用于延长电泳凝胶有用电泳寿命的电泳缓冲液的制作方法
【专利摘要】提供一种用于延长包含三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS）的电泳凝胶的有用电泳寿命的电解质溶液，所述电解质溶液包含至少一种两性离子和水。所述电解质溶液可在适于凝胶电泳的缓冲液系统（例如SDS-PAGE）中使用。
【专利说明】用于延长电泳凝胶有用电泳寿命的电泳缓冲液
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求于2011年7月14日提交的美国临时专利申请61/507，883的优先权，其申请文件通过弓I用并入本文。
【技术领域】
[0002]所公开的主题主要涉及凝胶电泳。更具体地，所公开的主题涉及用于在凝胶电泳期间延长电泳凝胶有用电泳寿命的包含至少一种两性离子和水的电解质溶液。
【背景技术】
[0003]凝胶电泳是用于分离生物分子的一种常见方法，所述生物分子诸如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、多肽和蛋白质。在凝胶电泳中，所述分子根据所施加电场导致它们迁移通过过滤凝胶时的速率分离成条带。
[0004]在该技术中使用的基本设备包括封装于玻璃管内的凝胶，其作为平板夹置于玻璃或塑料板之间，或者倒入塑料托盘内。凝胶具有开放的分子网络结构，其限定由导电缓冲溶液饱和的孔。通过凝胶的这些孔足够大以容许迁移大分子通过。
[0005]凝胶放置于腔室中与缓冲液接触，上述缓冲液使得所述凝胶与电源的正极或负极之间进行电接触。将包含大分子和跟踪染料的样品放置于凝胶的顶部上。将电势施加到所述凝胶上，导致样品大分子和跟踪染料朝向凝胶的底部迁移。刚好在跟踪染料到达凝胶终端之前停止电泳。
[0006]用于分离蛋白质的最常见的缓冲液系统是Laemmli缓冲液系统，其包含0.375M的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，在分离胶中用HCl滴定至pH8.8。积层凝胶包含0.125M的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，滴定至pH6.8。阳极和阴极运行缓冲液包含0.024M的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，0.192M的甘氨酸，0.1%的SDS。已公开了多种不同的凝胶分离材料，其具有不同的组成、PH值特性、电压要求等。在本领域中最近创新的目标是要提供一种电泳凝胶，其可用于执行更快的、更精确的、更稳定的、或从而更通用的电泳。
[0007]已经提出许多不同的凝胶缓冲液系统，其适于在中性pH值下或附近使用，而不涉及使用Laemmli的Tris-HCl甘氨酸缓冲液系统。
[0008]例如,授予Updyke等人的美国专利第6，096, 182公开了在中性pH下的电泳凝胶。制备这种凝胶的优点在于凝胶系统是稳定的，具有降低的反应性和延长的保质期。
[0009]授予Hjerten等人的美国专利第5，464，517号公开了一种具有高缓冲能力和低导电性的电泳缓冲液。该类型缓冲液(特别是在毛细管电泳中)的优点在于其允许在更高的电压下从而更快速地进行分离。
[0010]大多数创新都专注于通过提出适于凝胶缓冲液的新配方来改善电泳。
[0011]目前，在预制电泳凝胶的生产和销售方面的主要障碍是它们的3个月左右的相当短的保质期。例如，对于预制的聚丙烯酰胺凝胶而言，据信它们的降解是在碱性条件下酰胺基团水解以便部分地形成阴离子羧酸衍生物的结果。因此，高PH值(例如pH值为8.0至9.5)被认为是降低了凝胶贮存时的稳定性。水解被认为是导致所分离分子的分离度损失、所分离分子迁移距离的降低、和蛋白质染色强度的降低。
[0012]因此，对延长超过它们正常有效期(保质期)的凝胶有用电泳寿命的试剂存在需求。
【发明内容】
[0013]在第一实施例中公开了用于延长电泳凝胶有用电泳寿命的一种电解质溶液，其包含:
-至少一种两性离子,其选自于2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇(AMPD)，N- (1，1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPS0)，N-甘氨酰甘氨酸(Gly-Gly)，4- (2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸(EPPS或HEPPS)，3-(环己基氨基)_1_丙磺酸(CAPS)，3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)，2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)，N，N-双[2-羟乙基]-2 -氨基乙磺酸(BES)，(2-[2-羟基-1，1-双(羟甲基)乙基氨基]乙磺酸)(TES)，N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)和3-N-吗啉丙磺酸(POPSO);以及_水。
[0014]该两性离子可以是4- (2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸(EPPS或HEPPS)。
[0015]该两性离子可以选自于N-甘氨酰甘氨酸(Gly-Gly)和3-(环己基氨基)_2_羟基-1-丙磺酸(CAPSO)。
[0016]电解质溶液的pH值可为约8.0至约11。
[0017]所述电解质溶液可进一步包含三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS )。
[0018]所述电解质溶液可进一步包含十二烷基硫酸钠(SDS )。
[0019]所述电解质溶液可进一步包含具有下述名称的螯合剂:乙二胺四乙酸(EDTA)，乙二醇四乙酸(EGTA)，次氮基三乙酸三钠盐，羟乙基乙二胺乙酸三钠(HEDTA三钠)，二亚乙基三氨基五乙酸五钠或2-氨基丙二酰脲乙酸二钠。
[0020]三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的浓度可为约IOmM至约500mM。
[0021]三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的浓度可为约50mM至约150mM。
[0022]三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的浓度可为约50mM至约300mM。
[0023]三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的浓度可为150mM。
[0024]两性离子的浓度可为约ImM至约500mM。
[0025]两性离子的浓度可为约IOmM至约500mM。
[0026]两性离子的浓度可为约25mM至约75mM。
[0027]两性离子的浓度可为约50mM至约lOOmM。
[0028]两性离子的浓度可为50mM。
[0029]两性离子的浓度可为lOOmM。
[0030]十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度可为0.5 % (重量/体积)或更低。
[0031 ] 十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度可为0.1 % (重量/体积)或更低。
[0032]十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度可为0.1 % (重量/体积)。
[0033]乙二胺四乙酸(EDTA)的浓度可为0.5% (重量/体积)或更低。
[0034]乙二胺四乙酸(EDTA)的浓度可为0.05% (重量/体积)或更低。[0035]乙二胺四乙酸(EDTA)的浓度可为0.03% (重量/体积)。
[0036]根据另一实施例，公开了用于在对至少一个样品进行电泳分离期间延长电泳凝胶有用电泳寿命的一种方法，所述方法包括以下步骤:
[0037]-根据本发明将电压施加到电解质溶液中，与其中包含至少一个样品的电泳凝胶接触。
[0038]根据另一实施例，公开了在对至少一个样品进行电泳分离期间延长电泳凝胶有用电泳寿命的一种方法，所述方法包括以下步骤:
[0039]-将至少一种两性离子加入到电泳缓冲液中，所述至少一种两性离子选自于2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇(AMPD)，N- (I, 1-二甲基_2_羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO), N-甘氨酰甘氨酸(Gly-Gly)，4- (2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸(EPPS或HEPPS)，3-(环己基氨基)-1_丙磺酸(CAPS)，3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPS0)，2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)，N，N-双[2-羟乙基]-2 -氨基乙磺酸(BES)，(2_[2_羟基-1，1-双(羟甲基)乙基氨基]乙磺酸)(TES)，N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)和3-N-吗啉丙磺酸(POPSO)。
[0040]该两性离子可以是4- (2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸(EPPS或HEPPS)。
[0041]该两性离子可选自于N-甘氨酰甘氨酸(Gly-Gly)和3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)。
[0042]本发明的方法可进一步包括将电压施加到电泳缓冲液中与其中包含至少一个样品的电泳凝胶接触的步骤。
[0043]下面的术语定义如下。
[0044]术语“改善分离度(resolution)”旨在意味着更好的分离度，其允许相对于具有更宽或更厚条带的其它分离装置，分离彼此相距一定距离或间隔开的更清晰或更窄的分子条带。这有利于对不同分子进行物理分离或分子量确定，所述分子在分子量的整个范围内构成这些条带。
[0045]术语“有用电泳寿命”旨在意味着在对于拥有者而言具有实用性方面的凝胶电泳的正常工作寿命。这涵盖下述时间段，在该时间段期间，电泳凝胶的电泳质量没有不可接受的损失(如分离度损失，迁移速度减小，迁移伪像(artefact )，聚丙烯酰胺凝胶过热，凝胶开裂或变形等)；以及在该时间段期间，电泳凝胶保持适用于其预期目的。
[0046]本发明主题的特征与优点根据以下对如附图中所示的所选实施例进行的详细描述将变得更加明了。正如将会认识到的那样，所公开和所要求保护的主题能够在各个方面进行修改，但是所有这些都不脱离权利要求书的范围。因此，附图和说明书在本质上应被视为是说明性的而并非是限制性的，所要求保护的主题全部范围在权利要求中限定。
【专利附图】
【附图说明】
[0047]图1示出根据本发明实施例在电解质溶液中进行电泳的聚丙烯酰胺凝胶，并与在TRIS-甘氨酸-SDS (基准)溶液中进行电泳的凝胶进行对比。所有进行电泳的凝胶都超过了它们的有效期。
[0048]图2示出根据本发明实施例在电解质溶液中进行电泳的聚丙烯酰胺凝胶，并与在TRIS-甘氨酸-SDS (基准)溶液中进行电泳的凝胶进行对比。所有进行电泳的凝胶都超过了它们的有效期。
[0049]图3示出根据本发明实施例在电解质溶液中进行电泳的聚丙烯酰胺凝胶(A)，并与在TRIS-甘氨酸-SDS (基准)溶液中进行电泳的凝胶(B)进行对比。所有进行电泳的凝胶都超过了它们的有效期。
[0050]图4示出根据本发明实施例在电解质溶液中进行电泳的聚丙烯酰胺凝胶。进行电泳的凝胶超过了它的有效期。
【具体实施方式】
[0051]本发明人现在意外地发现选择特定的两性离子来制备适于在凝胶电泳中使用的电解质溶液可导致意想不到地延长电泳凝胶适于它们在电泳中使用(或如在本文中也使用的电泳分离)的有用寿命。这种新颖性和意想不到的特性在任何其它特性之外，所确定的特定两性离子例如可使得电泳速度增加，改善凝胶的分离度，或两者兼而有之。例如当电解质溶液用作适于电泳设备的运行缓冲液(也被称为“电泳槽(reservoir) ”缓冲液)时可以观察到这种改进，其中在所述电泳设备中采用用于电泳的已经超过它们的预期有效期的电泳凝胶。
[0052]在实施例中，公开了用于进行凝胶电泳的电解质溶液。电解质包含特定组分。
[0053]两性离子
[0054]两性离子是如下的化合物，其总共带有为O的净电荷因而是电中性的，但在不同的原子上带有形式电荷。两性离子是极性的，通常非常易于溶于水，但难溶于大多数有机溶剂中。两性离子大多数情况下作为在一定PH值范围内的两性离子而存在。平均电荷为零时的pH值已知为分子等电点。
[0055]在本发明中受关注的两性离子属于通常被称为生物学缓冲液的种类，所述生物学缓冲液是在生物实验室中通常用作缓冲剂的缓冲液。可以列举的生物学缓冲液的实例是称为下述的那些，即双-三(2-双[2-羟乙基]氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇)，ADA(N-[2-乙酰氨基]-2-亚氨基二乙酸)，ACES (2-[2-乙酰氨基]-2-氨基乙磺酸)，PIPE (哌嗪-1，4- 二乙磺酸磺酸)，MOPSO (3- [N-吗啉基]-2-羟基丙磺酸)，双-三丙烷(1，3-双[三(羟甲基)甲氨基丙烷])，BES (N，N-双[2-羟乙基]-2-氨基乙磺酸)，MOPS (3-[N-吗啉基]丙磺酸)，TES (2-[2_羟基-1，1-双(羟甲基)乙基氨基]乙磺酸)，HEPES (N_[2_羟乙基]哌嗪-N’ - (2-乙磺酸)酸)，DIPSO (3-N, N- 二 [2-羟乙基]氨基-2-羟基丙磺酸)，MOBS(4-N-吗啉基丁磺酸)，TAPSO (3 [N-三-羟甲基-甲基氨基]-2-羟基丙磺酸)，TRIS (2-氨基-2-[羟甲基]-1，3-丙二醇)，HEPPSO (N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-羟基丙磺酸])，POPSO (哌嗪-N，N’-双[2-羟基丙磺]酸)，TEA (三乙醇胺)，EPPS (或HEPPS) (N_[2_羟乙基]-哌嗪-N’-[3 -丙磺]酸)，TRICINE (N-三[羟甲基]甲基甘氨酸)，GLY-GLY (二甘氨酸)，BICINE (N, N-双[2-羟乙基]甘氨酸)，HEPBS (N_[2_羟乙基]哌嗪-N’-[4- 丁磺]酸)，TAPS (N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸)，AMPD (2-氨基-2-甲基_1，3_丙二醇)，TABS (N-三[羟甲基]甲基-4-氨基丁磺酸)，AMPSO (3_[ (1，1-二甲基-2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸)，CHES (2- (N-环己基氨基)乙磺酸)，CAPSO (3-[环己基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸)，AMP (2-氨基-2-甲基-1-丙醇)，CAPS (3-环己基-1-丙磺酸)，以及CABS (4-[环己基氨基]-1-丁磺酸)。[0056]虽然这些两性离子的生物缓冲特性已得到确认，但是这些两性离子选定组的用于积极影响凝胶电泳性能以及适于凝胶电泳的有用电泳寿命的能力还未得到确认。
[0057]优选地，两性离子包括2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇(AMPD)，N- (1，1_ 二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPS0)，N-甘氨酰甘氨酸(Gly-Gly)，4- (2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸(EPPS或HEPPS)，3-(环己基氨基)_1_丙磺酸(CAPS)，3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)，2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)，N，N-双[2-羟乙基]-2 -氨基乙磺酸(BES)，(2-[2_羟基-1，1-双(羟甲基)乙基氨基]乙磺酸)(TES)，N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)和3-N-吗啉丙磺酸(P0PS0)。当电解质溶液用作适于在其中进行电泳的电泳设备的运行缓冲液(也被称为“电泳槽(reservoir) ”缓冲液)时，这些两性离子显著地使得电泳凝胶的有用电泳寿命延长超过它们的有效期。两性离子也可以添加到现有的运行缓冲液。当根据本发明在电解质溶液中使用这些两性离子时，可取的是将所述电解质溶液(例如使用NaOH或HCI)的pH值调节至用于进行电泳的合适的pH值。
[0058]根据另一个实施例，这些两性离子也可提高进行电泳时的速度(与在pH值为
8.3的Laemmli常规Tris-甘氨酸-SDS相比)，通过下述提高分离度(与在pH值为8.3的Laemmli常规Tris-甘氨酸-SDS相比)，即通过提高鲜明度(或清晰度)，通过提供所分离分子的更细或窄条带，通过提高分子之间的间隔(即单波段之间的距离)，或通过提高鲜明度(或清晰度)和分子分离两者。另外，当用于制备凝胶时，延长使用这些电解质溶液所制备的凝胶的保质期。两性离子可以单独使用或组合使用。
[0059]根据本发明用于制备电解质溶液以便如本文所述延长有用电泳寿命的这些两性离子的浓度范围为约ImM至约500mM，或约IOmM至约500mM，或约25mM至约500mM，或约50mM至约500mM，或约75mM至约500mM，或约IOOmM至约500mM，或约150mM至约500mM，或约200mM 至约 500mM，或约 250mM 至约 500mM，或约 300mM 至约 500mM，或约 350mM 至约 500mM，或约400mM至约500mM，或约450mM至约500mM，ImM到约450mM，或约IOmM至约450mM，或约25mM至约450mM，或约50mM至约450mM，或约75mM至约450mM，或约IOOmM至约450mM，或约150mM 至约 450mM，或约 200mM 至约 450mM，或约 250mM 至约 450mM，或约 300mM 至约 450mM，或约350mM至约450mM,或约400mM至约450mM, ImM至约400mM,或约IOmM至约400mM,或约25mM至约400mM的，或约50mM至约400mM，或约75mM至约400mM，或约IOOmM至约400mM，或约150mM至约400mM，或约200mM至约400mM，或约250mM至约400mM，或约300mM至约400mM，或约350mM至约400mM，ImM至约375mM，或约IOmM至约375mM，或约25mM至约375mM，或约50mM至约375mM，或约75mM至约375mM，或约IOOmM至约375mM，或约150mM至约375mM，或约200mM 至约 375mM，或约 250mM 至约 375mM，或约 300mM 至约 375mM，或约 350mM 至约 375mM，或ImM至约350mM，或约IOmM至约350mM的，或约25mM至约350mM，或约50mM至约350mM，或约75mM至约350mM，或约IOOmM至约350mM，或约150mM至约350mM，或约200mM至约350mM，或约250mM至约350mM，或约300mM至约350mM，ImM至约300mM，或约IOmM至约300mM，或约25mM至约300mM，或约50mM至约300mM，或约75mM至约300mM，或约IOOmM至约300mM，或约150mM至约300mM，或约200mM至约300mM，或约250mM至约300mM，ImM至约250mM，或约IOmM至约250mM，或约25mM至约250mM，或约50mM至约250mM，或约75mM至约250mM，或约IOOmM至约250mM，或约150mM至约250mM，或约200mM至约250mM，ImM至约200mM，或约IOmM至约200mM，或约25mM至约200mM，或约50mM至约200mM，或约75mM至约200mM，或约IOOmM 至约 200mM，或约 150mM 至约 200mM，ImM 至约 150mM，或约 IOmM 至约 150mM，或约 25mM至约150mM，或约50mM至约150mM，或约75mM至约150mM，或约IOOmM至约150mM，ImM至约IOOmM,或约IOmM至约IOOmM,或约25mM至约IOOmM,或约50mM至约IOOmM,或约75mM至约IOOmM, ImM 至约 75mM，或约 IOmM 至约 75mM，或约 25mM 至约 75mM，或约 50mM 至约 75mM，ImM至约50mM，或约IOmM至约50mM，或约25mM至约50mM，ImM至约25mM，或约IOmM至约25mM，或约ImM至约IOmM,或约25mM至约50mM,或约25mM至约IOOmM,或约IOmM至约IOOmM,或约ImM至约IOOmM,或约ImM至约75mM,或约IOmM至约75mM,或约ImM至约IOmM,或约ImM至约50mM，或约IOmm至约50mM，或约25mM至约375mM，且优选地为100mM。
[0060]在pH值为约8.0至10.5的条件下获得4_ (2_羟乙基)哌嗪_1_丙磺酸(EPPS或HEPPS )的最优结果。
[0061]三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)基料
[0062]TRIS是已知为三(羟甲基)氨基甲烷有机化合物的缩写，其分子式为(H0CH2)3CNH2。TRIS可广泛地在生物化学和分子生物学方面中使用。在生物化学方面，TRIS被广泛地用作缓冲溶液诸如在TAE和TBE缓冲液中的组分，特别是对核酸溶液而言，且是可广泛地在Tris-甘氨酸缓冲液中的蛋白质电泳中使用的Laemmli缓冲液的基本成分。
[0063]Tris还允许将本发明的电解质溶液的pH值朝向更碱性的pH值设置。根据一个实施例，根据本发明包含47.5mM EPPS的电解质溶液可具有约为5.9的pH值。加入Tris (约150mM)增加pH值至约8.7。Tris在优选浓度范围内对迁移速度具有积极的影响。
[0064]Tris可以不存在于本发明的电解质溶液中。但是，根据本发明可用于制备电解质溶液的Tris基料的浓度范围为约OmM至约500mM。Tris的浓度对溶液pH值具有直接的影响。Tris的数量增加使得pH值增大。这允许细微调节以便改变本发明的电解质溶液使其适于不同的凝胶化学，并保持与凝胶和缓冲液兼容的适当PH比值。Tris的浓度可为约OmM至约500mM，或约IOmM至约500mM，或约25mM至约500mM，或约50mM至约500mM，或约75mM 至约 500mM，或约 IOOmM 至约 500mM，或约 150mM 至约 500mM，或约 200mM 至约 500mM，或约250mM至约500mM，或约300mM至约500mM，或约350IOmM至约500mM，或约400mM的至约500mM，或约450mM至约500mM，或约OmM至约450mM，或约IOmM至约450mM，或约25mM至约450mM，或约50mM至约450mM，或约75mM至约450mM，或约IOOmM至约450mM，或约150mM至约450mM，或约200mM至约450mM，或约250mM至约450mM，或约300mM至约450mM，或约350mM至约450mM,或约400mM至约450mM,或约OmM至约400mM,或约IOmM至约400mM,或约25mM至约400mM，或约50mM至约400mM，或约75mM至约400mM，或约IOOmM至约400mM，或约150mM至约400mM，或约200mM至约400mM，或约250mM至约400mM，或约300mM至约400mM，或约350mM至约400mM，或约OmM至约375mM，或约10毫至约375mM，或约25mM至约375mM，或约50mM至约375mM，或约75mM至约375mM，或约IOOmM至约375mM，或约150mM至约375mM，或约200mM至约375mM，或约250mM至约375mM，或约300mM至约375mM，或约350mM至约375mM,或约OmM至约350mM，或约IOlmM到约350mM，或约25mM至约350mM，或约50mM至约350mM,或约75mM至约350mM，或约IOOmM至约350mM，或约150mM至约350mM，或约200mM至约350mM，或约250mM至约350mM，或约300mM至约350mM，或约OmM至约300mM，或约IOmM至约300mM，或约25mM至约300mM，或约50mM至约300mM，或约75mM至约300mM，或约IOOmM至约300mM，或约150mM至约300mM，或约200mM至约300mM，或约250mM至约300mM，或约OmM至约250mM，或约IOmM至约250mM，或约25mM至约250mM，或约50mM至约250mM，或约75mM至约250mM，或约IOOmM至约250mM，或约150mM至约250mM，或约200mM至约250mM，或约OmM至约200mM，或约IOmM的至约200mM，或约25mM至约200mM，或约50mM至约200mM，或约75mM至约200mM，或约IOOmM至约200mM，或约150mM至约200mM，或约OmM至约150mM，或约IOmM至约150mM，或约25mM至约150mM，或约50mM至约150mM，或约75mM至约150mM，或约IOOlOmM至约150mM，或约OmM至约IOOmM,或约IOmM至约IOOmM,或约25mM至约IOOmM,或约50mM至约IOOmM,或约75mM至约IOOmM,或约OmM至约75mM，或约IOmM至约75mM，或约25mM至约75mM，或约50mM至约75mM，或约OmM至约50mM，或约IOmM至约50mM，或约25mM至约50mM,或约OmM至约25mM,或约IOmM至约25mM,或约25mM至约50mM,或约25mM至约IOOmM,或约IOmM至约IOOmM,或约IOmM至约75mM,或约IOmm至约50mM,或约25mM至约375mM。优选地，Tris的浓度为约50mM至约375mM，优选为150mM。
[0065]十二烷基硫酸钠或其它阴离子表面活性剂
[0066]十二烷基硫酸钠(SDS) (C12H25SO4Na)是一种阴离子表面活性剂，其在SDS-PAGE技术中通常用于制备适于电泳的蛋白质。该分子具有连接到硫酸基团的12个碳原子的尾链，赋予分子洗涤剂所需的两亲性质。
[0067]SDS可任选地加入到本发明的电解质溶液中。由根据本发明的电解质溶液所获得的优异结果以与SDS的存在无关的方式获得。根据本发明用于制备电解质溶液以便适于本文所述所有应用的SDS的浓度范围为约0.5%或更低，或约0.4%或更低，或约0.3%或更低,或约0.2%或更低，或约0.1 %或更低，或约0.1%至约0.5%，或约0.2%至约0.5%，或约0.3 %至约0.5%，或约0.4%至约0.5%，或约0.1 %至约0.4%，或约0.2%至约0.4%，或约0.3%至约0.4%，或约0.1 %至约0.3%，或约0.2%至约0.3%，或约0.1 %至约0.2%。优选地，约0.1 %或更低，并且最优选为0.1%。
[0068]在本发明的电解质溶液中可包含其它阴离子表面活性剂，诸如以任选的非限制性方式提供适于蛋白质分析缓冲液变性性能的一种阴离子表面活性剂:SDS，十二烷基硫酸纳，十二烷基硫酸裡(LDS),月桂基硫酸纳(SLS),月桂基硫酸纳或十二烷基横酸纳(NaDS)。根据本发明用于制备电解质溶液以便适于本文所述所有应用的上述阴离子表面活性剂的浓度范围为从1.0%或更低。优选地，约0.1 %或更低，且最优选地，为约0.1%。
[0069]螯合剂
[0070]乙二胺四乙酸(EDTA)可起到用作螯合剂的作用，即其能够“螯合”金属离子，诸如Ca2+和Fe3+。在由EDTA结合之后，金属离子留在溶液中但表现出减少的反应性。其它螯合剂可包括乙二醇四乙酸(EGTA)，次氮基三乙酸三钠盐，羟乙基乙二胺乙酸三钠(HEDTA三钠)，
二亚乙基三氨基五乙酸五钠或2-氨基丙二酰脲乙酸二钠。
[0071]EDTA可任选地加入到本发明的电解质溶液中。根据本发明用于制备电解质溶液以便适于本文所述所有应用的EDTA的浓度范围为约0.5%或更低，或约0.4%或更低，或约0.3%或更低，或约0.2%或更低，或约0.1 %或更低，或约0.05%或更低，或约0.03%至约0.5%，或约0.05 %至约0.5%，或约0.1 %至约0.5%，或约0.2%至约0.5%，或约0.3%至约0.5%，或约0.4%至约0.5%，或约0.03%至约0.4%，或约0.05%至约0.4%，或约0.1%至约0.4%，或约0.2%至约0.4%，或约0.3%至约0.4%，或约0.03%至约0.3%,或约0.05 %至约0.3 %，或约0.1 %至约0.3 %，或约0.2 %至约0.3 %，或约0.03 %至约0.5%，或约0.05%至约0.2%，或约0.1%至约0.2%，或约0.03%至约0.1%，或约0.05%至约0.1%，或约0.03 %至约0.05%。优选地，约0.05 %或更低，并且最优选为0.03%。
[0072]电解质溶液的用途
[0073]在使用中，本发明的电解质溶液与非常广泛范围的其它缓冲液系统相容。本发明的电解质溶液可用于对用与本发明缓冲液系统相同或不同的缓冲液系统所制备的任何类型的凝胶进行电泳，所述凝胶甚至包括使用不同化学性质的凝胶，诸如在适当条件下可用作缓冲剂的MOPS (诸如在美国专利公开第20060118418号中所述的那些)。
[0074]根据本发明，电泳包括可被相应分离的DNA或蛋白质或任何其它类型的分子的样品分离，以及它们迁移到膜或其它合适的固体支撑物上，诸如通常适用于诸如蛋白质(Western)转移和印迹的硝基纤维素、尼龙、聚偏氟乙烯或其它类型的膜。
[0075]根据本发明的电解质溶液可在商业制造的电泳室和/或系统中使用。例如，Invitrogen? (英杰)Surelock?, BioRad? (伯乐)Min1-PlOtean?，
Protean?2，Protean?III，Protean? Tetra。其它等效系统也能起到如此的作用。
[0076]本发明的电解质溶液可在分子生物学和生物化学中所用的大多数凝胶中用作缓冲液系统，如在经典的参考文献中所述的那样，诸如:Uriell966, Bull.SOC.Chem.Biol.(生物化学协会公报)48:969 ；Peacock & Dingmanl967, Biochem (生物化学)6 (6),1818-1827 ；Peacock & Dingmanl968, Biochem7 (2),668-674 ；Gaal, Electrophoresis inthe separation of biological macromolecules (用于分离生物大分子的电泳)，第 422 页，Wiley, 1980。本发明的电解质溶液在天然(无SDS)或变性条件下(用SDS变性)可包含于丙烯酰胺凝胶(聚丙烯酰胺凝胶)中，其通常用浓度为约4%至约25%的丙烯酰胺制备。本发明的电解质溶液可包含于琼脂糖凝胶中，其通常用浓度为约0.5%至约3%的琼脂糖制备。
[0077]EPPS(或 HEPPS)、TAPS、TES 或 BES Glygly 可以 25mM 至 150mM 以及优选为 50mM 的工作浓度加入到Laemmli缓冲液Tris-甘氨酸-SDS中，并延长电泳凝胶的有用电泳寿命。
[0078]可诜的实施方式 实施例1
NOVEX?:预制凝胶的凝胶电泳
[0079]根据本发明的电解质溶液制备成与聚丙烯酰胺凝胶一起使用，所述聚丙烯酰胺凝胶使用诸如Laemmli缓冲液系统(Tris-甘氨酸-SDS)的传统配方制成。示例性电解质溶液为:
[0080]两性离子=EPPS:6 克(47.5mM)，Tris(基料):9 克(148.6mM),SDS:0.5 克(0.1%)。将粉末溶解于多达500毫升体积的蒸馏水中。
[0081]用根据本发明的两性离子以及根据Laemmli缓冲液系统(Tris-甘氨酸-SDS)的经典运行缓冲液来制备500毫升的运行缓冲液。针对每一缓冲液运行来自NOVEX?啲老化匹配的预制凝胶(根据Leammli缓冲液系统用作为缓冲液的pH值为8.3的Tris和甘氨酸制成)，超过它们的有效期(如图1中所示)。蛋白质分子量标记物在电泳凝胶上分离。电泳是在由凝胶制造商所推荐的125V下进行。电泳运行的持续时间被记录下来，并评估凝胶迁移质量。在电泳运行之后，测量从前部迁移到凝胶底部的迁移速度，以及包含10个条带的重量为15KDa到175KDa之间的预先染色的分子量标记物的分离度。将在根据本发明电解质溶液中运行的每一这些凝胶条带的分离度与在Laemmli运行缓冲液(Tris-甘氨酸-SDS,TGS)的标准运行进行比较。结果表明超过其有效期3年以上凝胶在本发明溶液中运行却更可接受，而这些较旧的凝胶在经典TGS溶液中运行，在最陈旧凝胶情况下的迁移期间内降解，或显示清晰的迁移伪像(参见图1中的凝胶图像，在第二行和第四行中的最后一列)。实施例2
IDGEL?预制凝胶的凝胶电泳
[0082]将在2010年6月4日制备的老化预制凝胶(IDGel?)保持在4°C下，直至在2011年6月10日使用。根据本发明的电解质溶液与实施例1中的(EPPS缓冲液)是相同的，并且其可与经典的TGS Laemmli缓冲液(TGS缓冲液)相比。电泳在180V下进行30分钟(EPPS缓冲液)或40分钟(TGS缓冲液)。在电泳运行之后，测量从前部迁移到凝胶底部的迁移速度，以及包含10个条带的重量为15KDa到175KDa之间的预先染色的分子量标记物的分离度。结果表明，在根据本发明的EPPS缓冲液中分离的IDGel?良好地迁移以及显示出清晰和良好分离的条带。在对照的TGS缓冲液中迁移的IDGel?显示明显更模糊的条带(参见图2中的第20号)。在电泳过程中当凝胶膨胀并从凝胶盒离开悬吊时凝胶基质也变形(参见图2中的第30号)。此外，由于过热在盒的玻璃板和凝胶之间的气泡是明显的(参见图2中的第10号)。在TGS缓冲液中所测得的温度是65°C。
实施例3
PAGEr?G0LD预制凝胶的凝胶电泳
[0083]将具有8-16%的丙烯酰胺梯度的超过有效期4个月的预制凝胶(来自龙沙(Lonza)的PAGEr?Gold)保持在4°C，直至使用。根据本发明的电解质溶液与实施例1中的(EPPS缓冲液)是相同的，并且其可与经典的TGS Laemmli缓冲液(TGS缓冲液)相比。电泳在300V下进行21分钟(EPPS缓冲液)或在200V下进行74分钟(TGS缓冲液)。现在参照图3A和3B。在电泳运行之后，测量从前部迁移到凝胶底部的迁移速度，以及比较预先染色的分子量标记物和其它蛋白质样品的分离度。结果表明，总体而言，在根据本发明的EPPS缓冲液中分离的PAGErTMGold凝胶(图3A)良好地迁移以及显示出清晰和良好分离的条带。在对照的TGS缓冲液中迁移的PAGErTMGold凝胶显示明显更模糊的条带(参见图3B)。由于施加到每种凝胶上的电压是不同的，在对照的TGS缓冲液中分离的PAGErTMGold凝胶预期经过较长时间完成其迁移。然而，在根据本发明的EPPS缓冲液中分离的PAGErTMGold凝胶与预期施加相同电压情况下相比更快速地完成其迁移，具有优于在对照的TGS缓冲液中分离的PAGEr?Gold凝胶的分离度。
实施例4
EPPS预制凝胶的凝胶电泳
[0084]现在参照图4，预制凝胶(12%丙烯酰胺)与实施例1中的(EPPS缓冲液)是相同的，所述预制凝胶包含基于EPPS缓冲液，直至使用已经在4°C存储了 13个月且在根据本发明的电解质溶液中分离。电泳在225V下进行19分钟。现在参照图4，在电泳运行之后，测量从前部迁移到凝胶底部的迁移速度，以及评估预先染色的分子量标记物和其它蛋白质样品的分离度。结果表明，除了其老化之外，在根据本发明的EPPS缓冲液中分离的全部凝胶良好地迁移以及显示出清晰和良好分离的条带。
[0085]本文中所展现的实施方式和实施例在要求保护主题的通常本质上是说明性的而并非限制性的。在不脱离所要求保护的公开主题的精神和范围的情况下，由本领域的那些技术人员将理解针对各种应用且以各种方式如何被容易地变型和/或更改这些实施例。本发明的权利要求应理解成以非限制的方式包括本发明主题的所有替代实施方式和等同方案。本文中所用的短语、措词和术语是说明性的而并非限制性的。在法律允许的情况下，本文中所列举的所有参考文献通过引用以其整体并入本文。应该理解的是，本文所公开不同实施方式的任何方面可与一定范围内的可能替代实施方式和特征的替代性组合相结合，应当理解特征的所有这些改变的组合都构成所要求保护主题的一部分。
【权利要求】
1.用于延长电泳凝胶有用电泳寿命的一种电解质溶液，其包含: -至少一种两性离子,其选自于2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇(AMPD)，N- (1，1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)，N-甘氨酰甘氨酸(Gly-Gly)，4- (2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸(EPPS或HEPPS)，3-(环己基氨基)_1_丙磺酸(CAPS)，3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)，2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)，N，N-双[2-羟乙基]_2 -氨基乙磺酸(BES)，(2-[2_羟基-1，1-双(羟甲基)乙基氨基]乙磺酸)(TES)，N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)和3-N-吗啉丙磺酸(POPSO);以及 _水。
2.根据权利要求1所述的电解质溶液，其特征在于所述两性离子是4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸(EPPS或HEPPS)。
3.根据权利要求1所述的电解质溶液，其特征在于所述两性离子选自N-甘氨酰甘氨酸(Gly-Gly)和3-(环己基氨基)_2_羟基-1-丙磺酸(CAPSO)。
4.根据权利要求1至3任一项所述的电解质溶液，其特征在于电解质溶液的pH值为约8.0 至约 11.0。
5.根据权利要求4所述的电解质溶液，其特征在于所述电解质溶液还包含三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。
6.根据权利要求1所述的电解质溶液，其特征在于所述电解质溶液还包含十二烷基硫酸钠(SDS)。
7.根据权利要求1至6任一项所述的电解质溶液，其特征在于所述电解质溶液还包含具有下述名称的螯合剂:乙二胺四乙酸(EDTA)，乙二醇四乙酸(EGTA)，次氮基三乙酸三钠盐，羟乙基乙二胺乙酸三钠(HEDTA三钠)，二亚乙基三氨基五乙酸五钠或2-氨基丙二酰脲乙酸二钠。
8.根据权利要求5所述的电解质溶液，其特征在于三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的浓度为约IOmM至约500mM。
9.根据权利要求8所述的电解质溶液，其特征在于三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的浓度为约50mM至约150mM。
10.根据权利要求8所述的电解质溶液，其特征在于三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的浓度为约50mM至约300mM。
11.根据权利要求8所述的电解质溶液，其特征在于三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的浓度为150mM。
12.根据权利要求1至11任一项所述的电解质溶液，其特征在于两性离子的浓度为约ImM 至约 500mM。
13.根据权利要求12所述的电解质溶液，其特征在于两性离子的浓度为约IOmM至约500mMo
14.根据权利要求12所述的电解质溶液，其特征在于两性离子的浓度为约25mM至约75mM0
15.根据权利要求12所述的电解质溶液，其特征在于两性离子的浓度为约50mM至约IOOmM0
16.根据权利要求15所述的电解质溶液，其特征在于两性离子的浓度为50mM。
17.根据权利要求15所述的电解质溶液，其特征在于两性离子的浓度为lOOmM。
18.根据权利要求7至17任一项所述的电解质溶液，其特征在于十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度为0.5% (重量/体积)或更低。
19.根据权利要求18所述的电解质溶液，其特征在于十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度为.0.1 % (重量/体积)或更低。
20.根据权利要求18所述的电解质溶液，其特征在于十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度为.0.1% (重量/体积)。
21.根据权利要求8至20任一项所述的电解质溶液，其特征在于乙二胺四乙酸(EDTA)的浓度为0.5% (重量/体积)或更低。
22.根据权利要求21所述的电解质溶液，其特征在于乙二胺四乙酸(EDTA)的浓度为.0.05 % (重量/体积)或更低。
23.根据权利要求22所述的电解质溶液，其特征在于乙二胺四乙酸(EDTA)的浓度为.0.03% (重量/体积)。
24.用于在对至少一个样品进行电泳分离期间延长电泳凝胶有用电泳寿命的一种方法，所述方法包括以下步骤: ?将电压施加到根据权利要求1至23任一项所述的电解质溶液中，与其中包含至少一个样品的电泳凝胶接触。
25.在对至少一个样品进行电泳分离期间延长电泳凝胶有用电泳寿命的一种方法，所述方法包括以下步骤: ?将至少一种两性离子加入到电泳缓冲液中，所述至少一种两性离子选自于2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇(AMPD)，N- (I, 1-二甲基_2_羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO), N-甘氨酰甘氨酸(Gly-Gly)，4- (2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸(EPPS或HEPPS)，.3-(环己基氨基)-1_丙磺酸(CAPS)，3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPS0)，2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)，N，N-双[2-羟乙基]-2 -氨基乙磺酸(BES)，(2_[2_羟基-1，1-双(羟甲基)乙基氨基]乙磺酸)(TES)，N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)和3-N-吗啉丙磺酸(POPSO)。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于所述两性离子是4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸(EPPS或HEPPS)。
27.根据权利要求25所述的方法，其特征在于两性离子选自N-甘氨酰甘氨酸(Gly-Gly)和3-(环己基氨基)_2_羟基-1-丙磺酸(CAPSO)。
28.根据权利要求25至27任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括将电压施加到所述电泳缓冲液与其中包含至少一个样品的电泳凝胶接触的步骤。
【文档编号】B01D57/00GK104011537SQ201280034735
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2012年7月12日 优先权日:2011年7月14日
【发明者】石磊 申请人:德加尔电系统公司