一种以壳寡糖为佐剂的鸭疫里默氏菌菌影疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用疫苗生产领域，涉及一种鸭用细菌疫苗的制备方法，尤其是涉及 一种以壳寡糖为佐剂的鸭疫里默氏菌菌影疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002] 鸭疫里默氏菌RA)主要侵害2-7周龄雏鸭，以神经 症状和纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征，是目前危害养鸭生产的主要细菌性传染 病之一。该病可通过呼吸道、消化道及皮肤创伤感染，并常常与大肠杆菌、副黏病毒等病原 形成混合感染，引起鸭的大批死亡。
[0003] 鸭疫里默氏菌虽然对一些抗生素敏感，但机体内难以完全清除；同时由于抗生素 的不合理使用，其耐药性日益普遍，一方面加大了抗生素治疗的难度，另一方面往往导致禽 产品的药物残留问题日益突出。防控该病的科学方法，是在强化饲养管理的基础上，接种适 宜的鸭疫里默氏菌疫苗。
[0004] 目前关于鸭疫里默氏菌的疫苗方面已经有一些研宄报道，例如，鸭疫里默氏菌灭 活苗、二价复合佐剂灭活疫苗等。细菌经过灭活，其细胞表面的结构往往被破坏而影响抗原 性，不能刺激机体产生较为全面的保护。近年来，疫苗制备方面开展了新型菌影(或菌蜕、鬼 影)的许多研宄，解决了保持细菌外表完整性的问题。该方面的研宄在鸭疫里默氏菌也有一 些报道，证实利用该方法制备的菌影疫苗具有较高的保护率。动物的主要感染途径是呼吸 道和消化道，呼吸道、消化道表面的黏膜免疫屏障（以分泌型免疫球蛋白SIgA为代表）是抵 御病原感染的第一道屏障。由于鸭疫里默氏菌制备成菌影后基本丧失了在呼吸道的定殖能 力，所以不能产生局部免疫，只能通过注射免疫动物，因而仍然存在以下几方面的问题：① 通过注射免疫，给动物造成很大的免疫应激，往往引起副黏病毒、大肠杆菌乘虚而入，导致 严重的继发感染。②灭活苗只能引起体液免疫，不产生或仅产生轻微局部黏膜免疫，不能提 供可靠的抵抗感染的黏膜免疫屏障。
【发明内容】
[0005] 鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种装载具有干扰素诱导活性的 聚肌胞苷酸，并加入壳寡糖作为佐剂的鸭疫里默氏菌菌影疫苗。本发明所提供的技术方案 对有效防治鸭疫里默氏菌感染，以及减少家禽养殖过程中抗菌药物的使用、减少药物残留 等具有重要意义。
[0006] 为了解决【背景技术】所存在的问题，本发明是采用以下技术方案： 选择本实验室鉴定保存的2型鸭疫里默氏菌临床分离株(编号为WF1)作为基础菌株。 冷冻保存的菌种复苏后，按常规试验方法制备成原生质体备用。
[0007] 利用常规分子生物学技术，将噬菌体PhiX174的E基因（简称E)与金黄色葡萄球 菌核酸酶A基因序列（SN)通过15个柔性氨基酸串联为E-SN双基因，然后与温控表达载 体PBV220连接，构建温控表达载体pBV-E-SN。将该表达载体按常规试验方法电转化前述制 备的鸭疫里默氏菌原生质体，筛选阳性克隆得到鸭疫里默氏菌工程菌。
[0008] 将得到的鸭疫里默氏菌工程菌常规方法28°C增菌培养，生长至OD_至0. 6~0. 7时 迅速升温至42°C诱导裂解基因的表达。当OD6tltl不再降低时，降温至37°C于菌影中按9:1的 比例加入10 U g/mL的聚赖氨酸在37°C条件下作用24h，以充分灭活残存的活菌而不破坏其 表面结构。菌体抽样，稀释后涂平板检测，无活菌生长的判定为合格。然后离心分离菌体， 冷冻干燥。
[0009] 干燥菌体按I :1 (w/v)的比例加入到按常规方法配制的浓度为6mg/mL的聚肌胞 溶液中，搅拌成菌泥初步溶胀6h，使聚肌胞包埋进入菌影内。
[0010] 壳寡糖配制成2% (w/v)的水溶液，将上述经过溶胀的菌泥按2 :8的比例加入，充 分搅拌形成均一混合物，分装于西林瓶，冷冻干燥，即得到鸭疫里默氏菌菌影壳寡糖佐剂疫 苗。
[0011] 疫苗使用前，加生理盐水适当稀释，饮水免疫雏鸭。由于菌影被带正电荷的壳寡糖 所包裹，可以较紧密地吸附于消化道黏膜表面，便于被树突状细胞捕获，发生抗原递呈而刺 激黏膜免疫反应，而且壳聚糖作为载体具有保护抗原免除降解和缓释作用；另一方面，抗原 加工过程中，菌影包含的聚肌胞苷酸被释放，刺激机体内源性干扰素水平升高，提高了机体 免疫力，尤其是增强了对病毒性病原的抵御能力。
[0012] 与现有技术相比，本发明涉及的利用温控裂解基因制备鸭疫里默氏菌菌影疫苗具 有如下优点和显著进步： ①本发明所提供的鸭疫里默氏菌菌影疫苗，通过饮水免疫，避免了注射免疫的应激； 免疫不仅可以刺激机体产生对鸭疫里默氏菌的抗体，还可引起机体内源性干扰素水平升 高，防止病毒性感染的发生。
[0013] ②传统灭活疫苗以及目前所报道的有关鸭疫里默氏菌菌影疫苗，通过注射免疫， 只能引起体液免疫反应，保护效果有一定局限性。本发明所提供的技术方案，一方面刺激 呼吸道和消化道局部的黏膜免疫反应，为抵御鸭疫里默氏菌的侵染提供第一道免疫防御屏 障；另一方面，壳寡糖可以促进菌影透过黏膜进入体内，刺激机体的体液免疫，从而提供较 全面的免疫保护。
【具体实施方式】
[0014] 以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明 的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发 明的保护范围之内。
[0015] 实施实例一鸭疫里默氏菌菌影的制备 I. 1原生质体的制备：将编号为WFl的RA2型菌株活化后，培养至OD_为0. 7时，将 菌液置于冰水浴中30min，取IOmL菌液，4°C，5000rpm离心10min，弃上清，用IOmL冰水浴 灭菌水洗涤菌泥，再次离心，如此重复洗涤三次。再用冰水浴高渗缓冲液悬浮，加入预热的 溶菌酶溶液至5mg/mL，37°C水浴30min后，再加入预热的EDTA溶液至0.0 lmol/L，37°C水浴 20min。作用过程中，每隔5min取处理的菌液于载玻片上，复红染色，油镜下观察原生质体 的生成情况。当原生质体的形成率达到95%以上时，5000rpm离心20min，弃上清，再加入改 良TSB液体再生培养基离心洗涤3次，弃上清。最后将原生质体用改良TSB液体再生培养 基悬浮。
[0016] 1.2温控表达载体的构建：将噬菌体PhiX174裂解蛋白E基因序列（E， GI:9626372)与金黄色葡萄球菌核酸酶A基因序列（SN，GI:21281729)通过15个柔性氨 基酸linker (G4S)3串联为E-SN双基因，转入克隆载体PMD19T-simple中，构建重组克隆载 体pMD-E-SN。然后用ECOR I和PST I分别对温控表达载体pBV220和重组克隆载体pMD-E -SN进行双酶切和连接，构建重组温控表达载体pBV-E-SN。
[0017] 1. 3电转化及阳性克隆的筛选：取IOy L溶菌质粒加入40 y L制备好的原生质体 细胞中，小心混匀，冰上放置5min后移入0.1 cm的电击杯中。电参设置为：15Kv/cm，50 y Fd， 150 D，5ms，进行电击转化。电击后，立即