脑与脊髓兴奋毒性损伤细胞网络模型及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，特别设及一种W中枢神经系统毛细血管内皮细胞 (endothelial cells, E)、星形胶质细胞（astro巧tes,A)及神经元（neurons，脚所形成的 原代同源=细胞四维模型为基础的脑与脊髓兴奋毒性损伤细胞网络模型及其构建方法和 应用。
【背景技术】
[0002] 在中枢神经系统疾病中，由兴奋毒性所致的顽固性癒痛、急性缺血性卒中、肌萎缩 性侧索硬化症和早老性痴呆病等疾病，已经严重危害了人类生命与健康。而该类脑与脊髓 兴奋毒性损伤相关的疾病W其复杂性、难治性越来越引起关注。虽然现有大量的研究者致 力于针对该类疾病的药物研发，但是目前在临床治疗中针对W上疾病相关治疗药物所达到 的效果并不理想。对于该种困境，其主要原因是由兴奋毒性所致的中枢神经系统疾病的发 生发展过程是一个包含了多基因、多因素、多细胞相互作用的复杂途径。
[0003] 目前兴奋毒性损伤的体外研究中，多W单细胞培养或是简单的两种细胞混合培养 作为药物研发的细胞模型。在该类细胞模型中，往往是一种药物直接作用于祀细胞，该种药 物作用方式与体内的药物代谢途径大相径庭。同时该种模型，也无法客观模拟体内细胞间 复杂的相互作用。目前出现了利用Transwell将=种细胞进行共培养，按照细胞的来源可 分为两类，第一类细胞来源多W细胞系为主。虽然细胞系具有特征稳定，方便获得等优点， 但细胞系往往会丢失大量原有的特性，对实验结果产生的影响也难估计。第二类的模型中 部分细胞是由其本身的前体细胞诱导分化而来，人工诱导所产生的该类细胞，虽然部分具 有一定的细胞功能，但其完整性与原代所培养的细胞还有较大的差距。在动物实验中，动物 个体之间的差异，动物体内的复杂性，对实验结果的影响同样是难W预测。同时动物实验高 昂的实验成本，也造成大量研究难W进行。
[0004] E、A、N是中枢神经系统中相互作用关系最为密切的S种细胞，E形成的毛细血管 由附近A的突起所包裹，同时A的突起也伸向了周围的神经元，他们共同形成了神经血管单 元，在兴奋毒性损伤发生时，=者都会发生相应的应答，同时产生细胞间信号传递。抗兴奋 毒损伤药物进入体内后，多W首先与E作用，然后是A，最后才是N。其药物作用的祀细胞可 能是E、A和N其中的一种或多种，或是通过作用于其中的某一细胞后，再间接地影响其他细 胞。因此无论是简单的单细胞培养、两种细胞简单W及利用Transwell进行的细胞系共培 养都无法满足关于脑与脊髓兴奋毒性损伤及其防治干预的研究。而动物实验中实验动物的 不均一性和高成本，也很大程度上限制的该研究的进展。因此需要建立一种新的更加接近 于体内环境细胞培养模型，从而实现在避免动物实验中实验动物的不均一性和高成本的同 时，也要尽量创造出一个更加类似体内的细胞生长环境。
[0005] 随着相关研究技术的不断发展，多中细胞共同培养，能够成为现实。如何将E、A、 N=种细胞尽可能的模仿体内的空间位置进行共培养，包括培养器材的选取、细胞来源和不 同培养基的配比等等，很多的研究者作出了不少的尝试。目前，现有体外共培养模型的细胞 有来自于原代，也有来源与细胞系，或是原代细胞与细胞系混合培养，甚至是将不同种属的 细胞共培养。此外，共培养模型的支架材料选择更是各式各样，其中一大类是insed插件， 而目前的研究为了能获得更好的E紧密连接实验参数值，大多研究者选择孔径为0. 4 y m的 插件，该对单纯研究E紧密连接没有问题，但是如果要在插件底外侧面加入A进行共培养 时，0. 4 y m的孔径是无法保证A的突起可W顺利穿过的；另一大类是微流控装置，该种方式 虽然能通过较少的细胞数量实现多细胞共培养，但也正因如此，很多的实验由于细胞数量 过少而无法完成，更加无法模拟各种细胞在体内的相对数量关系。
[0006] 综上所述目前对于脑与脊髓兴奋毒性损伤的体外研究，急需一种合理稳定的体外 研究模型，W为在发生脑与脊髓兴奋毒性损伤时，不单是N兴奋毒性损伤，与N有密切联系 的E和A同样会发生相应的变化。在进行药物研究时，E的变化有为重要，因为E形成了血 脑屏障，而体内任何一种药物都需要通过血液循环经血脑屏障到达中枢神经系统，而目前 神经、精神疾病药物研究的一个瓶颈就是很多体外研究忽略了该一药代动力学过程，该主 要是由于现阶段脑与脊髓兴奋毒性损伤体外研究模型无法模拟体内E、A、N=种细胞之间 的通过相互作用产生的动态平衡，而是单纯的直接将神经元暴露于备选药物，该也是很多 药物只能停留于实验室，而不能走向临床的主要原因。基于上述原因，目前迫切需要建立一 种更加接近于体内环境的脑与脊髓兴奋毒性损伤及其相关药物研究用体外模型。
[0007] CN201310065078. 7的发明专利公开"中枢神经系统药物研究的原代同源S细胞四 维模型及构建方法"，其按照体内中枢神经系统E、A和N的相对空间结构，构建了原代同源 EAN=细胞四维模型。但是按照该模型的构建方法所获得的E的紧密连接程度往往偏低，无 法满足损伤实验和药物研究的要求。
【发明内容】
[000引本发明的目的是提供了一种WE、A及N所形成的原代同源S细胞四维模型为基础 的脑与脊髓兴奋毒性损伤细胞网络模型。
[0009] 本发明的再一目的是提供上述脑与脊髓兴奋毒性损伤细胞网络模型的构建方法， W原代同源E、A及N =种重要细胞，按其在体内的相对空间位置及数量关系进行立体化共 培养，利用谷氨酸-甘氨酸联合暴露神经元完全培培养液，模拟体内脑与脊髓兴奋毒性损 伤。
[0010] 本发明的另一目的是提供上述脑与脊髓兴奋毒性损伤细胞网络模型的应用，采用 经插件内腔E培养液给药方式，模拟生物体内药物自循环系统经血脑屏障进入中枢神经系 统的药物代谢途径，将该模型作为药物筛选平台应用于相关防治干预研究，W解决目前研 究所存在的上述技术问题。
[0011] 根据本发明的脑与脊髓兴奋毒性损伤细胞网络模型，其包括原代同源的E、A及N，
[0012] 其中，将原代培养已经纯化的A进行膜酶消化，同时将长满E的插件从培养孔取出 倒置放于无菌培养皿中，将A悬液植于插件底膜外侧面，之后该无菌培养皿置于普通细胞 培养系统解育；然后，插件翻转插入装有E完全培养液的培养孔，同时在插件内加入E完全 培养液，待E和A共培养后，将E和A共培养的插件放置于已经成熟稳定的N培养孔中，既 构建了基础EAN细胞网络模型，其构造如图1所示；在培养孔中插有Transwell插件，插件 外腔有N完全培养液，内腔有E完全培养液；N生长于培养孔底面；所述插件底部内侧面涂 有胶原蛋白IV，W模拟中枢神经系统E-A间隙基底膜蛋白层；插件底部内侧面胶原蛋白IV 上层生长有E，插件底部外侧面生长有A，其突起通过插件底孔穿向E底面；
[0013] 其中，通过将基础EAN中神经元完全培养液更换为谷氨酸-甘氨酸联合暴露神经 元完全培培养液，然后将细胞模型重新置于普通细胞培养系统内继续培养15分钟，十五分 钟结束后，再将谷氨酸-甘氨酸联合暴露神经元完全培培养液更换为神经元完全培养液， 继续培养30分钟、3小时或3天，W模拟脑与脊髓兴奋毒性损伤后的=个时间窗分别对应临 床上兴奋毒性损伤后的超急性期、急性期和亚急性期。
[0014] 根据本发明的脑与脊髓兴奋毒性损伤的细胞网络模型构建方法包括W下步骤：
[0015] 1、中枢神经系统原代同源基础EAN细胞网络模型化asal network of the matured