mHI/SmaI 阳化0] DkR:TTGGGACTAGTCCCAATGCTTCGTTTCG；SpeI
[0051] 4,替换启动子和信号肤突变盒的获得
[0052] PCR产物LDC-up用BamHI酶切、Smal+BamHI酶切P化-pelBs，胶回收 pkpelBs(1.481A)片段；连接转化大肠杆菌获得质粒pLDC::pkpelBs，用EcoRI酶切 释放2. 7化+2. 36化片段；在Smal位点克隆入庆大霉素抗性基因difGm盒，获得质粒 pLDC::pL-pelBs-Gm〇
[0053] 5,IdcC基因启动子和信号肤同源重组替换
[0054] 用EcoRI酶切释放 2. 7化+3. 36化片段；胶回收pLDC: :pL-pelBs-Gm/EcoRI的 3. 36化片段（用引物Idc-upl和ldc-up2进行PCR制备3. 36化片段，Dpnl酶切，纯化后电 转化），电转化已经含有地D46的B0013-070菌株中。获得IdcC基因启动子替换为pL的重 组菌41#菌株。 阳化5] 6,游离质粒中IdcC基因启动子和信号肤的替换
[0056] Smal和BamHI双酶切pPkpelBs，胶分离pkpelBs片段，与W祀T20b-ldcC 为模板用引物Ec-R1C3(SEQIDN0:9)和Ec-R1C4(SEQID^:10)进行反向？〇?扩增 并用限制性内切酶，如Bglll进行酶切获得IdcC基因产物连接，从而获得重组质粒 pT-crs857-pK-pL-pelBs-ldcC简称，pT-ldcC，其物理图谱如图2所示，该重组质粒包含溫控 型启动子，信号肤和IdcC完整基因，具备溫控分泌表达IdcC的功能。将重组质粒pT-ldcC 电转化41#菌株，获得重组菌种42#(pT-ldcC)，该菌种专利保藏号为：CGMCCNo. 10240。
[0057] Ec-RlCS：TCCTGGCCACGGGTGCGCATGAT
[0058] EC-R1C4：GGAAGATCTGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGC；BglII
[0059] 实施例2 :菌种42#(pT-ldcC)中Pk-Pl启动子活性的确定
[0060] 专利菌株42# (pT-ldcC)和出发菌株BOO13-070在25~36 °C和37~50 °C进行培 养2~lOh，其培养基为（g/L):酵母膏15,蛋白腺0. 5,无水MgS〇4〇. 25,葡萄糖5。并测定它 们的细胞破碎液赖氨酸脱簇酶（LDC)比酶活，典型的结果如图3所示。其中细胞破碎液的制 备过程如下，30血发酵液于50血离屯、管中，600化pm离屯、8min;弃去上清，加入10血d地2〇， 縱满震荡混匀，补加(1地2〇至30血，600化pm离屯、8min;弃去上清，加入10血PBS，縱满震荡 混匀，补加PBS至30mL，6000巧m离屯、8min。重复洗涂细胞1次。加入lOmLPBS重悬菌体， 超声破碎。（超声破碎条件：超声3s，间隙2s，溫度25°C，破碎时间30min，功率40% ) ;4°C， 8000巧m离屯、15min，除去细胞碎片。 阳06U 菌种42#在30°C仅产生极低量的LDC活性。在42°C培养，菌种42#(pT-ldcC)的 LDC活性是出发菌株42#的20倍，可W满足戊二胺快速形成的需要。菌种42#(pT-ldcC)在 42°C培养的LDC比酶活值标定为100%，与此相比，该菌种在30°C生长时LDC酶活显著降 低。说明通过溫度的变化来控制菌种42#(pT-ldcC)的Pu-Pl启动子有效地控制了IdcC基 因的表达。
[0062] 实施例3菌种42# (pT-ldcC)细胞活性及赖氨酸脱簇酶的分泌表达过程鉴定
[0063] 专利菌株42# (pT-ldcC)和出发菌株BOO13-070在25~36 °C和37~50 °C进行培 养2~lOh，其培养基为（g/L):酵母膏0~20,蛋白腺0~20,无水MgS〇4〇~10,葡萄糖 5。并通过添加乳糖，IPTG等加强赖氨酸脱簇酶的表达过程。发酵液6000巧m离屯、8min取 上清直接测定酶活作为发酵液中的酶活；离屯、收集的细胞经培养基重悬为起始体积后测定 的酶活作为细胞周质空间的酶活；细胞破碎液测定的酶活作为细胞周质空间和胞内总的酶 活。典型测定结果如图4所示。
[0064] 菌种42# (pT-ldcC)培养并诱导产酶后细胞破碎液的LDC比酶活值标定为100 %。 发酵液中酶活极低，细胞周质空间酶活接近细胞破碎液的酶活。可见信号肤有效的将赖氨 酸脱簇酶表达至细胞的周质空间。
[0065] 实施例4化发酵罐中菌体培养诱导产酶及转化赖氨酸形成戊二胺
[0066] 菌种42# (pT-ldcC)在化发酵罐中进行赖氨酸脱簇形成戊二胺来检验溫度调控的 LDC表达在可控生产条件下的效果。菌种42#(pT-ldcC)在25~36°C进行好氧培养至ODe。。 值约为15~40,将发酵罐溫度设定为37~50°C继续好氧培养0~120min，再将通气量设为 0~0. 2vvm进行限氧发酵，限氧阶段发酵溫度为37~50°C，赖氨酸添加量为166~176g/ L。其发酵培养基为（g/L):憐酸氨二锭0~25,憐酸二氨钟0~5,憐酸氨二钢，0~25,氯 化钢 0 ~5,MgS〇4〇 ~0. 5,化S〇4〇 ~1，化CI3O~1，C0CI2O~1，CuClzO~1，C0CI2O~1， NazMcAO~1，H3BO3O~1，MnClzO~1，硫胺素0~1，IPTG0~5,乳糖0~10,葡萄糖0~ 50,抑6. 0~7. 5。戊二胺高效制备流程图如图5所示。戊二胺HPLC检测结果如图6所 示。发酵过程中赖氨酸、戊二胺、赖氨酸脱簇酶酶活和菌体浓度如图7所示。
[0067] 菌种42#(pT-ldcC)发酵罐发酵结果表明在好氧阶段成功将葡萄糖用于菌体量 的积累，转化阶段快速将赖氨酸转化为戊二胺。最终发酵液中，戊二胺产量高达106. 5~ 116. 8g/L。赖氨酸转化率达到了理论转化率的91 %~97 %。
[0068] 实施例5-一菌种10吨发酵罐中5批次发酵转化制备戊二胺
[0069] 将实施例4中的发酵工艺放大至10吨规模。W满足葡萄糖和赖氨酸的连续补加为 参考指标对发酵罐和流加罐进行选择，并按照工厂里的常规操作完成运行前发酵罐的准备 工作。主发酵罐一个，葡萄糖补料罐一个，赖氨酸补料罐一个和种子罐一个。配置70%葡萄 糖，加热溶解后，灭菌备用。浓缩后赖氨酸提取溶液，灭菌后，揽拌备用。配置培养基，并灭 菌，然后进行接种，开始发酵，25~36°C，通风180~34化A揽拌0~60化/min。1化后进 入诱导产酶阶段，发酵溫度提高为37~50°C。每隔2个小时测定葡萄糖含量，1~5%初糖 耗尽，停止通风，揽拌速度降至0~18化/min。进入转化制备戊二胺阶段，陶瓷膜浓缩上述 高活性细胞，并添加8吨赖氨酸终浓度为17%的发酵料液，转化溫度为37~50°C。化后， 赖氨酸消耗至~0.6g/LW下后结束转化过程，进行产品的后提取和晶体制备。单批转化结 束，陶瓷膜过滤回收菌体，并重新投料进行下批次的转化过程。连续完成5批转化过程。发 酵过程中赖氨酸、戊二胺、赖氨酸脱簇酶酶活和菌体浓度如图8所示。
[0070] 表1 :五批次10吨罐连续转化生产结果
[0071]
[0072] 综上所述，本发明通过基因工程技术对出发菌染色体上的赖氨酸脱簇酶编码基因 的表达进行简易条件下的动态调控，从而实现了重组菌从催化赖氨酸高效生产戊二胺的简 洁制备工艺。本发明技术经过简单修改后，同样可W用于其它工业上重要的微生物代谢产 物，但不限于，如k乳酸、乙酸、丙酬酸、下二酸、苹果酸等多种有机酸；脯氨酸、丙氨酸、赖 氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、精氨酸等多种氨基酸；硫胺素、维生素Bi2等多种微生物；或，乙醇、丙 醇等短链醇的菌种构建、发酵生产和新工艺技术的建立与应用。
【主权项】
1. 一种可高效生产戊二胺的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌其赖氨酸脱羧 酶启动子ldcCp被替换为环境/营养因素控制型启动子的同时表达信号肽。2. 如权利要求1所述的一种可高效生产戊二胺的基因工程菌，其特征在于，出发菌株 为大肠杆菌K12或DH5α或W3110或BL21或MG1655。3. 如权利要求1所述的一种可高效生产戊二胺的基因工程菌，其特征在于，所述环境/ 营养因素控制型启动子是ΡΗ、温度、溶氧、乳糖、木糖、阿拉伯糖控制型启动子。4. 如权利要求1或3所述的一种可高效生产戊二胺的基因工程菌，其特征在于，所述环 境/营养因素控制型启动子是Ρκ_Ρ?启动子，核苷酸序列如序列表中SEQIDNO: 1所示。5. 如权利要求1所述的一种可高效生产戊二胺的基因工程菌，其特征在于，所述信号 肽由peIBs基因编码，核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示。6. 如权利要求1所述的一种可高效生产戊二胺的基因工程菌，其特征在于，所述基因 工程菌为大肠埃希氏菌（Escherichiacoli)42#，保藏编号CGMCCNo. 10240。7. -种利用权利要求1所述基因工程菌生产戊二胺的方法，其特征在于，在发酵初期 的6~12h内，培养温度控制在25~36°C，进行菌体的快速生长；在余下的发酵阶段温度 控制在37~50°C，诱导产酶1~5h，转化生产戊二胺2~8h。8. 如权利要求7所述的一种生产戊二胺的方法，其特征在于，发酵过程中使用的培养 基为全合成培养基。
【专利摘要】本发明提供一种戊二胺生产菌株及其高效生产戊二胺的工艺。所述菌株在赖氨酸脱羧酶启动子ldcCp被替换为环境/营养因素控制型启动子的同时表达信号肽，其催化合成戊二胺的酶的活力得到极大提高并可通过环境温度进行调节，最终表达的酶介于细胞内膜与细胞壁之间，而不释放的发酵体系中，可达到戊二胺高效转化的目的和效果。实现在25～50℃的条件下，分别经过发酵培养菌体，变温高效产酶和目标产物快速转化三个阶段，产戊二胺水平达到106-116.8g/L，赖氨酸转化率达到了理论转化率的91％～97％。CGMCC No.1024020141224
【IPC分类】C12N1/21, C12P13/00, C12R1/19
【公开号】CN105368766
【申请号】CN201510767145
【发明人】田康明, 路福平, 王正祥
【申请人】天津科技大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年11月11日