往电击杯中加入960 y L TSB再生培养基，将菌液转 移至灭菌I. 5mL离心管中，28°C，150r/min摇菌2h。离心菌液，弃掉800 y L上清，用剩余液 体重悬菌体，与冷至45°C的TSB再生软琼脂培养基（35 y g /mL Amp+)混匀，倾入到TSB再 生固体培养基（35 yg/mL Amp+)上面，28°C培养。挑取平板上长出的单菌落，接种到含Amp+ (100 yL/mL)的TSB液体培养基的试管中，28°C振摇培养过夜，通过菌液PCR鉴定为阳性。
[0018] 1. 4菌影疫苗的生产：以1:100比例将小摇菌液接种200mL含Amp+抗性的新鲜 TSB培养基中，混匀，取适量菌液测摇菌培养前的0D_，然后28°C振摇培养，每隔Ih测0D_， 待0D_为0. 6时，42°C升温诱导。42°C升温后，仍然每隔Ih测OD _，并取适量菌液做好时 间标记保存，直至〇D_值不再下降，然后按9:1的比例加入10 y g/mL的聚赖氨酸在37°C条 件下继续作用24h。然后取菌液100 y L涂布平板，37°C培养16-20h，观察有无细菌生长。 将无菌检查合格菌影根据〇D_值调整浓度，使菌影含量达到5 X 10 ltlCf y /mL，干燥菌体按 I: I (w/v)的比例加入到按常规方法配制的浓度为6mg/mL的聚肌胞溶液中，搅拌成菌泥初 步溶胀6h，使聚肌胞包埋进入菌影内。壳寡糖配制成2% (w/v)的水溶液，将上述经过溶胀 的菌泥按2:8的比例加入，充分搅拌形成均一的混合物，分装于西林瓶，冷冻干燥，即得到 鸭疫里默氏菌菌影壳寡糖佐剂疫苗。
[0019] 实施实例二疫苗免疫保护试验 为了验证本发明制备的菌影疫苗对鸭的临床保护效果，选择樱桃谷商品肉鸭作为实验 动物，将菌影疫苗分别通过加入不同的佐剂，以不同的免疫途径进行接种，同时进行传统甲 醛灭活方法制备的同源株油佐剂苗的对照试验。通过抗体水平检测和攻毒保护率的对比试 验评价其免疫保护效果。
[0020] 1 ?材料与方法 I. 1试验材料 菌影+壳聚糖佐剂：按实施实例1. 4所述方法制备。
[0021] 菌影+油佐剂：将前述制备的RA2型菌株（WF2)与矿物油佐剂按照1:1比例混合， 使菌数含量达到5 X 101° cf y /mL。
[0022] 甲醛灭活苗+油佐剂：甲醛灭活的RA2型菌株（WF2)与矿物油佐剂按照1:1比例 混合，使菌数含量达到5 X IO9 cf y /mL。
[0023] 实验动物：1日龄樱桃谷商品肉鸭。
[0024] 1. 2试验方法 1. 2. 1试验方案 经检测为RA阴性的健康1日龄樱桃谷商品肉鸭50羽，饲养至5日龄，随机分为5组分 别进行免疫。免疫后2周进行同型RA(WFl)腿部肌肉攻毒并观察一周，攻毒剂量根据预试 验结果确定。分组免疫及攻毒情况见表1。
[0025] 表1疫苗免疫保护效果
1. 2.2抗体水平检测 将2型RA超声裂解上清作为包被抗原包被酶标板，检测每周采血分离的血清抗体的消 长规律。
[0026] 2?试验结果 2. 1攻毒试验结果 攻毒结果显示：在攻毒后48h，未免疫攻毒组开始出现死亡，发病鸭死亡前均有神经症 状，死后呈角弓反张姿势，剖检可见肝脾肿大，脑膜充血，并能从上述组织中分离到攻毒菌 株。在一周观察期内，未免疫攻毒组10只鸭有8只发病死亡，剩下2只鸭生长缓慢；甲醛 灭活苗免疫组有2只鸭出现扭颈的神经症状但未死亡；通过饮水免疫途径的菌影疫苗组出 现1只鸭发病但未死亡，随后的饲养过程中形成僵鸭；而注射途径的菌影疫苗免疫组均未 出现发病死亡的情况；未免疫未攻毒组鸭均健康存活。表明制备的RA2型菌影疫苗不论通 过注射还是饮水途径对易感鸭均具有良好的保护效果。
[0027] 2. 2抗体消长规律 疫苗免疫后4周内，抗体水平持续上升，4周达到高峰，到免疫后5周仍维持较高的水 平。其中菌影+油佐剂免疫组与甲醛灭活苗+油佐剂免疫组诱导机体产生的抗体水平相 当。而菌影+壳聚糖佐剂免疫组在每个阶段的抗体水平均低于注射免疫组的抗体水平（图 1)，宄其原因，可能是饮水免疫途径产生的抗体主要是黏膜抗体，而采用ELISA方法检测的 主要是循环抗体。但从免疫后2周的攻毒结果来看，饮水免疫途径提供的保护效果与注射 途径并无显著差异。
【附图说明】
[0028] 说明书附图1显示了鸭疫里默氏菌灭活苗及菌影疫苗不同免疫途径在免疫樱桃 谷商品肉鸭后5周内的抗体动态变化。
【主权项】
1. 一种制备鸭疫里默氏菌菌影疫苗的方法，其特征在于：利用噬菌体PhiX174的E基 因（简称E)与葡萄球菌核酸酶A基因（简称SN)构建温控双裂解基因pBV-E-SN，将其电转化 鸭疫里默氏菌原生质体，筛选得到阳性克隆。2. 根据权利要求1所述的制备鸭疫里默氏菌菌影疫苗的方法，其特征在于：筛选得到 的阳性菌落经28°C扩增培养，然后在42°C升温诱导双裂解基因的表达，最后加入聚赖氨酸 继续作用以充分裂解活菌，然后离心分离菌体并进行活菌检测。3. 根据权利要求2所述的制备鸭疫里默氏菌菌影疫苗的方法，其特征在于：将无菌检 查合格菌影调整浓度，使菌影含量达到5 X 101° cf y /mL。4. 干燥菌体按1:1比例加入到按常规方法配制的浓度为6mg/mL的聚肌胞溶液中，搅拌 成菌泥初步溶胀6h，使聚肌胞包埋进入菌影内。5. 壳寡糖配制成2%的水溶液，将上述经过溶胀的菌泥按2:8的比例加入，搅拌使其形 成均一混合物，分装于西林瓶，冷冻干燥，即得到鸭疫里默氏菌菌影壳寡糖佐剂疫苗。6. 根据权利要求1-3任一项所述的制备鸭疫里默氏菌菌影疫苗的方法，其特征在于： 该疫苗通过饮水免疫动物。7. 根据权利要求1-6所述的制备鸭疫里默氏菌菌影疫苗的方法，其特征在于：所述的 动物为商品蛋鸭、商品肉鸭、种鸭、鹅以及火鸡。
【专利摘要】本发明的目的在于提供了一种装载具有干扰素诱导活性的聚肌胞苷酸，并加入壳寡糖作为佐剂的鸭疫里默氏菌菌影疫苗。该方案首先构建温控表达载体，电转化入鸭疫里默氏菌原生质体，筛选阳性克隆后28℃增菌培养，然后42℃诱导裂解基因的表达，待OD600不再降低时，加入聚赖氨酸继续作用以充分裂解活菌，然后离心分离菌体。将干燥菌体与6mg/mL的聚肌胞溶液等比例混合，使聚肌胞包埋进入菌影内，然后加入2%壳寡糖水溶液搅拌形成均一的混合物，分装于西林瓶，冷冻干燥，即得到鸭疫里默氏菌新型菌影疫苗。本发明所制备的菌影疫苗经饮水免疫，既可以刺激呼吸道和消化道黏膜的局部免疫，也可以激发体液免疫，对机体的保护效果与注射免疫无明显差异。
【IPC分类】C12N1/21, A61P31/04, A61K39/02, C12N15/74, A61K39/39
【公开号】CN104971346
【申请号】CN201510238788
【发明人】刘文华, 刘宗柱, 任慧英, 王晓雷, 张灿
【申请人】青岛农业大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年5月13日