缓冲液中含有120mmol/L三羟基甲基氨基甲烷-N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸和0.4%(w/v)十二烷基硫酸钠，pH值调至8。本发明可以应用于市售的电泳槽或电泳仪中，更为优异的是使用于一次性的预制的即用型整体电泳装置中。实施例41、凝胶板的准备(1)洗板将洗洁精用温水稀释后，用它浸透海绵擦洗玻璃板，然后用自来水洗净，再用酒精将板擦干。(2)安装制胶板制胶前将玻璃板与塑料嵌条和凹型陶瓷板的边缘对齐，用塑料夹子夹好，注意要确保密封，安放在固定架上。2、制分离胶配制分离胶和浓缩胶前，先将凝胶贮液(30%ACr-O.8%Bis,BioRadl61-0158)与三羟基甲基氨基甲烷(Tris)-柠檬酸(Citrate)缓冲液(pH6.8),10%(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)及10%过硫酸铵(AP)混勻，然后加TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)入混合液，混勻。分离胶和浓缩胶分别含有8%(ν/ν)和4%(ν/ν)凝胶贮液，以及200mmol/L三羟基甲基氨基甲烷(Tris),0.2%(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS),0.05%(w/v)过硫酸铵及0.01%(v/v)TEMED0将制胶板垂直放好，插上与相应厚度的样品梳，在梳子下缘线Icm处做标记，卸下样品梳。将新配好的分离胶溶液缓慢加入制胶板之间，直至液面达到标记处。用滴管贴近胶液界面小心而又缓慢地覆盖厚度约0.5cm的正丁醇层，以防止溶液蒸发并保证胶面平整。约30至60分钟凝胶完全聚合。3、制浓缩胶分离胶聚合后，倒去正丁醇，用蒸馏水冲洗分离胶胶面两次，用滤纸吸去残液。用滴管将新配好的浓缩胶溶液加在分离胶面上，充满制胶板，插入样品梳。4、安装电泳槽浓缩胶聚合后，除去梳子以及夹子。将制胶扳、电泳糟内芯、另一对制胶板依次放入槽内。两制胶板的凹型陶瓷板均应与电泳槽内芯接触。然后插入楔型板以固定两套制胶板。如果每次电泳只用一块胶板，必须用提供的有机玻璃板代替另一套制胶板。5、加样在内外水槽加注电极缓冲液，使内外槽的水位均超过凹形板的缺口但低于玻璃板的上沿。阳极和阴极电泳槽缓冲液中含有lOOmmol/L三羟基甲基氨基甲烷(Tris)-HEPES和0.2%(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)，pH7.8。用微量加样器在梳井内加样。6、电泳盖好上盖，将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，在150V的电压下电泳约45分钟至丨小时，至溴酚蓝指示的电泳前沿到达制胶板的下缘止，关掉电源。然后拔掉楔形板，取下制胶扳。7，染色、脱色用刀片或薄板将白塑料板与陶瓷板轻轻撬开，用刀片沿分离胶与浓缩胶的交接处，将分离胶切下，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。然后手戴橡胶手套将分离胶小心移入染色器皿中。在染色器皿中加入IOOmL考马氏亮蓝染液(含0.25%(w/v)考马氏亮蓝R_250，30%(ν/ν)乙醇，10%(ν/ν)乙酸的水溶液)，加盖，在摇床上染色2h。再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。8、结果量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR相对迁移率mR=蛋白质样品距加样端迁移距离(cm)/溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>因此，本发明中的中性pH值的电泳缓冲溶液可用于保存12个月以上的可作为蛋白质分析用的聚丙烯酰胺凝胶。权利要求一种电泳用聚丙烯酰胺预制凝胶的缓冲系统，包括阳极电泳槽缓冲液、阴极电泳槽缓冲液、分离凝胶和浓缩凝胶，其特征在于所述浓缩凝胶和分离凝胶含有100～300mmol/L三羟基甲基氨基甲烷和0.1～0.4％(w/v)十二烷基硫酸钠，并以柠檬酸滴定pH至6.5～6.9；所述阳极电泳槽缓冲液和阴极电泳槽缓冲液中含有80～120mmol/L三羟基甲基氨基甲烷-N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸和0.1～0.4％(w/v)十二烷基硫酸钠，pH值调至7.5～8。2.如权利要求1所述电泳用聚丙烯酰胺预制凝胶的缓冲系统，其特征在于所述浓缩凝胶和分离凝胶含有200mmol/L三羟基甲基氨基甲烷及0.2%(w/v)十二烷基硫酸钠，以柠檬酸(Citrate)滴定pH至6.8；所述阳极电泳槽缓冲液和阴极电泳槽缓冲液中含有lOOmmol/L三羟基甲基氨基甲烷-N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸和0.2%(w/v)十二烷基硫酸钠，pH值调至7.8。3.一种制备电泳用聚丙烯酰胺预制凝胶的缓冲系统的方法，其特征在于(1)、将30%ACr-O.8%Bis凝胶贮液与三羟基甲基氨基甲烷-柠檬酸缓冲液，pH6.8，10%(w/v)十二烷基硫酸钠及10%过硫酸铵混勻，将N，N，N’，N’_四甲基乙二胺入混合液，混勻；分离胶含有8%(ν/ν)凝胶贮液、200mmol/L三羟基甲基氨基甲烷、0.2%(w/v)十二烷基硫酸钠，0.05%(w/v)过硫酸铵及0.01%(v/v)TEMED；浓缩胶分别4%(ν/ν)凝胶贮液、200mmol/L三羟基甲基氨基甲烷、0.2%(w/v)十二烷基硫酸钠，0.05%(w/v)过硫酸铵及0.01%(v/v)TEMED；(2)、将配置好的分离胶溶液缓慢加入制胶板之间，其上覆盖厚度为0.4-0.8cm的正丁醇层至凝胶完全聚合。(3)、分离胶聚合后，倒除正丁醇，用蒸馏水冲洗分离胶胶面两次，用滤纸吸去残液，用滴管将浓缩胶溶液加在分离胶面上，充满制胶板，插入样品梳；(4)、配阳极电泳槽缓冲液和阴极电泳槽缓冲液，向槽中加注电极缓冲液，阳极和阴极电泳槽缓冲液中含有lOOmmol/L三羟基甲基氨基甲烷-HEPES和0.2%(w/v)十二烷基硫酸钠，pH7.8。全文摘要一种电泳用聚丙烯酰胺预制凝胶的缓冲系统，属于凝胶电泳
技术领域：
包括阳极电泳槽缓冲液、阴极电泳槽缓冲液、分离凝胶和浓缩凝胶，其特征在于所述浓缩凝胶和分离凝胶含有100～300mmol/L三羟基甲基氨基甲烷和0.1～0.4％(w/v)十二烷基硫酸钠，并以柠檬酸滴定pH至6.5～6.9；所述阳极电泳槽缓冲液和阴极电泳槽缓冲液中含有80～120mmol/L三羟基甲基氨基甲烷-N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸和0.1～0.4％(w/v)十二烷基硫酸钠，pH值调至7.5～8本发明增加凝胶基质和缓冲液的稳定。在冰箱中储存一年多而不降低其性能。改善了Westernblot的分析结果。文档编号B01D57/02GK101825606SQ20091015318公开日2010年9月8日申请日期2009年9月24日优先权日2009年9月24日发明者汪弋申请人:杭州吉来生物技术有限公司