专利名称：从电泳后的聚丙烯酰胺胶中回收dna的方法
技术领域：
本发明涉及一种从电泳后的聚丙烯酰胺胶中回收DNA的方法。
背景技术：
聚丙烯酰胺凝胶电泳后，在一些情况下，如电泳片段克隆测序，需要对电泳DNA片段进行回收。由于丙烯酰胺以C-C键聚合，因此聚合后很难解聚，不能像琼脂糖胶一样采用酶类使之解聚，从而利于DNA从胶中释放；此外，聚丙烯酰胺凝胶即使在高温下也不会熔化，因此也不能像低熔点琼脂糖胶一样采用较高温度熔化，以利于DNA从胶中释放。在常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，胶的浓度通常为6-10％，在这种浓度下，聚丙烯酰胺胶交联所形成的胶格致密，同样不利于DNA的释放。
在一些文献报道及实验室具体操作中常用的方法是采用无菌枪头捣碎胶，然后将胶放在低温(4℃)下浸泡过夜，然后离心收集上清，以乙醇沉淀纯化DNA。在这种方法中，采用无菌枪头捣胶，即费时，胶的破碎度也不够，因此DNA释放量低，同时采用无菌枪头捣胶是一件费事并且效率低的工作；此外，为了保证胶中DNA能够最大程度释放，需要浸泡过夜，为了保证微量的DNA能够沉淀，乙醇沉淀的时间也要在30min以上。超长的操作时间，同时也是DNA降解的一个原因。因此，最终在大量时间耗费的情况下，也不能换来DNA回收量的提高。
发明的内容本发明目的是为了克服现有常规方法，操作时间长，DNA回收量低的缺点，提供一种从电泳后的聚丙烯酰胺胶中回收DNA的方法，该方法能够在4小时内从聚丙烯酰胺凝胶中回收目的片段DNA，所获DNA量大，纯度高，可用于后续的再扩增操作。
本发明的主要原理为在采用较高温度、低渗并且聚丙烯酰胺凝胶充分破碎情况下，DNA释放到溶液中的速度加快，释放到溶液中的DNA转入一种高盐、低pH的环境中，在此环境下DNA可与硅胶膜特异吸附。在低浓度的缓冲液或水中DNA又从硅胶膜释放，从而达到回收并纯化目的。
本发明的一种从电泳后的聚丙烯酰胺胶中回收DNA的方法，依次包括以下步骤1)样品清洗电泳后，在紫外灯下切下含DNA片段的胶条，胶条长0.6-1cm、宽1-3mm、厚0.75-1mm，放入1.5ml离心管中，以移液枪加入100-200μl ddH2O清洗胶条三次，完毕后，吸出清洗液；2)凝胶研磨以凝胶研磨棒研磨凝胶至成粉状；3)凝胶浸泡取150-200μl以10-30mM三羟基甲基氨基甲烷(Tris)、10-20mM乙二胺四乙酸(EDTA)组成的pH为8.0的TE缓冲液反复冲洗研磨棒，直至研磨棒不带有凝胶；70℃水浴1.5-2.5hr，期间振荡数次；4)凝胶去除8000-10000转/分，离心2min吸取上清；5)DNA连接上清移入一支新的离心管，加入450-600μl成份为6-10M异硫腈酸胍(GuSCN)、100-300mM三羟基甲基氨基甲烷(Tris)、pH值为5-6的DNA连接液，混合2min；6)DNA吸附将DNA硅胶吸附柱放置在离心管中，将混合液移入硅胶吸附柱，3000-6000转/分离心0.5min，弃离心管中液体；7)DNA洗涤DNA硅胶吸附柱中加入成份为10-20mM pH8.0的三羟基甲基氨基甲烷(Tris)，与无水乙醇1∶2-1∶4混合的DNA洗涤液500-800μl，以3000-6000转/分，离心0.5min，弃离心管中液体；重复操作1-2次；将DNA硅胶吸附柱重新放入离心管中，空管8000-9000转/分离心1min.。
8)DNA洗脱将DNA硅胶吸附柱移入一支新的离心管中，DNA硅胶吸附柱底部中央加入30-60μl预热至65℃的DNA洗脱液，成份为5-20mM pH8.0的三羟基甲基氨基甲烷(Tris)或ddH2O；65℃水浴2min，6000-9000转/分离心1min；重新将离心收集的液体加入到DNA硅胶吸附柱底部中央；65℃水浴1min，6000-9000转/分离心1min；离心管中收集液体即为从聚丙烯凝胶中回收的DNA溶液，-20℃保存。
上述ddH2O用于冲洗胶条表面的杂质和污染核酸；凝胶研磨棒为塑料小棒，底部可与1.5ml离心管致密吻合，商业购得，可灭菌反复使用；TE缓冲液用于浸泡凝胶，释放DNA，并抑制DNAase活性；DNA连接液提供一种高盐、低pH的环境，从而使DNA可以与硅胶膜结合；DNA洗涤液用于冲洗掉DNA以外的成分，在一定浓度的乙醇存在下，冲洗过程中，DNA不会溶失；DNA洗脱液用于溶解DNA。
本发明的优点和积极效果本发明具有以下优点和积极效果①DNA回收量大，纯度高。②操作时间短，操作简单。③不需要特殊设备，成本低廉。④可以制成试剂盒。⑤本发明也可用于琼脂糖凝胶的DNA回收。
具体实施例方式
下列实例是进一步对本发明的说明，不应该当作对本发明的限制。
实施例1按以下程序从电泳后的聚丙烯酰胺胶中回收DNA1)在紫外灯下切下含DNA片段的丙烯酰胺浓度为6％的胶条后(胶条长1cm，宽2mm，厚0.75mm)，放入1.5ml离心管中。
2)以移液枪加入150μl ddH2O清洗胶条三次，完毕后，吸出清洗液。
3)以凝胶研磨棒研磨凝胶至成粉状。
4)加入150μl TE缓冲液，成分15mM Tris，10mM EDTA(pH8.0)。反复冲洗研磨棒，直至研磨棒不带有凝胶。
5)70℃水浴2hr，期间振荡数次。8000转/分，离心2min，吸取上清。
6)上清移入一支新的离心管，加入450μl含6M GuSCN、200mM Tris，调整pH至6.0的DNA连接液，混合2min。
7)将DNA硅胶吸附柱放置在离心管中，将混合液移入吸附柱，3000转/分离心0.5min，弃离心管中液体。
8)DNA硅胶吸附柱中加入500μl成份为10mM Tris (pH8.0)，与无水乙醇3∶7混合的DNA洗涤液。3000转/分，离心0.5min。弃离心管中液体。重复操作2次。将DNA硅胶吸附柱重新放入离心管中，空管8000转/分离心1min。
9)将DNA吸附柱移入一支新的离心管中，DNA硅胶吸附柱底部中央加入30μl预热至65℃的成份为10mM Tris，pH8.0的DNA洗脱液。65℃水浴2min，6000转/分离心1min。重新将离心收集的液体加入到DNA硅胶吸附柱底部中央。65℃水浴1min，8000转/分离心1min。离心管中收集液体即为从聚丙烯凝胶中回收的DNA溶液，-20℃保存。
此例在3hr内，从胶中回收约800ng(纳克)的DNA，OD260/OD280为1.8，满足后续PCR再扩增要求。(OD260/OD280这个比值是用来表示DNA的纯度)实施例2按以下程序从电泳后的聚丙烯酰胺胶中回收DNA1)紫外灯下切下含DNA片段的丙烯酰胺浓度为8％的胶条后(胶条长0.8cm，宽1.5mm，厚1mm)后，放入1.5ml离心管中。
2)以移液枪加入200μl ddH2O(灭菌)清洗胶条三次，完毕后，吸出清洗液。
3)以凝胶研磨棒研磨凝胶至成粉状。
4)加入200μl成分为20mM Tris，15mM EDTA(pH8.0)TE缓冲液，反复冲洗研磨棒，直至研磨棒不带有凝胶。
5)70℃水浴2hr，期间振荡数次。10000转/分，离心2min，吸取上清。
上清移入一支新的离心管，加入600μl成份为8M GuSCN，300mM Tris，调整pH至5.8的DNA联接液，混合2min。
6)NA吸附将DNA硅胶吸附柱放置在离心管中，将混合液移入硅胶吸附柱，5000转/分离心0.5min，弃离心管中液体。
7)DNA洗涤DNA硅胶吸附柱中加入成份为15mM Tris(pH8.0)，与无水乙醇3∶7混合的DNA洗涤液800μl，4000转/分，离心0.5min。弃离心管中液体。重复操作2次。将DNA硅胶吸附柱重新放入离心管中，空管9000转/分离心1min。
8)DNA洗脱将DNA硅胶吸附柱移入一支新的离心管中，DNA硅胶吸附柱底部中央加入60μl预热至65℃的DNA洗脱液15mM Tris(pH8.0)。65℃水浴2min，7000转/分离心1min。重新将离心收集的液体加入到DNA硅胶吸附柱底部中央。65℃水浴1min，9000转/分离心1min。离心管中收集液体即为回收的DNA溶液，-20℃保存。
此例在3hr内，从胶中回收约720ng(纳克)的DNA，OD260/OD280为1.8，满足后述续PCR再扩增要求。
权利要求
1.一种从电泳后的聚丙烯酰胺胶中回收DNA的方法，依次包括以下步骤1)样品清洗电泳后，在紫外灯下切下含DNA片段的胶条，胶条长0.6-1cm、宽1-3mm、厚0.75-1mm，放入1.5ml离心管中，以移液枪加入100-200μl ddH2O清洗胶条三次，完毕后，吸出清洗液；2)凝胶研磨以凝胶研磨棒研磨凝胶至成粉状；3)凝胶浸泡取150-200μl以10-30mM三羟基甲基氨基甲烷、10-20mM乙二胺四乙酸组成的pH为8.0的TE缓冲液反复冲洗研磨棒，直至研磨棒不带有凝胶；70℃水浴1.5-2.5hr，期间振荡数次；4)凝胶去除8000-10000转/分，离心2min吸取上清；5)DNA连接上清移入一支新的离心管，加入450-600μl成份为6-10M异硫腈酸胍、100-300mM三羟基甲基氨基甲烷、pH值为5-6的DNA连接液，混合2min；6)DNA吸附将DNA硅胶吸附柱放置在离心管中，将混合液移入硅胶吸附柱，3000-6000转/分离心0.5min，弃离心管中液体；7)DNA洗涤DNA硅胶吸附柱中加入成份为10-20mM pH8.0的三羟基甲基氨基甲烷(Tris)，与无水乙醇1∶2-1∶4混合的DNA洗涤液500-800μl，以3000-6000转/分，离心0.5min，弃离心管中液体；重复操作1-2次；将DNA硅胶吸附柱重新放入离心管中，空管8000-9000转/分离心1min.。8)DNA洗脱将DNA硅胶吸附柱移入一支新的离心管中，DNA硅胶吸附柱底部中央加入30-60μl预热至65℃的DNA洗脱液，成份为5-20mM pH8.0的三羟基甲基氨基甲烷(Tris)或ddH2O；65℃水浴2min，6000-9000转/分离心1min；重新将离心收集的液体加入到DNA硅胶吸附柱底部中央；65℃水浴1min，6000-9000转/分离心1min；离心管中收集液体即为从聚丙烯凝胶中回收的DNA溶液，-20℃保存。
全文摘要
本发明涉及一种从电泳后的聚丙烯酰胺胶中回收DNA的方法，它依次包括以下步骤用dH
文档编号C12N15/10GK1935997SQ20061003735
公开日2007年3月28日 申请日期2006年8月29日 优先权日2006年8月29日
发明者罗鹏, 胡超群, 任春华, 王青柏 申请人:中国科学院南海海洋研究所