一种猪icsi操作的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种猪ICSI操作的方法。
【背景技术】
[0002] ICSI (Intrac}ftoplasmic sperm injection)即卵胞浆内单精子显微注射技术，也 就是第二代"试管婴儿"，该技术是借助显微操作系统将单一精子注射入卵子内使其受精。 相对于小鼠和人来说，猪精子膜表面含有较多的脂类、糖脂和糖蛋白并且顶体区域富含磯 脂和胆固醇。因此在ICSI操作过程中，猪精子容易粘附注射针，从而加大显微操作难度。
[0003] 目前，通常在操作液中添加一种高分子物质聚己締化咯烧酬（PV巧来减少精子与 注射针的粘连，便于操作。但是PVP同精子一起注入到胞质内会包围在精子周围，不但使精 子质膜变得坚初影响破裂W及延迟胞质内巧离子振荡，影响精核解聚，而且阻碍精子向胞 质释放卵母细胞激活因子，影响卵母细胞的活化，使ICSI的成功率受到严重影响。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种用于制备ICSI受精卵的精子的制备方法。
[0005] 本发明提供的用于制备ICSI受精卵的精子的制备方法包括如下步骤；用脂酶或 脂酶溶液水解离体动物精液的精子，收集水解产物，得到用于制备ICSI受精卵的精子。
[0006] 上述方法中，所述脂酶溶液的制备方法：将脂酶与PBS溶液混匀，得到脂酶溶液。
[0007] 上述方法中，所述PBS溶液的制备方法；所述PBS溶液由溶质和溶剂组成，溶剂为 水；溶质及其在PBS 溶液中的浓度为；0. 27g/L KH2PO4U. 42g/L Na2HP〇4、8g/L 化C1、0. 2g/L KCl ;所述PBS溶液的PH为7. 4。
[000引上述方法中，所述脂酶溶液中所述脂酶的浓度为2. 5-10.0 mg/ml ;所述脂酶溶液 中脂酶的浓度具体为2. 5mg/ml、5. Omg/ml或10.0 mg/ml，所述脂酶溶液中脂酶的浓度进一 步具体为2. 5mg/ml。
[0009] 上述所述方法还包括如下步骤：
[0010] (1)将所述离体动物精液与所述脂酶溶液混匀，得到水解体系，进行水解反应，得 到水解产物；将所述水解产物进行离屯、，收集沉淀，所述沉淀即为1次水解后精子；
[0011] (2)将所述1次水解后精子与所述脂酶溶液混匀，得到水解体系，进行水解反应， 得到水解产物；将所述水解产物进行离屯、，收集沉淀，所述沉淀即为所述用于制备ICSI受 精卵的精子。
[0012] 上述方法中，步骤（1)和步骤（2)之间，还包括如下步骤；将所述1次水解后精子 与PBS溶液混匀，得到混合体系，将所述混合体系加到percoll溶液中，静置，离屯、，收集沉 淀。
[001引上述方法中，所述水解体系中精子和脂酶的配比均为（103-104)个；（2. 5-10)mg。
[0014] 上述方法中，将所述混合体系缓慢加到percoll溶液中。
[0015] 上述方法中，所述水解反应时间为Imin ;所述静置的时间为Imin。
[0016] 上述方法中，所述percoll溶液的制备方法：将2ml的lOXPBS溶液和18ml的 percoll混匀，得到混合液，将所述混合液再与10ml的PBS溶液混匀，即得到percoll溶液。
[0017] 上述方法中，还包括如下步骤；将所述用于制备ICSI受精卵的精子进行超声断尾 处理。
[0018] 上述方法中，所述超声的条件为；变幅杆；〇3 ;功率；66. 5W/h ;所述超声时间为 Imin ;所述超声过程为间断超声；超声时间；5. Os，停止时间；9. 9s。
[0019] 本发明的另一个目的是提供一种动物卵胞浆内单精子显微注射的方法。
[0020] 本发明提供的动物卵胞浆内单精子显微注射的方法包括如下步骤：
[0021] (1)将上述的用于制备ICSI受精卵的精子注射到卵母细胞中，得到ICSI卵； [002引 似将所述ICSI卵进行电激活、培养，得到ICSI受精卵。
[002引上述方法中，在步骤（1)和步骤（2)之间，还包括如下步骤；将所述ICSI卵在 PZM-3培养液中培养比。
[0024] 上述方法中，所述PZM-3培养液的制备方法；所述PZM-3培养液由溶剂和溶质 组成，溶剂为纯水（Sigma);溶质及其在培养液中的浓度；6. 3115g/L化C1、0. 7455g/L KC1、0. 0476g/L 皿2口〇4、0. 0986g/L M拆〇4 ? 7&0、2. 1061g/L 化C〇3、0. 022g/L 丙酬酸钢、 0. 6166g/L CaC2〇4 ? 5&0、0. 5% (体积分数化-Glutamine、0. 05g/L Gentamicin、0. 5455g/ L Hypotaurine、2% (体积分数）BEM、1% (体积分数）MEM、3g/L BSA。
[0025] 上述方法中，所述电激活在场强为1. 5KV/cm ;脉冲时程为80 y s的条件下进行。
[0026] 上述方法中，所述培养的时间为16-1化。
[0027] 上述方法中，所述卵母细胞为具有第一极体的卵母细胞；所述具有第一极体的卵 母细胞为具有第一极体且胞质均匀致密的成熟卵母细胞。
[002引上述方法中，所述动物具体为家畜；所述家畜具体为猪。
[0029] 上述所述的方法在如下（1)-(4)至少一种中的应用也属于本发明的保护范围：
[0030] (1)降低猪ICSI中精子粘针；
[0031] (2)缩短猪ICSI的操作时间；
[0032] (3)提高猪ICSI的卵裂率和/或囊胚形成率；
[0033] (4)提高猪ICSI的雄原核形成率。
[0034] 本发明通过实验证明；用不同浓度（0mg/ml、2. 5mg/ml、5. 0mg/ml、10.0 mg/ml)的 脂酶处理精子，水解掉猪精子膜周围较多的脂类，从而大大降低ICSI操作过程中猪精子与 注射针的粘连问题。不仅避免了因为加PVP而对猪精子的解聚、雄原核的形成、W及后期的 发育所造成的不良影响，而且对猪精子的质膜、顶体等区域造成破坏，有助于行ICSI操作 后猪精子释放促卵母细胞活化因子，增加雄原核的形成率、受精后胚胎的囊胚形成率。
【附图说明】
[0035] 图1为ICSI操作过程。其中，图1A为脂酶处理过后经超声波断尾后的单个精子 被吸到注射针内；图1B为吸持针固定离屯、后的卵母细胞，使第一极体位于"6"点钟位置，注 射针待注射单个精子头；图1C为单个精子头被注入成熟卵母细胞中；图1D为ICSI后16她 的囊胚图。
[0036] 图2为ICSI操作后16-1她的原核形成情况。其中，1为第一极体；2为第二极体； 3为雌原核（FPN) ;4为雄原核（MPN)。
[0037] 图3为使用不同浓度脂酶处理的精子进行ICSI操作后卵裂率W及囊胚率。其中， 图3A为2化卵裂率；图3B为4她卵裂率；图3C为14化囊胚率；图3D为16她囊胚率。
[0038] 图4为ICSI后4她的卵裂图。
【具体实施方式】
[0039] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0040] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[004U 本发明的精液来源于北京市昌平区农业部北方地区SPF种猪场。
[0042] 体外成熟培养液（IVM)的制备方法；体外成熟培养液由溶剂和溶质组成，溶剂为 纯水；溶质及其在培养液中的浓度；Medium 199粉剂佑ibco,31100-035)9. 5g/L，10% (体 积分数）PFF，10ng/ml EGF、0. 5mg/ml FSH、0. 5mg/ml LH、70ng/ml 切S。
[0043] 激活液的制备方法；激活液由溶剂和溶质组成，溶剂为纯水；溶质及其在培养液 中的浓度；〇. 3M D-Mannitol、0. 5mM Hepes、l. OmM CaCls ? 2&0、0.1 mM MgCla ? 6&0。
[0044] PZM-3培养液的制备方法；PZM-3培养液由溶剂和溶质组成，溶剂为纯水 (Singma);溶质及其在培养液中的浓度；6. 3115g/L 化C1、0. 7455g/L KC1、0. 0476g/ L 皿2口〇4、0. 0986g/L M拆〇4 ? 7&0、2. 1061g/L NaC〇3、0. 022g/L 丙酬酸钢、0. 6166g/L 化〔2〇4 ? 5&0、0. 5% kGlutamine'0.0 5g/L Gentamicin'O. 5455g/L Hypotaurine、2% (体 积分数）BEM、1 % (体积分数）MEM、3g/L BSA。
[0045] PBS溶液的制备方法；PBS溶液由溶质和溶剂组成，溶剂为水；溶质及其在PBS溶 液中的浓度为；〇. 27g/L KH2PO4U. 42g/L Na2HP〇4、8g/L 化C1、0. 2g/L KC1 ;所述PBS 溶液的