专利名称：谷氨酸基因工程高产菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及利用基因工程技术改造谷氨酸棒杆菌得到重组 谷氨酸高产菌及其制备方法与利用高产菌发酵生产谷氨酸方面的应用。
背景技术：
谷氨酸是构成蛋白质的主要氨基酸之一，在食品、医药、农业方面具有广泛的应用。 在食品应用方面，谷氨酸单钠盐不仅具有强烈的肉类鲜味，而且具有营养价值，因而常 被用于食品调味。在医药应用方面，谷氯酸钠和谷氨酸钾注射液以及谷氨酸片可用于防 治肝昏迷，解氨毒，保护肝脏，这是因为谷氨酸被人体吸收后易与血氨形成谷酞胺，从 而解除代谢过程中氨的毒害作用；此外，谷氨酸钠与维生素B1、 B6和葡萄糖混合可制 成静脉点滴注射液，谷氨酸钙可与维生素合用，以增强钙的吸收。在农业应用方面，谷 氨酸铜可作为西红柿保护性和防治性杀菌剂；谷氨酸与某些激素配合，可制成柑橘增甜 剂，因为谷氨酸可增加柑橘果实的含糖量，降低其酸度；此外，谷氨酸与某些生理活性 物质配合，可开发出新的植物生长调节剂；谷氨酸还和其它一些氨基酸一样可作为微肥 载体。
目前谷氨酸的生产主要是利用谷氨酸棒杆菌Co/7"etoWm'wm g/wtom'cww发酵生产。 谷氨酸棒杆菌C g/wtom'c腦是Kinoshita等人1957年从自然界分离得到，这是一种好氧、 不产孢子的革兰氏阳性细菌，基因组大小为3282 kb，它不仅能利用葡萄糖为唯一碳源 进行生长，而且能利用包括乙酸和琥珀酸在内的其它有机酸和碳水化合物为唯一碳源或 混合碳源进行生长。谷氨酸棒杆菌C. 为生物素缺陷型，需要补充生物素才
能生长。当培养基中的生物素过量时，菌体不向细胞外分泌产生谷氨酸；当生物素被限 量添加时，菌体则大量分泌产生谷氨酸，因而野生型的谷氨酸棒杆菌可通过生物素限量 添加来诱导分泌产生谷氨酸。此外，在生物素过量的情况下通过添加某种表面活性剂如 Twee40或Tween60也能诱导谷氨酸棒杆菌过量合成谷氨酸。
尽管已有不少有关谷氨酸棒杆菌的遗传和生理生化方面的研究，但是谷氨酸棒杆菌 C. g/wto/m'cwm过量合成并分泌产生谷氨酸的分子机理仍然处于研究阶段。早在1965年Takbami等人提出渗漏模型，认为谷氨酸的分泌是细胞膜物理化学特征发生变化的结 果。然而最新关于谷氨酸合成代谢流方面的研究表明，谷氨酸生物合成途径的改变在谷 氨酸生产中发挥关键作用，在有关几乎所有氨基酸的发酵生产研究中，代谢流的改变被 认为是提高菌体生产强度最重要的因素。研究发现，在谷氨酸的生物合成途径(图l) 中a-酮戊二酸脱氢酶复合体(ODHC)是关键的限速酶。生物素限量以及添加Tween40 或Tween60等谷氨酸合成诱导条件均可引起ODHC活性的下降，下降的ODHC活性使 代谢流在ODHC分支点处向谷氨酸合成方向流动。Kimura等人1999年发现DtsR蛋白
(乙酰CoA羧化酶复合体e亚单位)活性的下降能引起ODHC活性的下降。DtsR蛋白 的编码基因是ctoi i,全长1632bp。
谷氨酸的高效合成还依赖于补缺途径提供充足的草酰乙酸和乙酰CoA，因为草酰乙 酸和乙酰CoA反应可以形成谷氨酸的前体柠檬酸(图1)。补缺途径被认为是谷氨酸棒 杆菌过量合成谷氨酸的瓶颈之一。在谷氨酸棒杆菌C. g/Wto/m'cWM中主要存在两个补缺 反应 一是由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)催化磷酸烯醇式丙酮酸生成草酰乙酸
(OAA); 二是丙酮酸羧化酶(PC)催化丙酮酸生成OAA。 PEPC的编码基因为/ ; c, 全长2760bp; PC编码基因为；7少c，全长3423bp。 PEPC的活性在谷氨酸棒杆菌中活性较 低，而且相对稳定，PC的活性则相对不稳定。代谢流分析发现在以葡萄糖酸盐或丙酮 酸为碳源进行氨基酸发酵时，PEPC和PC之间的碳流分布为10/90。研究还发现基因Ppc 缺失突变株与其野生型菌株相比，细胞生长和氨基酸合成都未受到影响，基因;^c的缺 失能明显降低细胞生长和氨基酸合成，因而PC催化的补缺反应在氨基酸生产中占主导 地位，是补充草酰乙酸的主要途径。
目前尚未有利用基因敲除技术敲除^fci 7与采用基因过表达技术过表达PC相结合 改造谷氨酸生产菌的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高产谷氨酸的基因工程菌。 本发明的另一个目的是提供上述基因工程菌的制备方法。 本发明还有一个目的是提供上述基因工程菌在生产谷氨酸中的应用。 本发明利用基因工程技术改造谷氨酸高产菌，通过基因敲除和过表达谷氨酸合成相
关限速酶基因，改变代谢流使其向谷氨酸合成方向流动，从而对菌种进行定向改造。 本发明的设计思想是在谷氨酸棒杆菌中敲除^fo/ /基因，即降低DtsR蛋白活性，
可以抑制ODHC的活性，从而使代谢流流向谷氨酸合成方向，提高谷氨酸产量。另外，在谷氨酸棒杆菌中过表达pyc基因可以提供充足的谷氨酸合成中需要的OAA,提高谷 氨酸合成产量。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的-
高产谷氨酸的基因工程菌，该菌是缺失cfc及/基因并过表达/7_yc基因的谷氨酸棒杆
菌。 -
所述的基因工程菌，其中使谷氨酸棒杆菌缺失dtsRl基因的方法包括以下步骤
a. 以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，扩增cfoi 7基因上下游片断，然后将该上下游片
断连接起来，形成^S及J基因缺失片段；
b. 将^^7基因缺失片段插入穿梭载体，构建^^7基因敲除载体；
c. 将构建的&^ /基因敲除载体导入谷氨酸棒杆菌，采用筛选培养基培养，所得的
克隆菌即为基因缺失的谷氨酸棒杆菌。
所述的基因工程菌，其中使谷氨酸棒杆菌缺失dtsRl基因的方法包括以下步骤
a. 以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，通过上游片断的引物SEQ IDNo.l和SEQ IDNo.2 以及下游片断引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4利用PCR法分别扩增cfo^基因上下游 片断，再通过引物SEQ ID No. 1和SEQ ID No.4采用overlap PCR法(重叠PCR法)将 cto/ /基因上下游片断连接起来，形成^fc/ 7基因缺失片段；
b. 利用￡.co/〃C g/wto/m'owj穿梭载体pK19mobsacB，插入ctei 7基因缺失片段形成
基因敲除载体；
c. 将&^ 7基因敲除载体导入谷氨酸棒杆菌，接种于含有卡那霉素的培养基培养，
挑选卡那抗性克隆菌再接种于含有蔗糖的培养基培养，挑选蔗糖抗性克隆菌，即得缺失 cfoi 7基因的谷氨酸棒杆菌。
所述的基因工程菌，其中ttoi /基因上游片断为Asi 7基因起始密码上游300~500bp 片断；ttoi 7基因下游片断为^fci 7基因终止密码下游300~500bp片断。
所述的基因工程菌，其中使谷氨酸棒杆菌过表达pyc基因的方法包括下列步骤
a. 以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，扩增/^c基因，将/7少c基因插入表达载体，构建
/7少C基因表达载体；
b. 将构建的;^c基因表达载体导入谷氨酸棒杆菌，抗性培养基培养所得抗性克隆菌 即为/ _yc基因过表达的谷氨酸棒杆菌。
所述的基因工程菌，其中使谷氨酸棒杆菌过表达; ;^基因的方法包括下列步骤 a.以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，通过上游引物SEQIDNo.5和下游引物SEQIDNo.6利用PCR法扩增/^c基因，将/^c基因插入表达载体pVWExl，构建； yc基因表
达载体5
b.将构建的;^c基因表达载体导入谷氨酸棒杆菌，接种于含有卡那霉素的培养基培 养所得抗性克隆菌即为得/^c基因过表达的谷氨酸棒杆菌。
更进一步，所述的基因工程菌，该基因工程菌是通过下列步骤制备得到的
a. 以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，通过上游片断的引物SEQ ID No.l和SEQ ID No.2 以及下游片断引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4利用PCR法分别扩增cfo及/基因上下游 片断，再通过引物SEQ ID No.l和SEQ ID No.4采用overlap PCR法将tto"基因上下游 片断连接起来，形成^tei /基因缺失片段；
b. 利用￡.co///C. g/wton/cwOT穿梭载体pK19mobsacB,插入cto/ 7基因缺失片段形成 基因敲除载体；
c. 以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，通过上游引物SEQ ID No.5和下游引物SEQ ID No.6利用PCR法扩增；7少c基因，将；;yc基因插入表达载体pVWExl,构建pyc基因表 达载体；
d. 将cfoi 7基因敲除载体导入谷氨酸棒杆菌，接种于含有卡那霉素的培养基培养， 挑选卡那抗性克隆菌再接种于含有蔗糖的培养基培养，挑选蔗糖抗性克隆菌，即得缺失 ^fci /基因的谷氨酸棒杆菌；然后将;y/c基因表达载体导入缺失cfci 7基因的谷氨酸棒杆 菌，接种于含有卡那霉素的培养基培养，挑选卡那抗性克隆菌即得缺失^fo及/基因且过 表达基因的谷氨酸棒杆菌。
所述的基因工程菌的制备方法，包括下列步骤
a. 以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，扩增^yi 7基因上下游片断，然后将该上下游片 断连接起来，形成^"i 7基因缺失片段；
b. 将^^/基因缺失片段插入穿梭载体，构建^fo/ 7基因敲除载体；
c. 以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，扩增pw基因，将/^c基因插入表达载体，构建
/^C基因表达载体；
d. 将构建的^fci 7基因敲除载体导入谷氨酸棒杆菌，采用筛选培养基培养，所得的 克隆菌即为^fc及7基因缺失的谷氨酸棒杆菌，再将p_yC基因表达载体导入cfci 7基因缺 失的谷氨酸棒杆菌，抗性培养基培养所得抗性克隆菌即为cfoi 7基因缺失且过表达pyc 基因的谷氨酸棒杆菌。
更进一步，所述的基因工程菌的制备方法，具体包括下列步骤a. 以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，通过上游片断的引物SEQ ID No.l和SEQ ID No.2 以及下游片断引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4利用PCR法分别扩增cfo及7基因上下游 片断，再通过引物SEQ ID No.l和SEQ ID No.4采用overlap PCR法将ctoi /基因上下游 片断连接起来，形成^fo/ /基因缺失片段；
b. 利用Eco///C. g/wtoAm'o/w穿梭载体pK19mobsacB，插入cto/ /基因缺失片段形成 基因敲除载体
c. 以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，通过上游引物SEQIDNo.5和下游引物SEQID No.6利用PCR法扩增/^c基因，将；^c基因插入表达载体pVWExl，构建；7yc基因表 达载体
d. 将cfo/^基齿敲除载体导入谷氨酸棒杆菌，接种于含有卡那霉素的培养基培养， 挑选卡那抗性克隆菌再接种于含有蔗糖的培养基培养，挑选蔗糖抗性克隆菌，即得缺失 ^foi /基因的谷氨酸棒杆菌；然后将p_yc基因表达载体导入缺失^fc/ 7基因的谷氨酸棒杆
菌，接种于含有卡那霉素的培养基培养，挑选卡那抗性克隆菌即得缺失ctoi /基因且过
表达pyc基因的谷氨酸棒杆菌。
所述的基因工程菌在生产谷氨酸中的应用。 具体的筛选培养基的选择可根据使用的载体或菌株的特性确定。如卡那抗性培养基
(含50pg/ml-10(Vg/ml卡那霉素)、含蔗糖的培养基(含10%-40%蔗糖)， 本发明有益效果
本发明利用基因工程技术构建了一株新型谷氨酸高产菌株，该菌株命名为Ad-pyc。 本发明以基因敲除技术和蛋白表达技术改造谷氨酸合成代谢流，提高谷氨酸产量。谷氨 酸发酵实验显示，菌株Ad-pyc在生物素过量培养时就产生较高浓度(80.0mM)的谷氨 酸，而野生型谷氨酸棒杆菌在此条件下不合成谷氨酸。在生物素限量和Tween40添加等 诱导条伴又能进--步提高谷氨酸产量，Ad-pyc在这两种诱导条件下的产量比野生型在 同等条件下分别提高了 13%和18%。
本发明首次将基因敲除技术和蛋白表达技术用于谷氨酸高产菌的构建，为改造谷氨 酸高产菌提供一种新的方法。本发明首先用基因敲除技术将抑制谷氨酸合成的DtsR蛋 白进行敲除，再用过表达载体表达谷氨酸合成补缺途径中的PC，以此来定向优化谷氨 酸合成代谢途径，使代谢流大量流向谷氨酸合成方向，提高谷氨酸产量。
图1:谷氨酸的生物合成途径。图2:基因敲除载体pK19ms-Ad酶切鉴定M， DNAmarker; 1, HindIII酶切过的 阳性克隆DNA。
图3:基因过表达载体pVWExl-pyc酶切鉴定M, DNA marker; 1, Pstl和Sail 双酶切过的阳性克隆DNA。
图4:基因缺失克隆Ad southern blot鉴定图1，野生型的杂交信号；2，厶d的杂 交信号。
图5:生物素过量条^l^下谷氨酸发酵生产实验(a)野生型菌株在生物素过量条件
下的生长，葡萄糖消耗和谷氨酸生产；(b)谷氨酸基因工程高产菌Ad-pyc在生物素过量 条件下的生长，葡萄糖消耗和谷氨酸生产；"代表菌体OD6oo; A代表谷氨酸生产；夸代
表葡萄糖消耗。 '
图6:生物素限量条件下谷氨酸发酵生产实验(a)野生型菌株在生物素限量条件
下的生长，葡萄糖消耗和谷氨酸生产；(b)谷氨酸基因工程高产菌Ad-pyc在生物素限量 条件下的生长，葡萄糖消耗和谷氨酸生产；"代表菌体OD6oo; A代表谷氨酸生产；夸代
表葡萄糖消耗。
图7: Tween40添加条件下谷氨酸发酵生产实验(a)野生型菌株在Tween40添加 条件下的生长,葡萄糖消耗和谷氨酸生产;(b)谷氨酸基因工程高产菌Ad-pyc在Tween40 添加条件下的生长，葡萄糖消耗和谷氨酸生产；"代表菌体OD^; A代表谷氨酸生产； 命代表葡萄糖消耗。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述
实施例1、基因敲除载体pK19ms-Ad和基因过表达载体pVWExl-pyc的构建 1). PCR扩增cfc/ /基因上、下游片段用基因组DNA提取试剂盒(Promega公司 产品)提取野生型谷氨酸棒杆菌C.g/wto加'cw/wATCC 13032 (ATCC购买)的基因组。根 据Gene Bank中C. g/^aw/cwm ATCC13032全基因组序列(Gene Bank No: NCgl0678) 设计引物。以抽提的基因组为模板，Al (SEQIDNo.l)和A2 (SEQIDNo.2)为引物， 在Taq酶(Takara公司产品)作用下PCR扩增cfo/ 7基因上游片段(血W基因起始密 码上游400bp)， PCR参数为95°C 30s， 54。C 40s, 72°C 25s，共26个循环。以A3 (SEQ ID No.3)禾Q A4 (SEQ ID No.4)为引物，PCR扩增基因下游片段(^fo/ 7基因终 止密码下游400bp)， PCR参数为95°C 30s， 56。C 40s， 72°C 25s,共26个循环。上述 引物序列分别为Al: AAGCTTGCGGCTCTCTGGATCGTG (下划线为HindIII酶切位点) A2: CGC4G7^CGCrCC4CCGA47^CGGTGCCGTCC (斜体为互补序列) A3: CCG7M7TCGGrG04GCG7^CrGCGTGATGGGTTC (斜体为互补序列) A4: AAGCTTCAGTGGCATGTGGCCGTGC (下划线为HindIII酶切位点) 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，^s及7基因上、下游片段大小均为400bp。然后 用胶回收试剂盒(上海申能博彩产品)进行割胶回收。
2) .overlapPCR连接必i /基因上、下游片段以l)扩增的上下游片段(按1:1混合) 为模板，Al和A4为引物PCR扩增，PCR参数为95'C 30s， 5TC 40s， 72'C 40s,共 30个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，大小为800bp，并割胶回收。将回收片段和 pMD19-T (Takara公司产品)按5:1连接过夜，转化DH5a感受态，挑取氨苄抗性克隆， 菌落PCR鉴定pMD19-T中是否插入回收的PCR片段。通过测序(Invitrogen公司测定) 鉴定插入的PCR片段确实为ifc/2/基因上、下游连接片段。
3) .基因敲除载体pK19ms-Ad的构建:将2)中插入连接片段的pMD19-T载体用Hind III (Takara公司产品)酶切，37'C保温3小时，将切出的连接片段(800bp)进行电泳 回收。同时将载体pK19mobsacB (Eggeling L， Bott M. Handbook of C。7"e6a"e〃'wm g/wtow/cww. CRC press, Boca Raton, FL, USA 2005)用HindIII酶切，37'C保温2小时， 电泳回收，并将回收的载体片断用碱性磷酸酶(CIAP) (Takara公司产品)进行去磷酸 化反应，以防止载体自连。将回收的连接片段和载体片段按7:1连接过夜，转化DH5a 感受态，挑取卡那抗性克隆，菌落PCR初步鉴定阳性克隆，提取阳性克隆质粒，酶切 进一步鉴定(见图2)。将构建好的基因敲除载体命名为pK19ms-Ad。.
4) .基因过表达载体pVWExl-pyc的构建以l)提取的基因组为模板，Bl (SEQID No.5)和B2 (SEQIDNo.6)为引物，扩增/^c基因，PCR扩增参数为95°C 30s， 51 。C 40s,72。C 2min,共28个循环。引物序列如下
Bl: GTTGTTCTGCAGTCTGCAGGTGGAAGC (下划线为Pstl酶切位点) B2: GTTGTTGTCGACCCCTTCGTGCGGC (下划线为Sail酶切位点) 扩增出的PCR产物大小为3423bp，电泳回收后经PstI和Sall双酶切，与经同样双 酶切的载体pVWExl (Peters-Wendisch PG, Schiel B， Wendisch VF, Katsoulidis E, Mokel B, Sahm H, Eikmanns BJ. Pyruvate carboxylase is a major bottleneck for glutamate and lysine production by Co，e6a"m'簡g/wfamz'c訓.J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2001， 3: 295-300)按7:1连接过夜，转化DH5a感受态，挑取卡那抗性克隆，提取阳性克隆质粒，酶切鉴定(见图3)。将构建好的基因过表达载体命名为pVWExl-pyc。 实施例2、 cfoi 7基因缺失的谷氨酸棒杆菌Ad的制备
1) .谷氨酸棒杆菌感受态的制备挑取新鲜平皿上谷氨酸棒杆菌ATCC13032，接种 入含0.5% (质量体积比)葡萄糖的2ml液体LB培养基中，30'C, 200r/min培养12小 时，再按1%(接种量与培养基的体积百分比)接种到含3% (质量体积比)甘氨酸和0.1%
(体积比)Tween80的50ml LB中，使起始0D6Q。达到0.3，在30'C中继续培养至OD600 达到0.9。将菌液冰浴15分钟，离心收集菌体，用预冷的10%(体积百分比)甘油重悬细 胞，用1.5ml离心管分装，每管80pl。将感受态细胞放-7(TC冰箱保存或直接用于电击转 化。
2) .电击转化质粒pK19ms-Ad:将感受态细胞从冰箱中拿出并于冰水中融化，添加 l-5^质粒pK19ms-Ad入感受态细胞中，混匀。将混合液转移至O.lcm电击杯(BioRad 公司产品)中，于1.8kv,5ms条件下在电击仪(BioRad公司产品)上电击，然后立即加 入含0.5% (质量体积比)葡萄糖的lml液体LB培养基，轻轻混匀。将混合液转入1.5ml 离心管中，46'C水浴6分钟，3(TC水浴1小时，离心浓縮菌体至100-200^1。将菌体混 匀后涂布在含0.5%葡萄糖和25pg/ml卡那霉素的固体LB培养基上，3(TC于温箱中培养 36小时。
3) .^foi /基因缺失的谷氨酸棒杆菌Ad的制备首先用卡那抗性筛选，如2)所述， 将电转后的菌体涂布在含卡那抗性的固体LB培养基上，挑选抗性克隆，提取克隆的基 因组，进行PCR鉴定阳性克隆。以A1/A4为引物扩增，PCR参数为95'C 30s,51'C 40s, 72'C lmin40s,共26个循环。PCR扩增产物为800bp片段和2600bp片段的克隆为阳性 克隆，因为质粒整合入基因组DNA后会扩增出两种不同大小的片段。将挑选出的阳性 克隆接种入含卡那的液体LB培养基中培养过夜，将过夜菌涂布在含10%(质量体积比) 蔗糖的固体LB培养基上培养36小时。由于pK19mobsacB载体上sacB基因在谷氨酸棒 杆菌中的表达产物使其不能在含蔗糖培养基上生长，所以蔗糖筛选压力就促使载体 pK19mobsacB携带目的基因脱离基因组DNA。将在含蔗糖培养基上长出的克隆的基因 组提取出来，以A1/A4为引物PCR扩增，参数同上。PCR扩增产物只有800bp片段的 克隆为阳性克隆，即cfei^基因缺失克隆，命名为Ad。
4) .southem blot (southern印迹法)鉴定afoW基因缺失克隆Ad:提取3)筛选的tfc/ 7 基因缺失克隆的基因组，将基因组DNA用BamHI酶切，37'C保温4小时，然后进行0.8% (质量体积比)琼脂糖凝胶(不加染色液EB)电泳。将凝胶浸泡于变性液中1小 时，接着用去离子水漂洗l次，加入中和液30分钟。将凝胶放在铺有滤纸的平台上， 平台置于盛满转移液的盒子中，然后将用转移液浸泡过的尼龙膜放在凝胶上，再用滤纸 覆盖在尼龙膜上(约5-8厘米厚)，其上再压一重物。放置过夜，将DNA转移到尼龙膜 上。用地高辛标记检测试剂盒(Roche公司产品)标记尼龙膜上的DNA并与探针杂交 检测杂交信号(见试剂盒操作说明书)。缺失&^ 7基因的谷氨酸棒杆菌Ad杂交出1900bp 大小的信号，而野生型杂交出3600bp大小的信号(见图4)。
变性液L5mol/LNaCl，0.5mol/LNaOH;
中和液lmoI/LTris-Cl， 1.5mol/LNaCl
转移液3mol/L NaCl; 0.3mol/L梓檬酸钠；pH7.0
实施例3、 ^fci /基因缺失且过表达PC的谷氨酸棒杆菌厶d-pyc的制备
1) .Ad-pyc的制备将构建好的载体pVWExl-pyc电击转入菌株Ad中(方法见实施 例2)，用卡那抗性筛选阳性克隆。将在卡那平板上长出的克隆接种入含卡那抗性的液体 LB中培养过夜，用质粒提取试剂盒(Promega公司产品)提取质粒，琼脂糖凝胶电泳 结果显示其大小与电转前质粒大小一致，说明过表达载体pVWExl-pyc成功转入菌株A d中，将筛选出的&^ /基因缺失且过表达PC的谷氨酸棒杆菌命名为Ad-pyc。
2) .PC活性的测定将Ad-pyc按l: 30(接种量与培养基的体积比)接种入含卡那的 液体LB中，3(TC震荡培养至OD6(X)达到0.6 (或0.4-0.6)，加入终浓度为lmM异丙基 硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，24'C继续震荡培养4小时。取5ml菌液超声破碎，离 心去上清即粗酶液。粗酶液加入100mM TES-NaOH (PH 7.6), 25mM NaHC03, 20mM丙 酮酸,4mM ATP, 2mM谷氨酸,20pM磷酸吡眵醛和2个单位猪心谷草转氨酶(GOT)， 混匀3(TC反应3分钟。反应生成的天冬氨酸经异硫氰酸苯酯(PITC)衍化后，再由高 效液相色谱仪分析得到PC的活性。菌株Ad-pyc中PC活性为91 U/mg，而野生型仅为 35 U/mg，与野生型相比，Ad-pyc中PC的活性提高了近3倍，说明基因p_yc在谷氨酸 棒杆菌中得到高效地表达。
实施例4、厶d-pyc的发酵实验 l).三种发酵培养基
生物素过量培养基GH1: 30 g/L葡萄糖，15 g/L (NH4)2S04, 1 g/L KH2P04， 0.4 g/LMgS04 ' 7H20, 0.01 g/L FeS04 . 7H20， 0.01 g/L MnS04 4H20， 200pg/L维生素Bi, 300 pg/L生物素，1.4。/。(体积百分比)大豆蛋白水解物和50g/LCaCO3[单独除菌]，调节pH 至8.0。(单独除菌是指50g/LCaCO3部分。大豆蛋白水解物是市场可以买到的产品， 厂家上海西王淀粉糖有限公司，产品编号S2008092351394)
生物素限量培养基GH2: 50g/L葡萄糖，不含生物素，其余同GH1培养基。 添加Tween40培养基GH3: 50 g/L葡萄糖，30 g/L (NH4)2S04和60pg/L生物素，5 mg/mlTween40,其余同GH1培养基。
2).葡萄糖和谷氨酸含量测定将野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032和Ad-pyc分别在 上述三种发酵培养基中培养，定时取发酵液在高效液相色谱仪上分析葡萄糖和谷氨酸含 量。谷氨酸测定前需要经邻苯二醛(OPA)衍化，色谱柱型号为Shim-Pack CLC-ODS 250 mmX4mm, 5pm，流动相A为0.1 M KC2H302 (pH 5.89),流动相B为甲醇，流速为1 m卜min"，柱温为40'C,在210nm处测吸收值。葡萄糖测定的色谱柱型号为Aminex HPX-87H, 7.8 mmX300 mm,流动相为0.005M H2S04，流速为0.5 ml min"，柱温为 55°C，用示差检测器检测。构建的基因工程菌Ad-pyc在生物素过量条件下就能生产谷 氨酸，发酵28小时后谷氨酸浓度达到80.0mM，而同等条件下野生型不产谷氨酸(见图 5)。说明通过改变和优化代谢流就可以使谷氨酸棒杆菌在非诱导条件下生产谷氨酸。同 时，生物素限量和Tween40添加等诱导条件又能进一步提高谷氨酸产量，Ad-pyc在这 两种诱导条件下的产量比野生型在同等条件下分别提高了 13%和18% (见图6和图7)。 这就为工业大规模生产谷氨酸提供了一种新菌株，同时为筛选谷氨酸高产菌提供一个新 方法。〈110〉中国药科大学中国人民解放军南京军区军事医学研究所
〈120〉谷氨酸基因工程高产菌及其应用 <160>6
〈210〉1
〈211>14
〈212>DNA
〈213〉人工序列
<220>
<223>上游引物 <400〉1
aagcttgcgg ctctctggat cgtg 14
<210>2
〈211〉32
<212>DNA
<213>人工序列
<220〉
<223〉下游引物 <400>2
cgcagtacgc tccaccgaat acggtgccgt cc 32
〈210>3
<211>34
<212〉陽
<213〉人工序列
<220>
〈223〉上游引物 <400〉3
ccgtattcgg tggagcgtac tgcgtgatgg gttc 34
<210〉4
<211>25
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈223>下游引物 <400〉4
aagcttcagrggcatgtggc cgtgc 25 〈210>1〈211〉27 〈212〉DNA 〈213〉人工序列 <220〉
<223〉上游引物 <400>1
gttgttctgc agtctgcagg tggaagc 27
<210>6
<211〉25
<212〉腿
〈213>人工序列
〈220>
〈223>下游引物 <400〉6
gttgttgtcg accccttcgt gcggc 2权利要求
1. 一种产谷氨酸的基因工程菌，其特征在于该菌是缺失dtsR1基因并过表达pyc基因的谷氨酸棒杆菌。
2. 根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于使谷氨酸棒杆菌缺失dtsRl基因的方法包括以下步骤a. 以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，扩增ctoi^基因上下游片断，然后将该上下游片 断连接起来，形成^^/基因缺失片段；b. 将^^7基因缺失片段插入穿梭载体，构建^foi 7基因敲除载体；c. 将构建的^^7基因敲除载体导入谷氨酸棒杆菌，采用筛选培养基培养，所得的 克隆菌即为^foi /基因缺失的谷氨酸棒杆菌。
3. 根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于使谷氨酸棒杆菌缺失dtsRl基因的方法包括以下步骤a. 以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，通过上游片断的引物SEQ ID No.l和SEQ ID No.2 以及下游片断引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4利用PCR法分别扩增tfoi /基因上下游 片断，再通过引物SEQ ID No.l和SEQ ID No.4采用overlap PCR法将flfe及7基屈上下游 片断连接起来，形成itoi /基因缺失片段；b. 利用￡.co///C. g/wtow/cww穿梭载体pK19mobsacB，插入cfo^基因缺失片段形成 基因敲除载体；c. 将ctoi /基因敲除载体导入谷氨酸棒杆菌，接种于含有卡那霉素的培养基培养， 挑选卡那抗性克隆菌再接种于含有蔗糖的培养基培养，挑选蔗糖抗性克隆菌，即得缺失 必M7基因的谷氨酸棒杆菌。
4. 根据权利要求2或3所述的基因工程菌，其特征在于cfci /基因上游片断为cfoi 7 基因起始密码上游300~500bp片断；cfci 7基因下游片断为d"及7基因终止密码下游 300 500bp片断。
5. 根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于使谷氨酸棒杆菌过表达;^c基因 的方法包括下列步骤a. 以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，扩增pw基因，将/^c基因插入表达载体，构建 基因表达载体；b. 将构建的; w基因表达载体导入谷氨酸棒杆菌，抗性培养基培养所得抗性克隆菌即为过表达p_yc基因的谷氨酸棒杆菌。
6. 根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于使谷氨酸棒杆菌过表达;^c基因的方法包括下列步骤a. 以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，通过上游引物SEQIDNo.5和下游引物SEQID No.6利用PCR法扩增pyc基因，将基因插入表达载体pVWExl,构建/ _yc基因表 达载体ib. 将构建的/^c基因表达载体导入谷氨酸棒杆菌，接种于含有卡那霉素的培养基培 养所得抗性克隆菌即为过表达/^c基因的谷氨酸棒杆菌。
7. 根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于该基因工程菌是通过下列步骤制备得到的a. 以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，通过上游片断的引物SEQ ID No.l和SEQ ID No.2 以及下游片断引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4利用PCR法分别扩增cfo及7基因上下游 片断，再通过引物SEQ ID No.l和SEQ ID No.4采用overlap PCR法将cfo/ /基因上下游 片断连接起来，形成&^ 7基因缺失片段；b. 利用￡co"/C. 穿梭载体pK19mobsacB，插入ctei /基因缺失片段形成 ^^/基因敲除载体；c. 以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，通过上游引物SEQ ID No.5和下游引物SEQ ID No.6利用PCR法扩增p少c基因，将/ _yc基因插入表达载体pVWExl，构建p_yc基因表 达载体；d. 将ifci /基因敲除载体导入谷氨酸棒杆菌，接种于含有卡那霉素的培养基培养， 挑选卡那抗性克隆菌再接种于含有蔗糖的培养基培养，挑选蔗糖抗性克隆菌，即得缺失 力5i 7基因的谷氨酸棒杆菌；然后将/ yc基因表达载体导入缺失cfo及/基因的谷氨酸棒杆 菌，接种于含有卡那霉素的培养基培养，挑选卡那抗性克隆菌即得缺失^"i 7基因且过 表达/^c基因的谷氨酸棒杆菌。
8. 如权利要求l所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于包括下列步骤-a. 以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，扩增^^/基因上下游片断，然后将该上下游片 断连接起来，形成cfoW基因缺失片段；b. 将ctei 7基因缺失片段插入穿梭载体，构建ctei /基因敲除载体；c. 以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，扩增;^c基因，将;^c基因插入表达载体，构建 /^c基因表达载体；d.将构建的cfc/ 7基因敲除载体导入谷氨酸棒杆菌，采用筛选培养基培养，所得的 克隆菌即为ifei /基因缺失的谷氨酸棒杆菌，再将基因表达载体导入力^ 7基因缺 失的谷氨酸棒杆菌，采用筛选培养基培养，所得抗性克隆菌即为cto及7基因缺失且过表 达j^c基因的谷氨酸棒杆菌。
9、 根据权利要求8所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于包括下列步骤a. 以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，通过上游片断的引物SEQ ID No.l和SEQ ID No.2 以及下游片断引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4利用PCR法分别扩增^fci 7基因上下游 片断，再通过引物SEQ ID No.l和SEQ ID No.4采用overlap PCR法将d"及/基因上下游 片断连接起来，形成^te及7基因缺失片段；b. 利用￡.co/Z/C. g/wtow/o/w穿梭载体pK19mobsacB，插入ite及7基因缺失片段形成 ^^7基因敲除载体；c. 以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，通过上游引物SEQIDNo.5和下游引物SEQID No.6利用PCR法扩增/7yc基因，将pyc基因插入表达载体pVWExl ，构建p少c基因表 达载体；d. 将d"i 7基因敲除载体导入谷氨酸棒杆菌，接种于含有卡那霉素的培养基培养， 挑选卡那抗性克隆菌再接种于含有蔗糖的培养基培养，挑选蔗糖抗性克隆菌，即得缺失 ttei /基因的谷氨酸棒杆菌；然后将;^c基因表达载体导入缺失ctoi /基因的谷氨酸棒杆 菌，接种于含有卡那霉素的培养基培养，挑选卡那抗性克隆菌即得缺失ctoi /基因且过 表达p;/c基因的谷氨酸棒杆菌。
10、 权利要求1所述的基因工程菌在生产谷氨酸中的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，公开了谷氨酸基因工程高产菌及其应用。该菌是缺失dtsR1基因并过表达pyc基因的谷氨酸棒杆菌。本发明采用载体pK19mobsacB将谷氨酸棒杆菌的基因dtsR1敲除，分别使用卡那抗性和蔗糖作为选择压力，获得基因敲除菌株Δd，再利用载体pVWEx1将pyc基因导入Δd中过表达丙酮酸羧化酶，通过基因敲除技术和基因过表达定向改造优化谷氨酸生物合成途径，构建基因工程菌Δd-pyc。该菌能提高谷氨酸产量，可用于工业上大规模生产谷氨酸。
文档编号C12N15/09GK101418277SQ20081023625
公开日2009年4月29日 申请日期2008年11月27日 优先权日2008年11月27日
发明者玉 刘, 姚文娟, 云 张, 王忠灿, 邓小昭, 辉 钟 申请人:中国药科大学;中国人民解放军南京军区军事医学研究所