序列如SEQ ID NO: 3所示。
[0024] 优选地，所述组氨酸化s6标签的碱基序列如SEQ ID NO:4所示。
[002引优选地，所述P2A的碱基序列如SEQ ID NO: 5所示。
[0026] 优选地，所述TAg基因选之组织特异性分化抗原基因、致癌病毒表达的肿瘤抗原 基因、突变基因或癌基因、异常表达的细胞蛋白基因和胚胎抗原基因中的一种。
[0027] 进一步优选地，所述TAg基因选之组织特异性分化抗原基因。
[0028] 进一步优选地，所述TAg基因为CD20基因。
[0029] 进一步优选地，所述TAg的碱基序列如SEQ ID NO:6所示。
[0030] 优选地，所述终止密码子的碱基序列为TTA。
[0031] 第四方面，本发明提供了如第一方面所述的肿瘤细胞特异性的TSPT细胞的制备 方法、如第二方面所述的基因修饰肿瘤细胞的制备方法、如第H方面所述的编码GeAb. TAg 基因载体的构建方法。
[0032] 优选地，本发明提供的如第一方面所述TSPT细胞、如第二方面所述的基因修饰肿 瘤细胞、如第H方面所述编码GeAb. TAg基因载体用于制备预防或治疗癌症的药物中的应 用。
[0033] 进一步优选地，本发明提供的如第一方面所述TSPT细胞、如第二方面所述的基因 修饰肿瘤细胞、如第H方面所述编码GeAb. TAg基因载体用于制备预防或治疗肝癌的药物 中的应用。
[0034] 本发明提供的方法具有如下有益效果： (1)本发明制备的TSPT细胞具有明显的肿瘤细胞特异性，而且对肿瘤细胞的杀伤效率 明显高于目前经典方法(抗CD3和抗CD28抗体联合rhIL-2诱导PBMC)培养的效应T细胞的 杀伤效率。从目前数据看，经过化pG2-BsAb. TAg诱导培养的TSPT细胞对肝癌细胞杀伤效率 较经典方法提高了 3. 78倍，即杀伤效率从原来的12. 91%提到到了 61. 72% ;而肝癌特异性 TSPT细胞对K562细胞的杀伤效率与经典方法相比没有明显的提高，即经典方法为12. 18%， 肝癌细胞特异性TSPT细胞的杀伤效率为13. 47%。
[00巧](2)本发明提供的基因修饰肿瘤细胞，既能够表达膜结合型TAg,同时又能够分泌 性表达BsAb。在基因修饰肿瘤细胞膜表面表达TAg的有益效果是：目前大部分肿瘤细胞的 肿瘤抗原并不明确或者表达量低，那么通过此方法则解决了对肿瘤细胞祀向识别的难题， 从而使大部分肿瘤细胞甚至全部肿瘤均能够通过该方法进行高水平表达特异性祀抗原，成 为双祀向特异性抗体识别的祀标。基因修饰肿瘤细胞进行分泌性表达BsAb的有益效果是： 避免了体外生产、纯化、包装、运输和保存等环节，从而极大的降低了生产成本。同时将二者 组合运用，如CD20和CD20 X CD3的组合，更容易形成通用技术，应用于大部分甚至全部肿瘤 类型的预防或治疗癌症的药物中的应用。
[0036] (3)本发明提供的GeAb. TAg基因载体，避免了在两个载体进行转染和表达，该样 极大的优化了生产工艺，使其更加简单。
[0037] (4)本发明提供的肿瘤细胞特异性TSPT细胞可单独应用，或与化疗、放疗、手术、 介入治疗、生物治疗、免疫治疗中的一种或几种联合应用于预防或治疗癌症的药物中的应 用。
【附图说明】
[003引图1为本发明实施例1提供的PUC57载体的物理图谱。
[0039] 图2为本发明实施例1构建的含有CD20XCD3基因的重组质粒pU巧7. BsAb的物 理图谱。
[0040] 图3为本发明实施例1提供的pC畑载体的物理图谱。
[0041] 图4为本发明实施例1构建的含有CD20XCD3. CD20基因的重组慢病毒表达载体 pCDH-BsAb. TAg的物理图谱。
[0042] 图5为本发明实施例2提供的化pG2-BsAb. TAg经过筛选膜结合型抗原CD20表达 情况流式细胞仪分析图。该图显示，经过筛选的化pG2-BsAb. TAg的阳性率高达99. 8% ;因 此，从膜结合型CD20的表达情况看，本发明提供的技术方案是成功的。
[0043] 图6为本发明实施例2提供的CD20XCD3分别与Raji细胞和化rkat细胞结合的 流式细胞仪分析图。该图中箭头(一)所指的曲线为染色时经过CD20XCD3处理的实验组的 曲线，因此，从图中结果显示，CD20XCD3能够分别于CD20阳性的Raji细胞和CD3阳性的 化rkat细胞结合；因此，从分泌型CD20XCD3的表达情况看，本发明提供的技术方案是成功 的。结合图5,本发明提供的基因修饰肿瘤细胞制备方法和编码GeAb. TAg基因载体构建方 法均是成功的。
[0044] 图7为本发明实施例4提供的PBMC诱导培养过程中CD3阳性细胞和CD20阳性细 胞在总细胞的比例随着培养时间变化而变化的趋势图（n=8)。该图显示，在混合细胞培养 的过程中，基因修饰肿瘤细胞的比例急剧下降，第6天降到5%左右，9天后检测不到基因修 饰肿瘤细胞；同时，CD3阳性细胞的比例在培养的过程中快速升高。6天后能够达到96% W 上。从安全性角度考虑，本发明能够完全清除培养体系中的基因修饰肿瘤，因此本发明制备 的TSPT细胞是安全的。
[0045] 图8为本发明实施例4提供的PBMC诱导培养过程中CD3阳性细胞和CD20阳性细 胞随着培养时间变化细胞绝对数变化趋势图（n=8)。该图显示，在混合细胞培养的过程中， 基因修饰肿瘤细胞的绝对数在前3天是增加的，3天后逐渐降低，9天后检测不到基因修饰 肿瘤细胞；同时，CD3阳性细胞的绝对数在培养的过程中一直持续升高。因此，无论从安全 的角度还是从对T细胞扩增效率的角度考虑，本发明提供的方法都是成功的。
[0046] 图9为本发明实施例5提供的培养第14天的TSPT细胞免疫表型分析图（n=8)。该 图中pre表示新鲜分离的PBMC组，post表示培养第14天的TSPT细胞组，因此图中显示，该 方法能够显著扩增CD3阳性的T细胞；同时，优势扩增CD8阳性CTL细胞。因此，本发明制 备的TSPT细胞是一种W CTL细胞为主的一群异质性细胞，从而有利于高效杀伤肿瘤细胞。
[0047] 图10为本发明实施例6提供的培养第14天的TSPT细胞特异性肿瘤细胞杀伤效 应分析图（n=8)。该图CD3-28表示经典方法培养的效应T细胞，因此图中结果显示，经过 HepG2-BsAb. TAg诱导培养的TSPT细胞对肝癌细胞杀伤效率较经典方法有显著提高，并显 示出很好的特异性。因此，TSPT细胞具有精准、高效杀伤肿瘤细胞的能力。
【具体实施方式】
[0048] W下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的技术人 员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，该些改进和润 饰也视为本发明实施例的保护范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的 文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指 南》，第H版，科学出版社）或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均 为可W通过市购获得的常规产品。
[0049] 实施例1 ;本实施例提供了一种既能在细胞膜表面稳定表达CD20又能分泌抗 CD20XCD3的基因重组慢病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤： (1)本实施例提供了一种含CD20XCD3基因的PUC57重组质粒载体的构建方法 (la)采用全基因序列合成的方式合成依次连接的甜a I酶切位点-编码免疫球蛋白 K链信号肤的碱基序列（SEQ ID N0:1)-编码Flag标签的碱基序列（SEQ ID N0:2)-BsAb 的碱基序列（SEQ ID N0:3)-编码组氨酸化s6标签的碱基序列（SEQ ID N0:4)-P2A碱基序 列（SEQ ID NO: 5)-Nhe I酶切位点，本实施例所述依次连接的各碱基序列仅为全基因合成 的基因（即DNA片段）双链中的一条，另一条链与依次连接的各碱基序列互补。
[0050] (lb)用甜a I和化e I对PUC57载体和实施例1步骤（la)合成的碱基序列双酶 切，采用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，并分别回收线性PUC57载体和酶切后的核巧酸片 段。
[0051] (Ic)采用T4 DNA连接酶将实施例1步骤（lb)所得酶切后的核巧酸片段和线性 PUC57载体按3:1的