一种胎盘间充质前体干细胞的分离培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种胎盘间充质前体干细胞的分离培养方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]干细胞的培养、扩增与移植，已成为当前再生医学中的热点。利用干细胞能够分化成多种细胞的能力，促进机体损伤和疾病康复过程中受损组织和器官的修复与再生，改善或恢复损伤组织和器官的功能，已经成为生物学、基础医学和临床医学关注的焦点。据报道，全世界每年约有上千万人遭受各种形式的创伤，有数百万人因在疾病康复过程中重要器官发生纤维化而导致功能丧失，有数十万人迫切希望进行各种器官移植。随着细胞生物学以及干细胞技术在组织工程和现代医学中的应用，使得干细胞在血液病、肌萎缩、脑萎缩、糖尿病等难治性性疾病的治疗方面显示出良好的发展前景。目前已被广泛应用于临床试验研究,如移植物抗宿主病(GVHD)、充血性心衰、急性心梗、2型糖尿病、脊髓损伤、软骨和骨损伤、克罗恩病等，而且在肾脏、肌肉和肺的损伤修复中也有初步进展。而寻找合适的干细胞作为种子细胞来源，是再生医学的关键。
[0003]胚胎干细胞是全能干细胞，具有分化成各个组织器官的能力，但是由于其存在的伦理问题以及致瘤性的问题，一直制约着其实际的应用。限制了其作为细胞治疗的种子细胞。影响了其在再生医学领域的应用。成体干细胞具有一定的分化能力，同时避免了胚胎干细胞的问题，在临床应用中具有更实际的应用价值。主要以造血干细胞和间充质干细胞为代表。间充质干细胞是一群来源于中胚层的，具有高度自我更新能力、多向分化潜能的成体干细胞。由于间充质干细胞来源广泛，体外易于操作，造血支持和免疫调节作用明确，因此间充质干细胞治疗具有广阔的前景。间充质干细胞目前已经在皮肤附件再生、心血管疾病治疗等方面呈现出较好的应用前景。但是随着研究的进展，人们逐渐认识到，绝大部分体外培养的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)大部分是间充质祖细胞和成熟间充质细胞。更为重要的是，随着培养时间的延长，细胞三系分化能力逐渐丧失，只具有两系或单系分化能力的细胞比例逐渐增加，大大的限制了他们在组织工程中的应用。
[0004]Mendez-Ferrer等一些研究者在骨边缘或骨实质内血管壁上发现了一种间充质前体干细胞，它表达间充质干细胞的标志，同时还表达神经干细胞，造血干细胞的标志，而经过传统的贴壁培养后，它能够迅速分化成间充质干细胞，而渐渐失去其他干细胞的标志。间充质前体干细胞是一种比成熟间充质干细胞更原始的，介乎于多能干细胞与成体干细胞之间的干细胞。通过实验证明，这种间充质前体干细胞更能支持移植动物体内的造血功能，具有比传统间充质干细胞更原始，具有更强分化功能的细胞。这种间充质前体干细胞不仅具有间充质干细胞的特性，表达常见的间充质干细胞的表面标志，具有分化成骨、软骨、脂肪的功能。还可分化成典型的所有三个胚层的细胞，如成熟的平滑肌细胞，心肌细胞，具有功能的肝细胞和表达神经递质的神经元细胞。这种间充质前体干细胞或源于大血管的外膜和微血管的周细胞。
[0005]胎盘(placenta)是由胎儿的丛密绒毛膜与母体的基蜕膜共同组成的圆盘形结构。胎盘细胞来源于滋养层细胞，与胚胎干细胞一样都是来源于早期的胚胎。含有丰富的血管、毛细血管。因此胎盘有可能是丰富的前体干细来源。一些专利(201010178277.5 ;CN100344757C)申请公开的胎盘间充质干细胞制备方法主要采用组织块法或者酶消化后，在含胎牛血清或或其他血清培养基中贴壁培养，利用细贴壁的属性分离培养胎盘间充质干细胞或者胎盘干细胞，这些方法获得的间充质干细胞，表达间充质干细胞的标志，但大部分其实是相对成熟的间充质祖细胞，具有间充质干细胞的局限性例如低增殖性，有限的生命，在体外扩增中逐渐丧失其干细胞的特性等特点，不表达巢蛋白，而且CD271阳性率也下降，大大的影响了他们在组织工程中的效果和应用范围。
【发明内容】
[0006]针对上述问题，本发明的目的在于提供了一种胎盘间充质前体干细胞的分离培养方法，其获得的间充质前体干细胞表达间充质干细胞的标志，还表达神经干细胞的标志巢蛋白(Nestin)和CD271 ;自我更新能力、分化能力更强，具有更广泛的应用前景。
[0007]本发明的技术方案是这样实现的:一种胎盘间充质前体干细胞的分离培养方法，包括胎盘的组织分离、组合酶消化、不连续梯度密度分离、免疫磁珠分选、间充质前体干细胞的悬浮培养；其特征在于具体步骤如下:
1)胎盘组织分离:无菌收集胎盘，常规方法，用有齿镊和手术刀分离绒毛膜和羊膜，PBS冲洗绒毛膜及血管，并剪成2mmX2mm碎片；
2)组合酶消化:胶原酶I和组织分散酶II，37°C震荡消化1飞小时，再用胰蛋白酶消化0.5?I小时；用2飞LPBS或a MEM稀释，并用200目滤网过滤组织残渣；
3)不连续密度梯度分离:用10%?50%Percoll液，密度梯度2500rpm离心20min，吸取20%-30%Percoll之间的单个细胞，PBS离心洗涤2次；
4)加入神经营养因子受体鼠抗人⑶271单克隆抗体，孵育30min，PBS洗涤2次，1500rpm离心5min ;加入磁珠标记二抗抗鼠IgGl,2_8°C孵育15min,PBS洗漆2次，1500rpm离心5min ;通过磁场分选柱进行分选,收集洗脱被标记的细胞；
5)胎盘前体干细胞培养:用神经干细胞基础培养基重悬分离的细胞，加入胎盘间充质前体干细胞培养基即2%B27，bFGF 10ng/ml, EGF 10ng/ml，肝素20ng/ml，采用超低粘附细胞培养皿培养。37°C，5%C02，饱和湿度培养；每2-3天添加新鲜培养基；10-14天可见胎盘前体干细胞呈拟胚体样球形生长。
[0008]所述的组合酶包括胶原酶0.1_1%、组织分散酶0.1-1%和0.05-0.25%胰蛋白酶。
[0009]所述的不连续密度梯度包括10%，20%, 30%, 50%的Percoll分离液。
[0010]所述的胎盘间充质前体干细胞培养基为神经干细胞基础培养基，添加B272-10% (v/v), bFGF 10-100ng/ml, EGF 10-100 ng/ml,肝素 20_100ng/ml，不含胎牛血清和其他血清。
[0011]所述的胎盘间充质前体干细胞表达间充质干细胞的标志⑶105，⑶73，⑶90，⑶44，同时表达神经干细胞标志⑶271和巢蛋白NESTIN。
[0012]本发明的积极效果是其获得的干细胞是间充质前体干细胞，比传统方法获得的间充质干细胞更原始，增殖和分化能力更强；为解决传统间充质干细胞有限增殖能力和分化能力提供了解决方法；获得的间充质前体干细胞不仅能表达间充质干细胞标志，还表达神经干细胞标志，为干细胞在神经系统疾病中的应用提供了良好的种子细胞来源；并且所用的培养基不含胎牛血清，更适用于临床应用。
【附图说明】
[0013]图1间充质前体干细胞球。间充质前体干细胞悬浮培养，与胚胎干细胞培养表型相似，呈拟胚体样生长。
[0014]图2免疫荧光显示间充质前体干细胞球表达神经干细胞标志(巢蛋白)阳性(绿色荧光)。
[0015]图3流式检查显示间充质前体干细胞表达所有间充质干细胞的表面标志物，CD73，CD90, CD105, CD29, CD44 阳性。
[0016]图4流式结果显示间充质前体干细胞表达神经营养因子受体⑶271阳性。而传统培养方法获得的间充质干细胞不表达CD271。
[0017]图5间充质前体干细胞经贴壁培养后，分化成间充质干细胞，形态为长梭形、鱼群状生长。
【具体实施方式】
[0018]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不受限于下述实施例。
[0019]实施例1:胎盘间充质前体干细胞的分离培养方法
1.无菌收集足月产婴儿胎盘，用含庆大霉素(100U/ml)、肝素(50U/ml)的磷酸盐缓冲液2L进行冲洗血块；
2.分离绒毛膜和羊膜，用组织镊机械去除蜕膜组织，PBS冲洗绒毛膜及血管，并剪成碎片(2mmX 2mm)；
3.0.1%胶原酶I和组织分散酶II经37°C震荡消化I小时；
4.再用0.05%胰蛋白酶消化0.5小时；
5.用大量磷酸盐缓冲液稀释，并用200目滤网过滤组织残洛。2000rpm离心1min,磷酸盐缓冲液重悬；
6.不连续密度梯度离心:依次加50%，30%,20%, 10%的Percoll液，不连续密度梯度离心2500rpm离心20min，吸取20%_30%Percoll之间的单个细胞。PBS离心洗涤2次；
7.免疫磁珠分选:加入鼠抗人⑶271单克隆抗体，孵育30min，PBS洗涤2次，1500rpm离心5min ；
8.加入磁