人乳腺癌细胞特异性结合的多肽及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及生物技术领域，以改良的肽库消减筛选法筛选对人乳腺癌细胞(MCF-7 细胞)特异性结合的多肽(序列），对人乳腺癌细胞具有良好的结合特异性和敏感性。 技术背景
[0002] 乳腺癌（breast cancer)是女性排名第一的恶性肿瘤，占女性新发恶性肿瘤的 30%，严重危害着妇女健康。据国际癌症研究中心统计，全球每年约有46万女性因乳腺癌死 亡，约占所有女性恶性肿瘤死亡的13.7%。近年来在我国特别是在一些大城市及沿海经济 发展较快的地区，乳腺癌的发病率呈逐年上升的趋势。
[0003] 目前，针对乳腺癌的主要治疗方法是影像检查、肿瘤标志物检测以及穿刺活检等， 但是这些方法也可能会引起癌细胞扩散，产生创伤等问题。目前已有的一些肿瘤标志物大 部分是乳腺癌血清肿瘤标志物，但是这些标志物大都特异性和灵敏度较低，治疗效果不明 显。所以，尽快寻找一些新的乳腺肿瘤标志物也是当前研究的热点，而其中的关键元件是对 癌细胞、癌组织具有特异靶向结合活性的分子片段的获得。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于，提供以改良的肽库消减筛选由噬菌体12肽库筛选得到对乳腺 癌细胞特异性结合的多肽序列，并提供鉴定该多肽与乳腺癌细胞特异性亲和力的实验结 果，证明该多肽在乳腺癌的早期分子影像学诊断、靶向化疗、与其它材料偶联而进行的乳腺 癌靶向治疗等方面具有的巨大应用价值。
[0005] 为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
[0006] 乳腺癌MCF-7细胞特异性结合的多肽，其氨基酸序列为:HPLGPTWRiroT。该多肽能 够特异性结合MCF-7细胞，而不识别人胚肾HEK293细胞（即正常细胞），并对其他肿瘤细胞表 现出极低的亲和力或者无亲和力。
[0007] 上述乳腺癌MCF-7细胞特异性结合的多肽的筛选方法为以体外培养的MCF-7细胞 系为靶细胞，以人胚肾HEK293细胞系为非特异性吸附细胞，对噬菌体随机12肽库进行4轮消 减筛选，随机挑取60个噬菌体克隆，利用ELISA鉴定阳性克隆。对阳性克隆进行DNA测序，分 析其多肽的氨基酸序列组成及基本特征，最后获得拥有共有序列(Consensus sequence)的 强阳性克隆组3个，对它们以细胞免疫荧光法进一步鉴定其特异性和敏感性，确定最佳序 列。
[0008] 各种噬菌体克隆水平、最佳序列合成肽探针水平的实验结果均提示序列 HPLGPTWRIPDT特异性、敏感性最佳，这为该多肽未来用于乳腺癌的早期分子影像学诊断、靶 向化疗、与其它材料偶联而进行的乳腺癌靶向治疗等提供了实验依据。
[0009] 本发明以乳腺癌MCF-7细胞为靶细胞，对噬菌体12肽库以我们改良的消减筛选法 进行了 4轮消减筛选，最后获得3条共同多肽序列，分别为HPLGPTWRIPDT、NSQARRHSSIDT、 ANIDSSHHGNQP。通过一系列鉴定分析实验发现其中的HPLGPTWRIPDT对于乳腺癌的靶向性最 强，提示了其用于乳腺癌诊断、靶向治疗方面的价值。
[0010]在乳腺癌检测方面，利用同位素或者荧光标记的多肽可以特异性结合乳腺癌细 胞/组织，适用于肿瘤成像和分子影像诊断，对于乳腺癌早期检测、癌病灶定位和疗效评价 都具有重要意义;在乳腺癌靶向治疗方面，有望利用其特异性高、分子量小、穿透力强、亲和 力高的特性来与传统化疗药物(如顺铂、阿霉素等)偶联，达到靶向递送给药的目的，可大大 减小化疗药物的非特异性和毒副作用。
【附图说明】
[0011]图1为本发明多肽的制备路线图；
[0012] 图2为随机十二肽pill融合蛋白的N末端序列；
[0013] 图3为专用密码子表；
[0014] 图4为60个噬菌体克隆与MCF-7细胞亲和力两次ELISA鉴定结果；
[0015]图5为三条共有序列的代表性阳性噬菌体克隆与细胞亲和力的免疫荧光鉴定，其 中:A、C、E分别为:噬菌体克隆Q35、Q3、Q41与细胞MCF-7的亲和力;B、D、F分别为:噬菌体克隆 Q35、Q3、Q41与细胞HEK293的亲和力;G、H分别为:PBS、URPs与细胞MCF-7的亲和力；
[0016] 图6为克隆Q35(HPLGPTWRIPDT)与其它肿瘤细胞亲和力鉴定，其中：A:MCF-7;B: SiHa(宫颈癌细胞）；C:Caco2(结直肠癌细胞）；D:SGC-7901(胃癌细胞）；E:SMMC-7721(肝癌 细胞）；F:Eca-109(食道癌细胞）；
[0017]图7为多肽(HPLGPTWRIPDT)与细胞特异性结合的剂量效应，其中：A、B、C、D、E为多 肽与乳腺癌细胞MCF-7结合;？、6、11、1、1为多肽与人胚肾细胞册1(293结合，两组浓度分别为 1 OuM、15虚、2 OuM、2 5虚、3 OuM;
[0018] 图8为多肽(HPLGPTWRIPDT)与细胞特异性结合的时间效应，其中：A、B、C、D、E为多 肽与乳腺癌细胞MCF-7结合;？、6、11、1、1为多肽与人胚肾细胞册1(293结合，两组孵育时间分 另lj 为 10min、20min、40min、60min、80min;
[0019]图9为多肽(HPLGPTWRIPDT)与乳腺癌细胞的结合部位，其中：A、C:FITC-阳性多肽 与 MCF-7、HEK293细胞;B、D: FI TC-阴性多肽与 MCF-7、HEK293细胞；
[0020]图10为多肽(HPLGPTWRiroT)与其它肿瘤细胞的结合特异性，其中：A:SiHa(宫颈癌 细胞）；B: SKV3 (卵巢癌细胞）；C: Cac〇2 (结直肠癌细胞）；D: SGC-7901 (胃癌细胞）；E: SMMC-7721(肝癌细胞）；F:Eca-109(食道癌细胞）；
[0021]图11为流式细胞仪检测多肽(HPLGPTWRIH)T)的结合特异性，其中:A:乳腺癌MCF-7 细胞;B:HEK293细胞。绿色：FITC-Brca Probe;红色：FITC-Ctrl Probe;黑色：PBS;
[0022] 图12为多肽(HPLGPTWRiroT)竞争抑制：多肽（HPLGPTWRiroT)孵育靶细胞后，再以 噬菌体克隆Q35孵育靶细胞，洗涤后根据噬菌体发出荧光的强弱分析多肽的特异性结合力。 该竞争抑制力与多肽浓度正相关，说明多肽特异性良好。
[0023]以下结合附图和具体实例对本发明作进一步说明。
【具体实施方式】
[0024] 菌体展示技术是1985年由美国Missouri大学的G.P. Smith等创立的一项能够特 异性筛选多肽或蛋白的技术。该技术将目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌 体表面，与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，被展示的多肽或蛋白能够保持相对独立的空间结 构和生物活性。目前，噬菌体展示技术已经被广泛应用于肿瘤标志物的筛选、肿瘤药物的靶 向运输和多肽药物开发等方面的研究。
[0025] 本发明就是利用上述肽库以改良的肽库消减筛选法筛选可以特异敏感的结合于 人乳腺癌细胞的一条多肽序列，并以相关实验证明了该序列对人乳腺癌细胞结合的高度特 异性和敏感性。该多肽具有亲和力高、分子量小、组织穿透性强、免疫原性低、易合成等特 点，将其连接其它效应分子，可以用于乳腺癌的早期分子影像学诊断，形成肿瘤三维成像， 大大提高乳腺癌的早期诊断率，并可对治疗疗效评价;作为乳腺癌化疗药物的导向元件而 用于乳腺癌的靶向化疗，可大大降低药物毒性而提高疗效，使化疗成为对病人确实有益的 治疗方法之一;将多肽与纳米脂质体或纳米药物偶联，可达到更好的靶向治疗效果；用于寻 找肿瘤细胞表面相关配体的研究，为肿瘤治疗提供新的靶点。
[0026] 本发明以人乳腺癌MCF-7细胞为靶细胞，对噬菌体肽库以改良的肽库消减筛选法 进行4轮消减筛选，寻找与乳腺癌细胞MCF-7具有特异性结合力的噬菌体肽序，为进一步研 发乳腺癌早期靶向诊断试剂和高效低毒靶向治疗药物奠定基础，具体技术路线如图1所示。 [0027] 一、材料与方法
[0028] 1.1主要实验材料
[0029] 1.1.1细胞株人乳腺癌细胞株MCF-7,购于美国ATCC(Rockville，USA)，人胚肾细胞 株HEK293，为本实验室保存。
[0030] 1.1.2噬菌体随机十二肽库贮存:与甘油1:1保存在TBS溶液中，1.5 X 1013pfu/ml。 复杂度:~2.7X109个转化子。载体M13KE的外壳基因-96gIII测序引物:5'- HQCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3,。
[0031] 1.1.3宿主菌￡.(：〇11￡1?2738，与甘油1:1保存在-80°(：超低温冰箱中。
[0032] 1.2实验方法
[0033] 1.2.1细胞培养
[0034] 用DMEM完全培养基、37 °C、饱和湿度、5 % C02孵箱。
[0035] 1.2.2宿主菌￡.(：〇11￡1?2738的准备
[0036] E.coli ER2738是NEB公司的Ph.D系列噬菌体肽库的专用菌株。用LB-Tet培养基、 37 °C恒温摇床、300rpm振荡过夜。
[0037] 1.2.3噬菌体随机十二肽库体外快速消减筛选
[0038]以人胚肾细胞HEK293作为阴性吸附细胞预吸附以排除非正常细胞靶向克隆，再以 人乳腺癌细胞M C F - 7和作为靶细胞，对靶向乳腺癌克隆以改良后的消减筛选法 (Subtraction Biopanning)进行淘筛，重复4轮。相对于菌体肽库试剂盒生产商--美国 新英格兰生物实验室公司（New England BioLabs Inc.，NEB)提供的传统经典Biopanning 方法（见试剂盒说明书），在此基础上，改良的消减筛选法每一轮Biopanning的特色如下： (1)每轮第一步增加了以正常细胞对投入噬菌体肽库的预吸附，以尽可能除去非癌细胞靶 向的噬菌体克隆；（2)将传统步骤要求的"扩增"步骤的25ml菌液体积改为3ml。这一改变大 大简化了实验难度和提高了筛选效率；（3)由于第（2)项改变，最后一轮（一般做4轮 Biopanning)可以随机挑选至少60个或更多的菌体克隆。
[0039]最后一轮随机选择60个克隆扩增以后以ELISA法鉴定与靶细胞MCF-7的亲和力。
[0040] 1.2.4阳性噬菌体克隆多肽序列的测定
[0041] 对噬菌体阳性克隆、无关克隆进行测序，根据遗传密码子表格(参见图2、图3)，将 多肽序列翻译成氨基酸序列并获得Consensus序列。
[0042] 1 ? 2 ? 5Consensus序列的结合特异性鉴定
[0043] 以Consensus序列的代表性克隆通过常规细胞免疫荧光法进行结合特异性和敏感 性的鉴定。
[0044] 1.2.6统计学分析
[0045] 利用SPSS 16.0数据处理软件进行数据分析，数据结果用f 土 SD表示，P〈0.01表 示差异极显著，P〈〇. 05表示差异显著，P>0.05说明差异不显著，无统计学意义，组间多重比 较采用Duncan检验处理。
[0046] 二、实验结果
[0047] 2.1阳性克隆的ELISA鉴定和测序
[0048]获得阳性噬菌体克隆36个，其中克隆Q35与MCF-7细胞结合特异性最高，结果如图4 所示。阳性噬菌体克隆有3个共有序列:HPLGPTWRIPDT、NSQARRHSSIDT、ANIDSSHHGNQP。
[0049] 2.2阳性噬菌体克隆的结合特异性
[0050] 结果如图5和图6所示，阳性噬菌体克隆均结合MCF-7细胞而不与HEK293细胞结合， 以克隆Q35(HPLGPTWRIH)T)最佳，说明阳性多肽有很好的靶向性。
[0051 ] 2.3多肽HPLGPTWRIPDT的特异性和敏感性鉴定
[0052] 结果如图7-图12所示。多肽HPLGPTWRIPDT特异结合MCF-7细胞而不与HEK293及其 他细胞结合。
【主权项】
1. 人乳腺癌细胞特异性结合的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列为： HPLGPTWRIPDT。2. 权利要求1所述多肽特异结合人乳腺癌细胞的应用。3. 权利要求1所述多肽用于制备治疗人乳腺癌药物的应用。
【专利摘要】本发明涉及人乳腺癌细胞特异性结合的多肽及其应用，所涉及多肽的氨基酸序列为：HPLGPTWRIPDT。所涉及的应用为本发明的人乳腺癌细胞MCF-7特异性结合的多肽特异结合人乳腺癌的应用。本发明筛选和初步鉴定获得的乳腺癌靶向多肽具有明显的乳腺癌细胞结合特异性，可用于研发乳腺癌早期靶向诊断试剂、高效低毒靶向治疗药物。
【IPC分类】A61P35/00, A61K47/42, C07K7/08
【公开号】CN105713070
【申请号】CN201610085381
【发明人】侯颖春, 肖丽, 高晓杰, 何慧敏, 薛琴琴, 韩娟娟, 达苗苗, 马乐乐, 马妮, 程思楠
【申请人】陕西师范大学