拮抗抑制程序性死亡受体pd-1与其配体结合的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系与用图
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术-单克隆抗体领域。本发明涉及一种拮抗抑制ro-1(programmed death-1)蛋白与其配体结合的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系与用途。
【背景技术】
[0002]长期以来，生物医学界一直认为肿瘤的发生发展与机体内的免疫功能状态息息相关。体内免疫功能在正常状态下发挥着监控变异的肿瘤细胞与抑制肿瘤发生发展的作用。但当体内免疫功能状态出现低下或功能受到抑制时，肿瘤细胞的变异与增长则会加快，严重时更危急生命。因此以提高免疫功能为目的的免疫疗法(Immunotherapy)已成为当今国际肿瘤临床治疗中的一大目标与手段(见综述:Topalian SL等:Cancer immunotherapycomes of age.JC02011, 29:4828-4836;Pardoll D 和 Drake C:Immunotherapy earns itsspot in the ranks of cancer therapy, J Exp Med2012, 209:201_209)。免疫疗法的近期突破与其广泛应用则得益于免疫学基础研究进展及以杂交瘤/单克隆抗体等为代表的现代生物技术的发展。
[0003]现代免疫学研究表明由胸腺发育而来的T淋巴细胞在识别与杀灭肿瘤细胞中起着非常关键的作用。T淋巴细胞在功能上大致可分为两大类:即以调控免疫功能为主的辅助T细胞(T helper cells)和直接参与识别靶抗原与杀伤靶细胞的细胞毒性T细胞(cytotoxic T cells, CTL)0体内这两类T细胞的活化与增生一般都需要两个信号通路的协同作用:其中第I信号通路是通过T细胞上的可特异识别抗原的受体蛋白(T-cellreceptor, TcR)与表达在肿瘤等祀细胞或抗原提呈细胞(antigen-presenting cells, APC)上相应的抗原多肽-MHC(major histocompatibility complex)复合物的结合而传导,该信号通路为抗原特异性的；第2信号通路是通过T细胞上的协同刺激(co-stimulat1n)或协同抑制(co-1nhibit1n)因子与表达在肿瘤等祀细胞或抗原提呈细胞上的配体结合而传导，该信号通路为抗原非特异性的。T淋巴细胞只有在第I与第2信号通路都存在的状态下才发生活化与增生。
[0004]在第2信号通路中发挥协同刺激作用(即正向或上调免疫功能)的代表性因子是CD28与其配体B7-1、B7-2 ;而发挥协同抑制作用(即负向或下调免疫功能)的代表性因子则是CTLA-4与其配体B7-1、B7-2,及程序性死亡受体(programmed death-1) PD-1与其配体H)-L1和TO-L2 ;这些协同刺激/协同抑制因子在结构上都很相似，均属于免疫球蛋白超家族成员(见综述:Chen LP:Co-1nhibitory molecules of the B7_CD28family in thecontrol of T cell immunity, Nature Immunol2004, 336-347)。
[0005]理论上，至少可以通过两大不同途径达到提高体内免疫功能的目的:
[0006]途径I是通过提高⑶28等协同刺激因子的表达而直接达到上调免疫功能的效果;
[0007]途径2则是通过降低或阻断CTLA-4或TO-1/PD-L1等协同抑制因子表达，从而去除或降低肿瘤靶细胞带来的免疫抑制，进而间接达到上调免疫功能的效果。
[0008]直接提高⑶28等协同刺激因子的表达尽管可以达到上调免疫功能的效果，但由于2006年在英国进行的一涉及代号为TGN1412的抗CD28单克隆抗体药物的临床I期研究中，6位健康受试者在接受注射该抗体药物的当天即发生了极其严重的不良反应(Suntharalingam G等:Cytokine storm in a phaseltrial of the anti_CD28monoclonalantibody TGN1412。NEJM2006, 355:1018-1028)，因此目前科学界普遍认为激动型抗CD28抗体类药物在临床应用上具有很高的安全风险与不确定性，对其未来开发上市的前景也存在很多担忧。相反的，以降低或阻断CTLA-4或H)-1/PD-L1等协同抑制因子表达与活性的拮抗型单克隆抗体药物，近年来由于其在美国已开展的多个早期临床研究中都表现出明显的抗肿瘤疗效及可接受的安全性，现反而已成为国际肿瘤药物领域的研究与开发热点(见综述:Quezada SA and Peggs KS !Exploiting CTLA-4, PD-1and PD-Llto reactivate thehost immune response against cancer。British Journal of Cancer2013,108:1560 -1565 ；F1emming A.Cancer:PD-1makes waves in anticancer immunotherapy.Nat Rev DrugDiscov.2012;11:601)。
[0009]PD-1基因最早是由日本科学家Tasuku Honjo及其同事在1992年发现与克隆的，其胞外区有 I 个 IgV 样区，与 CTLA-4 有 23% 的同源性(Ishida, Y.，Agata, Y.，Shibahara, K.and Honjo, T.1nduced express1n of PD-1, a novel member of the immunoglobulingene superfamily, upon programmed cell death.EMBO J.1992,11:3887 ;综述见:OkazakiT 和 Honjo T:PD-land PD-1ligands:from discovery to clinical applicat1n.1nternat1nal Immunology2007,19:813_824)。PD-1 主要表达于活化的 T 淋巴细胞、B 淋巴细胞及单核细胞上(Yasutoshi Agata 等 Internat1nl Immunologyl996,8:675)。PD-1的受体或配体已知有两个:分别为PD-Ll (Freeman GJ等，JEM2000，192:1027-1034)，或又称 B7-H1 (Dong H 等，Nature Medicinel999, 5:1365-1369)和 PD-L2 (Latchman Y 等，Nat.1mmunol.2001，2:261-268),或又称 B7-DC (Tseng SY 等，JEM2001，193:839_845)。PD-Ll及TO-L2主要表达在肿瘤等靶细胞或抗原提呈细胞上(Thompson RH等，Cancer Res2006 ；66:3881-3885)。PD-1参与负向调控体内免疫功能的这一重要事实最早是由TasukuHonjo及其同事在研究ro-1基因敲除小鼠中观察到的。他们发现ro-1基因敲除的小鼠在C57BL/6基因背景下,发生狼疮样肾小球肾炎和关节炎(Nishimura H等，Developmentof lupus-like autoimmune diseases by disrupt1n of the PD-1gene encoding anITIM motif-carrying immunoreceptor.1mmunityl999,11:141);而在 Balb/c 基因背景下，则产生高滴度的抗心肌组织抗体并由此引发严重的自身免疫性心肌病(Nishimura, H.等，Autoimmune dilated card1myopathy in PD-lreceptor-deficient mice.Science2001,291:319)。
[0010]正常组织细胞中PD-Ll基因的表达而介导的免疫抑制或免疫耐受，是体内保护其正常组织免于受周围自身淋巴细胞攻击与杀伤的重要机制(Keir M.E.等，Tissueexpress1n of PD-Llmediates peripheral T cell tolerance.J Exp Med2006,203:883-895)。而肿瘤细胞则能够借通过调高I3D-Ll或H)-L2蛋白的表达及与其表达在淋巴细胞上的ro-1受体的相互作用而传导出抑制信号，使体内免疫出现抑制或耐受而逃避淋巴细胞的识别与攻击(Dong H等,Nature Medicine2002,8:793-800 ；Azuma T 等,Blood2008，Ill:3635-3643);而如给予PD-1或PD-Ll抗体以阻断PD-1/PD-L1之间相互作用，则可打破或消除因肿瘤导致的免疫抑制或免疫耐受，恢复体内T淋巴细胞识别与攻击肿瘤靶细胞的能力，进而达到抗肿瘤生长与转移的良好效果(Iwai Y等，PNAS2002，99:1229 ；Hirano F等，Cancer Res 2005，65:1089_1096)。基于这些前期基础研究与临床前动物实验结果，近年来国际上已有多家制药企业如美国Bristol-Myers Squibb (BMS)/Medarex,Merck公司及Roche/Genentech等公司正在加紧研制各种以阻断H)_l与其配体结合为目的的拮抗类抗体新药，并为此申请了相