一种可视化结核抗体检测蛋白芯片、制备方法及用途的制作方法

专利名称：：一种可视化结核抗体检测蛋白芯片、制备方法及用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种可视化多靶点结核抗体检测蛋白芯片，具体涉及一种多耙点结核抗体检测的蛋白芯片，还涉及该芯片的制备方法及医疗用途。
背景技术：
：近年来，结核病死灰复燃，全球大约l/3的人口感染结核杆菌，每年死于结核病的人数约300万人。我国第四次结核病流行病学抽样调査报告显示，我国现有活动性肺结核患者451万，菌阳肺结核患者196万。而且近年来我国结核病感染人数呈逐渐上升趋势，其数量居传染病首位。因此，结核病的早发现、早诊断、早治疗显得尤为重要。传统的细菌学诊断技术是结核病诊断的"金标准"，被沿用至今，但由于它存在检测耗时长、敏感性低、特异性较差等缺点，一直难以满足临床诊断的需要。血清学免疫诊断技术由于其操作简便、快速、稳定性好等固有优势，仍然是结核病辅助诊断的重要工具。然而，目前结核抗体检测试剂在特异性和敏感性方面仍存在一些问题，主要原因是所采用的抗原不能满足高特异敏感性诊断试剂的要求。在先前的研究中，我们克隆表达了七种特异性强并具有互补性的结核杆菌抗原(38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和MtM6.3)，在本研究中我们进一步通过生物信息学软件分析筛选优势表位，并成功克隆表达了优势表位抗原。利用这些优势表位抗原研制成检测结核抗体的可视化抗体检测蛋白芯片。该方法与传统痰涂片和痰菌培养方法相比，大大提高了结核病检测的敏感性和特异性，有望用于结核病辅助诊断。38kD抗原是一种脂蛋白和主要免疫原，是目前最为常用的结核病诊断抗原之一。WHKinson报道用38kD抗原检测肺结核病人血液，敏感性与特异性分别为65.6%和95.8%(JClinMicrobiol,35(3):553國557(1997))。早期分泌性抗原性耙(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP10)是结核病免疫诊断中两个很有前途的抗原，具有较强的细胞免疫活性，在抗结核感染的免疫回忆应答中起重要作用。这两个抗原均由RD1区编码，该区只存在于致病性结核杆菌基因组中，所有BCG菌株基因组中均缺乏该区域。联合应用ESAT-6和CFP10诊断结核病发现混合抗原敏感性较单抗原增加，而不降低其特异性。所以，ESAT-6和CFP10可有望成为诊断动物和人致病性结核杆菌感染的特异性抗原。MPT64是结核杆菌生长最早分泌的主要蛋白，仅在结核杆菌及牛型杆菌中存在。虽然Lyashchenko等的研究结果表明，以MPT64蛋白作为抗原检测抗结核抗体的阳性率在各种结核杆菌分泌性蛋白中是较低的，但如果与其它蛋白形成融合蛋白则有可能具有较好的稳定性(ClinDiagnLabImmunol,7(2):155-160(2000))。因此，MPT64蛋白有希望成为结核病血液学诊断的组合抗原的候选者之一。Mtb8.4(Rvll74c)、Mtb8(Rv0379)和Mtbl6.3(Rv2185c)广泛存在于结核杆菌中，其在结核病诊断方面的意义仍然不清楚。Mtb8.4是新近从结合杆菌培养物滤液中纯化分离得到的一种的低分子量蛋白抗原，Coler等学者的研究更进一歩揭示Mtb8.4是患有潜伏结合杆菌感染的个体中重要的免疫活性T细胞抗原，在确定致病性结合杆菌感染中具有重要作用(JImmunol.,161:2356-2364(1998))。Mtb8可能是转运蛋白质，仅在Houghton的研究中将Mtb8与其它几种抗原(Mtbll、Mtb48、38kD等)组成融合抗原用于检测结核病，表明Mtb8与其它几种抗原一起有可能增强38kD抗原的反应活性(ClinDiagnoLabImmun，9(4):883-89I(2002))。而MtM6.3是一种未知功能蛋白质，有研究表明Mtbl6.3与Mtb9.7组合有助于提高对与HIV混合感染的结核病患者的检出率。不同结核杆菌抗原检测同一病人血液，其反应性有所不同，而且各抗原之间存在一定的互补性。其原因可能在于结核杆菌抗原多而复杂，在宿主体内表达的数量、种类或时机可能随病人的个体免疫背景和病程而异，表现出不同的抗体谱。因此，将多种抗原制备成蛋白芯片，联合检测可以在保证特异性的基础上有助于提高检测敏感性，是研制高特异性和高敏感性诊断试剂的发展方向。王海波等应用3种结核抗原建立结核杆菌抗体检测蛋白芯片，并与ELISA进行比较，敏感性和特异性分别为69.9%和84.9%。我们将结核杆菌7种优势表位抗原制备成多靶点蛋白芯片，建立的免疫金银可视化抗体检测蛋白芯片检测结核病人血液样品技术，该技术简便易行、敏感性高、特异性强。我们初步结果分析，本结核杆菌可视化抗体检测蛋白芯片与痰涂片检测方法相比，敏感性为98.5%，显著高于痰涂片检测方法的敏感性35.4%;与痰菌培养检测方法相比，敏感性为96.6%，显著高于痰菌培养检测方法的敏感性48.3%。其原因可能在于两方面，一方面是我们选用了七种结核杆菌抗原，抗原之间存在互补性，有助于提高检出率；另一方面，免疫金银染色可视化蛋白芯片检测技术基本原理是利用银显影液和胶体金颗粒的催化作用，理论上只要有2个金原子存在便可以有效催化银的氧化还原反应，具有很强的信号放大效应。因此，本可视化多靶点结核抗体检测蛋白芯片可以用于结核病的临床辅助诊断，提高痰涂片和痰菌培养阴性患者的检出率。此外，由于本研究采用结核杆菌特异的优势表位抗原，在一定程度上保证了检测的特异性。通过对献血员血液样本的检测，计算本可视化多耙点结核抗体检测蛋白芯片的特异性为93.3%，也证明可以满足临床需求。生物芯片技术是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。蛋白芯片是用于蛋白质功能研究及其相互作用分析的生物芯片，采用原位合成、机械点样或共价结合等方法将多肽、蛋白、酶、抗原、抗体固定于基片形成分子点阵。利用生物分子与蛋白芯片的探针分子发生杂交或相互作用，检测和分析蛋白质的一项技术。目前对蛋白芯片反应信号的检测主要有荧光法、酶显色法和免疫金一银显色法。荧光法是蛋白芯片通常采用的信号检测系统，主要利用激光共聚焦扫描仪对杂交信号进行高通量检测和分析，具有自动化程度高、灵敏度高的特点，但需要购买昂贵的芯片扫描仪和专业人员，无法在基层医疗单位推广。酶显色法主要利用标记的辣根酶或者其他生化酶与特定的显色液相互作用，根据芯片矩阵的颜色变化对反应结果进行分析的过程，但灵敏度和特异性低。免疫金一银显色法主要利用胶体金进行蛋白质标记并通过银进行直接显色，该方法既具有高的灵敏度和特异性，同时又无需增添设备，是可视化芯片的重要模式，具有广泛的应用潜力和前景。但目前国内外尚无应用可视化免疫金银蛋白芯片检测结核病的相关报道。
发明内容为了解决目前结核病检测检出率低、特异性差的缺点，本发明提供了一种利用克隆表达的七种结核杆菌特异优势表位抗原，制备可视化多耙点结核抗体检测蛋白芯片的制备方法及用途。本发明的蛋白芯片采用免疫金银检测系统显色芯片。为了实现多靶点结核抗体的高效平行检测的目的，本发明通过对蛋白芯片领域的深入研究，提出了一种用于检测结核抗体，采用的多耙点可视化蛋白芯片技术，同时检测结核患者血清中多种抗体，从而建立可视化多靶点结核抗体检测蛋白芯片。本发明的可视化多靶点结核抗体检测蛋白芯片，不同于以往的结核抗体检测芯片，是建立在七种特异的结核杆菌特异表位抗原基础上的结核抗体多靶点蛋白芯片，并利用"胶体金一银染"显色系统达到芯片检测结果可视化目的。本发明提供的蛋白芯片，仅用1滴样本就可以检测到血清与7个多个靶点抗原的反应情况，实现了检测的高通量、平行性和高效性。为实现上述目的，发明人设计了由7个多靶点结核抗原组成的矩阵，每个矩阵上点有7种结核杆菌抗原，每种抗原设2个平行点。阴性对照点为抗原空白对照和pBVILl空载体，阳性对照点为人IgG。采用点接触法将7种结核抗原固定于芯片基片上，与结核并患者血清相互作用，采用"胶体金一银染"使芯片显色，通过结果判断，研究结核患者血清与各个靶点抗原的反应情况，统计患者血清中结核抗体反应性，并分析其临床意义。本发明是通过以下技术方案得以实现的首先制备结核表位抗原，利用分子生物学方法进行制备，将制备的结核抗原纯化后进行预处理，采用点接触法制备结核抗体多靶点检测芯片，封闭并干燥，获得本发明的蛋白芯片。在使用该芯片进行结核抗体检测时，将结核病患者血清与芯片进行反应，漂洗后采用胶体金标记蛋白反应，用硝酸银溶液显色，可以目视或用普通图像扫描仪记录结果，分析其临床意义。本发明可视化多靶点结核抗体检测蛋白芯片可以对患者血清中7种抗结核杆菌抗体进行检测，结果显示，与痰涂片和痰菌培养检测方法的敏感性相比，可视化多耙点结核抗体检测蛋白芯片敏感性分别为98.5%和96.6%,特异性为93.3%，显著高于现有金标准检测方法。所制备的可视化多靶点结核抗体检测蛋白芯片可用于结核病的临床辅助诊断，大大提高痰涂片和痰菌培养阴性患者的检出率与现有技术相比，本发明具有以下特点1.本发明建立在可视化蛋白芯片检测技术基础上本发明所涉及的结核杆菌特异优势表位抗原共有7种，采用蛋白芯片法可通过一次加样就能达到检测患者血清中7种抗体反应程度，检测效率远高于现有的酶联检测技术和金标试剂，采用"胶体金一银染"可实现蛋白芯片检测结果的可视化，无需购买昂贵的芯片扫描仪，适合临床推广。2.本发明具有一定的临床意义。本发明所采用的多靶点抗原是具有结核杆菌特异的表位，它集中了目前大部分检测用抗原。7种抗体具有各自的临床意义，与临床研宄关系密切。图1纯化后结核杆菌特异表位抗原的SDS-PAGE分析，其中1.ESAT-6;2.CFP10;3.38kD;4.Mtb8;5.Mtb8.4;6.Mtbl6.3;7.MPT64;M.低分子量蛋白标准。图2可视化多靶点结核抗体检测蛋白芯片反应矩阵设计图，其中la和lb为ESAT-6抗原；2a和2b为Mtb8抗原；3a和3b为Mtb8.4抗原；4a和4b为CFP10抗原；5a和5b为Mtbl6,3抗原；6a和6b为38kD抗原；lc和ld为MPT64抗原；2c、2d、3c和3d为ILl阴性对照；4c、4d、5c和5d为pBVILl空载体阴性对照；6c和6d为IgG阳性对照。图3可视化多耙点结核抗体检测蛋白芯片检测结果及判定，其中A为85729号TB患者血清样本，判定为阳性；B为85518号TB患者血清样本，判定为可疑；C为1号Donor血清样本，判定为阴性。具体实施例方式实施例1可视化多靶点结核抗体检测蛋白芯片反应矩阵设计和芯片制备一、材料原核表达载体pBVILI由本室构建。结核杆菌7种特异抗原基因质粒由本室构建并保存。实验所需PyrobestDNA聚合酶和TaqDNA聚合酶为TaKaRa公司产品，DNA限制性内切酶SalI、XhoI和XbaI，以及T4DNA连接酶均购自Promega公司。阴离子交换柱Q-SepharoseFF和凝胶过滤柱SephardexG-50购自于PharmaciaBiotech公司，脲、蔗糖购自于北京化学试剂公司，溶菌酶、BSA购自于Promega公司，修饰的玻璃基片由深圳益盛堂公司提供。二、方法结果1.结核杆菌7种特异表位抗原的制备根据特异表位抗原肽段的核苷酸序列设计合成上下游引物，所使用的限制性内切酶分别为Bom/n和J^oI。用于扩增特异表位抗原肽段38kD的引物序列如下38kD-F:5，-GGGATCCGCGGCGGGCTGTGGCTCGA-3'38kD-R:5，-GCTCGAGGCTGGAAATCGTCGCGA-3，用于扩增特异表位抗原肽段ESAT6的引物序列如下ESAT6-F:5，-GGGATCCCATTCCCTCCTTGACGA画3'ESAT6-R:5，-GCTCGAGGTTCAGCTCGGTAGCCGT-3，用于扩增特异表位抗原肽段CFP10的引物序列如下CFP10-F:5，-CGGATCCGAAGCAGCCAATAAGCAG陽3，CFP10-R:5，-GCTCGAGCGAGGACAGCGCCTGCTG-3，用于扩增特异表位抗原肽段MPT64的引物序列如下MPT64-F:5，-GGGATCCCCCAAGACCTACTGCGA國3，MPT64画R:5'-GCTCGAGCGGCGCTATCGATACCT-3，用于扩增特异表位抗原肽段Mtb8的引物序列如下Mtb8画F:5，-GGGATCCACCAGCCCCACATCCT-3'Mtb8國R:5，國GCTCGAGAATGACCCGAGCGACGCGGA國3，用于扩增特异表位抗原肽段Mtb8.4的引物序列如下Mtb8.4-F:5，-GGGATCCCCGGGGTCGCCTCCGCA-3'Mtb8.4-R:5,-GCTCGAGTTGCGCGGCCATGGCA-3'用于扩增特异表位抗原肽段Mtb16.3的引物序列如下Mtb16.3-F:5，-GGGATCCCGGACAAGACGACACAGA-3，Mtb16.3画R:5，-GCTCGAGGCCCTCGACTCGTTTCTT-3'以结核杆菌7种特异抗原基因质粒为模板，分别扩增了38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtbl6.3特异表位抗原肽段的基因片段。PCR扩增条件如下预变性95i:2分钟，变性94。C30秒；复性58°C30秒；延伸72°C30-90秒(随基因长度不同而不同)，扩增32个循环，再72。C延伸7分钟。PCR扩增所得的片段通过电泳鉴定，表明均得到相应大小的基因片段。将PCR产物用限制性内切酶酶切并连接入经相同限制性内切酶酶切的pBVILl载体，测序由利嘉富诚生物技术有限公司完成。用所得到的重组质粒转化大肠杆菌菌株DH5a，热诱导表达，收集菌体，将沉淀称湿重，用10倍体积的20mmol/LpH8.0TE缓冲液将沉淀悬起，加入溶菌酶(lmg/ml悬液)，在室温下磁力搅拌10分钟。在冰浴中超声波破碎菌，每次超30秒钟，间隔30秒钟，共超10次。8°C，1,2000rpm，离心20分钟，弃上清，沉淀用lmol/LNaCl(用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲(用PH8.0TE配制)溶解，加1%3-巯基乙醇。再于20。C1,2000rpm离心IO分钟，去沉淀取上清。将上述溶解的包涵体溶液过Q-SepharoseFF阴离子交换柱，用平衡液(pH8.0,20mmol/LTE含6mol/L脲，0.1%0-巯基乙醇)清洗后，用不同浓度的NaCl(用平衡液配制)洗脱，收集各洗脱峰，经SDS-PAGE鉴定，收集0.05mol/LNaCl洗脱峰。再过SephardexG-50凝胶过滤10柱，收集第一洗脱峰。纯化的抗原进行SDS-PAGE分析，结果表明获得了纯度较高的特异表位抗原肽段(图l)。2.可视化多靶点结核抗体检测蛋白芯片反应矩阵的设计设计了由7中结核杆菌特异表位抗原组成的反应矩阵，每个矩阵上点有7种结核杆菌抗原、IL1阴性对照、pBVILl空载体阴性对照和IgG阳性对照，每种抗原设2个平行点。图2为可视化多靶点结核抗体检测蛋白芯片反应矩阵设计图模式图，其中la和lb为ESAT-6抗原；2a和2b为Mtb8抗原；3a和3b为Mtb8.4抗原；4a和4b为CFP10抗原；5a和5b为Mtbl6.3抗原；6a和6b为38kD抗原；lc和ld为MPT64抗原；2c、2d、3c和3d为IL1阴性对照；4c、4d、5c和5d为pBVILl空载体阴性对照；6c和6d为IgG阳性对照。3.可视化多靶点结核抗体检测蛋白芯片的制备运用点接触法进行点样，每点点样量为1nL，抗原浓度为lmg/mL，0.01mol/LPBS(pH=7.4)溶解稀释抗原。点样后将芯片室温放置4h，封闭液O.lmol/LPBS(1%BSA,pH=7.4)封闭2小时，以封闭基片表面未结合的空白位点。用滤纸将微阵列周围的液体吸干后干燥，4t:保存备用。实施例2结核病患者和正常献血员血液样品抗体的检测及信号采集一、材料胶体金标记蛋白A、对苯二酚柠檬酸钠、柠檬酸、硝酸银购自北京化学试剂公司。二、方法结果1.胶体金制备采用柠檬酸三钠还原法制备成15nm粒径胶体金溶液，取1%四氯化金lml加入99ml去离子水稀释成浓度为0.01%,取100ml0.01%四氯化金水溶液加热至沸腾，迅速加入1%柠檬酸三钠1.0ml，煮沸约5分钟后出现透明橙红色时停止加热，待冷却后加入去离子水补充至原体积。制备好的胶体金溶液应为透明橙红色，无沉淀。电镜下观察无聚集，分散均匀，测定其平均直径为15nm。合格的胶体金溶液4t:保存备用。2.胶体金标记A蛋白探针制备用去离子水配制0.1M碳酸钾和3%的聚乙二醇(分子量20,000)。首先用(UM碳酸钾调节胶体金溶液pH至6.0，按胶体金溶液与A蛋白的最佳比例(一般按lml胶体金溶液标记10ligA蛋白)。室温搅拌15分钟后，加入3%的PEG使其终浓度为0.05%，继续充分搅拌混匀15分钟，室温静置30分钟，4°C14000rpm离心45分钟，沉淀用含0.01MPBS(1%BSA、0.2%叠氮钠，pH7.2-7.4)溶解，再次4"14000rpm离心45分钟，沉淀加入初始体积1/10的0.01MPBS(1%BSA、0.2%叠氮钠，pH7.2-7.4)缓冲液溶解，0.22um硝酸纤维素膜除菌过滤后，4-C保存备用。3.结核病患者和正常献血员血液样品抗体的检测及信号采集分别将结核病患者和正常献血员血液样品1:10稀释，每矩阵30PL，与芯片室温孵育lh。用PBST洗涤5次，加入胶体金标记A蛋白探针，每矩阵30uL室温孵育30分钟，洗涤5次后，再用双蒸水洗涤2次。加入新鲜配制的银显影A液20uL，B液20yL，轻轻振荡，避光作用10分钟。用双蒸水洗涤后凉干。目视或使用CanonLiDE20扫描仪分析各点的显色强度。结果判断原则7种抗原中任何2种或2种以上抗原阳性均判定为阳性，仅1种抗原阳性判定为可疑，7种抗原均为阴性判定为阴性(图3)。实施例3可视化多耙点结核抗体检测蛋白芯片临床应用一、材料实施例2所研制的可视化多靶点结核抗体检测蛋白芯片。临床结核病患者阳性血液样本和正常献血员血液样本。二、方法结果用所研制的可视化多靶点结核抗体检测蛋白芯片检测结核病患者和献血员的血液样品，按照结果判定原则判定阴性或阳性结果，并与痰涂片和痰菌培养结果进行比较，结果见表l。在48例临床确诊结核病人中，痰涂片阳性17例，阴性31例，敏感性为35.4%。而可视化抗体检测蛋白芯片检测阳性47例，可疑1例，敏感性为98.5%。其中痰涂片17例阳性样品，可视化抗体检测蛋白芯片也均为阳性；而在痰涂片31例阴性样品中，可视化抗体检测蛋白芯片检测29份阳性，2份可疑，见表2。在29例临床确诊结核病人中，痰菌培养阳性14例，阴性15例，敏感性48.3%。而可视化抗体检测蛋白芯片检测阳性28例，l例可疑，敏感性96.6%。其中痰菌培养14例阳性样品，可视化抗体检测蛋白芯片也均为阳性；而在痰菌培养15例阴性样品中，可视化抗体检测蛋白芯片检测14例阳性，l例可疑，见表3。30份献血员样品中可视化抗体检测蛋白芯片检测出l例阳性，l例可疑。特异性为93.3%。表1可视化多耙点结核抗体蛋白芯片检测结核病患者和献血员血液样品与痰涂片和痰菌培养结果的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>ND:nodetection表2结核杆菌可视化抗体检测蛋白芯片与痰涂片检测结果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3结核杆菌可视化抗体检测蛋白芯片与痰菌培养检测结果H<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所〈120〉一种可视化多靶点结核抗体检测蛋白芯片、其制备方法及用途<160〉7〈170〉Patentlnversion3.3<210〉1〈211〉354〈212〉PRT〈213>结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)〈400〉2AlaAlaGlyCysGlySerLysProProSerGlySerProGluThrGly151015AlaGlyAlaGlyThrValAlaThrThrProAlaSerSerProValThr202530LeuAlaGluThrGlySerThrLeuLeuTyrProLeuPheAsnLeuTrp354045GlyProAlaPheHisGluArgTyrProAsnValThrlieThrAlaGin505560GlyThrGlySerGlyAlaGlylieAlaGinAlaAlaAlaGlyThrVal65707580AsnlieGlyAlaSerAspAlaTyrLeuSerGluGlyAspMetAlaAla859095HisLysGlyLeuMetAsnlieAlaLeuAlalieSerAlaGinGinVal100105110AsnTyrAsnLeuProGlyValSerGluHisLeuLysLeuAsnGlyLys115120125ValLeuAlaAlaMetTyrGinGlyThrlieLysThrTrpAspAspPro130135140GinlieAlaAlaLeuAsnProGlyValAsnLeuProGlyThrAlaVal145150155160ValProLeuHisArgSerAspGlySerGlyAspThrPheLeuPheThr165170175GinTyrLeuSerLysGinAspProGluGlyTrpGlyLysSerProGly180185190PheGlyThrThrValAspPheProAlaValProGlyAlaLeuGlyGlu195200205AsnGlyAsnGlyGlyMetValThrGlyCysAlaGluThrProGlyCys210215220ValAlaTyrlieGlylieSerPheLeuAspGinAlaSerGinArgGly225230235240LeuGlyGluAlaGinLeuGlyAsnSerSerGlyAsnPheLeuLeuPro245250255AspAlaGinSerlieGinAlaAlaAlaAlaGlyPheAlaSerLysThr260265270ProAlaAsnGinAlalieSerMetlieAspGlyProAlaProAspGly275280285TyrProlielie,AsnTyrGluTyrAlalieValAsnAsnArgGinLys290295300AspAlaAlaThrAlaGinThrLeuGinAlaPheLeuHisTrpAlalie305310315320ThrAspGlyAsnLysAlaSerPheLeuAspGinValHisPheGinPro325330335LeuProProAlaValValLysLeuSerAspAlaLeulieAlaThrlie340345350SerSer〈210>2<211〉41〈212〉PRT〈213〉结核杆菌〈400〉4HisSerLeuLeuAspGluGlyLysGinSerLeuThrLysLeuAlaAla1015AlaTrpGlyGlySerGlySerGluAlaTyrGinGlyValGinGinLys202530TrpAspAlaThrAlaThrGluLeuAsn3540〈210〉3〈211〉37〈212〉PRT<213>结核杆菌〈400〉6GluAlaAla1AsnLys5GinLysGinlieArgGinAlaGly20ValGinTyrGinAlaLeu35SerSer〈210〉4〈211〉154〈212〉PRT〈213〉结核杆菌<400>8ProLysThr1TyrCys5GluGluLeuCysLeulieGinMet20SerAspProProSerTyr35TyrProAspGinLys40ThrArgAsp50LysPheLeuSerAla55AlaProTyr65GluLeuAsnlieThr70101525301015253045607580ProProArgGlyThrGinAlaValValLeuLysValTyrGinAsnAla859095GlyGlyThrHisProThrThrThrTyrLysAlaPheAspTrpAspGin100105110AlaTyrArgLysProlieThrTyrAspThrLeuTrpGinAlaAspThr115120125AspProUuProValValPheProlieValGinGlyGluLeuSerLys130135140GinThrGlyGinGinValSerlieAlaPro145150<210〉5〈211〉30〈212〉PRT〈213〉结核杆菌〈400〉10ThrSerProThrSerTrpGluGinAlaAlaAlaGluAlaValGinArg151015AlaArgAspSerValAspAsplieArgValAlaArgVallie202530<210>6〈211〉64〈212〉PRT〈213〉结核杆菌〈400〉12AlaGlyValAlaSerAlaAspProValAspAlaVallieAsnThrThr151015CysAsnTyrGlyGinValValAlaAlaLeuAsnAlaThrAspProGly202530AlaAlaAlaGinPheAsnAlaSerProValAlaGinSerTyrLeuArg354045AsnPheLeuAlaAlaProProProGinArgAlaAlaMetAlaAlaGin505560<210〉7<211>143<212〉PRT〈213〉结核杆菌<400>14AlaAspLys1ThrThrGinThrlieTyrlieAspAlaAspProGlyGlu51015ValMetLysAlalieAlaAsplieGluAlaTyrProGinTrplieSer202530GluTyrLysGluValGlulieLeuGluAlaAspAspGluGlyTyrPro354045LysArgAlaArgMetLeuMetAspAlaAlaliePheLysAspThrLeu505560lieMetSerTyrGluTrpProGluAspArgGinSerLeuSerTrpThr65707580LeuGluSerSerSerLeuLeuLysSerLeuGluGlyThrTyrArgLeu859095AlaProLysGlySerGlyThrGluValThrTyrGluLeuAlaValA印100105110LeuAlaValProMetlieGlyMetLeuLysArgLysAlaGluArgArg115120125LeulieAspGlyAlaLeuLysAspLeuLysLysArgValGluGly130135140权利要求1.一种可视化多靶点结核抗体检测蛋白芯片，其特征在于蛋白芯片上固定有SEQIDN01-7所示的7种结核杆菌特异优势表位抗原。2.根据权利要求1所述蛋白芯片，其特征在于还固定有阳性对照抗原和阴性对照抗原。3.制备权利要求1或2所述蛋白芯片的方法，包括以下步骤(1)制备SEQIDNO:1-7所示的7种结核杆菌特异优势表位抗原；(2)将制备的抗原固定于芯片基片；(3)用封闭液进行封闭，然后干燥。4.根据权利要求3所述方法，其中固定上述抗原于芯片基片采用点接触法。5.根据权利要求3所述方法，其中所述芯片基片为氨基硅垸化的玻片。6.权利要求1或2所述蛋白芯片在检测抗结核杆菌抗体中的用途。全文摘要本发明公开了一种利用克隆表达的七种结核杆菌特异优势表位抗原研制的可视化多靶点结核抗体检测蛋白芯片，还公开了该蛋白芯片的制备方法及用途。本发明将七种结核杆菌特异优势表位抗原点于修饰的基片上，制备可检测七种结核抗体的多靶点蛋白微阵列，建立免疫金银染色检测系统替代芯片原有荧光标记物。通过本发明检测系统的应用，无需使用芯片荧光扫描仪，通过目测及简单的图像扫描即可对芯片的反应结果进行判断，达到对结核病检测之目的。可视化多靶点结核抗体检测蛋白芯片敏感性分别为98.5％和96.6％，特异性为93.3％，显著高于痰涂片和痰菌培养方法，并且显著提高了痰涂片和痰菌培养阴性患者的检出率，可用于结核病的临床辅助诊断，具有一定的临床应用前景。文档编号G01N33/53GK101639476SQ20081013480公开日2010年2月3日申请日期2008年7月31日优先权日2008年7月31日发明者冯晓燕,宋晓国,张贺秋,王国华,坤陈申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所