专利名称：一种高产嗜盐脂肪酶的嗜盐古生菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高产嗜盐脂肪酶的极端嗜盐菌菌株，属生物技术领域。
背景技术：
脂肪酶广泛应用于洗涤剂、食品、医药、制革、纺织等领域。脂肪酶生物技术应用于 被污染环境的生物修复以及废物处理是一个新兴的领域。石油开采和炼制过程中产生的油 泄漏，油脂加工过程中产生的含脂废物以及饮食业产生的废物，都可以用不同来源的脂肪 酶进行有效的处理。脂肪酶在生物修复受污染环境中获得了广泛应用。一项欧洲专利报道 了利用脂肪酶抑制和去除冷却水系统中的生物膜沉积物。随着海水代用工程的发展，高盐污水的生物处理成为研究的热点，而普通微生物 及其酶类在高盐条件下的应用受到限制，嗜盐菌及其嗜盐脂肪酶的应用将为高盐污水处理 提供新的工具。极端嗜盐菌是生长在高盐极端环境的一类微生物，主要存在于盐湖、盐碱湖、盐 沼、死海和盐场等环境中。Baratti等人2006年首次报道了嗜盐古生菌Natronococcus sp.产嗜盐脂肪酶，酶活力达到50U/L。所以拓宽嗜盐脂肪酶的来源，提高产酶能力以提高 其应用价值成为研究的热点，
发明内容
要解决的问题本发明的目的是提供一种可以在高盐发酵培养基中大量积累脂肪酶的 Haloterrigena sp.属嗜盐古生菌菌株。
发明内容
本发明的发明人从来自盐湖的菌种样品中筛选获得了一株嗜盐脂肪酶产生菌，对 这株菌进行了发酵研究。脂肪酶产生菌筛选培养基和发酵培养基筛选培养基(g/L)=NaCl 200. 0 ；KCl 2. 0 ；MgSO4. 7H20 20. 0 ；FeSO4. 7H20 0. 04 ；酪 蛋白氨基酸7. 5 ；酵母粉10. 0 ；柠檬酸三钠3. 0 ；橄榄油10. 0若丹明Bi. 0 ；pH 7. 5发酵培养基(g/L)=NaCl 200. 0 ；KCl 2. 0 ；MgSO4. 7H20 20. 0 ；FeSO4. 7H20 0. 04 ；酪 蛋白氨基酸7. 5 ；酵母粉10. 0 ；柠檬酸三钠3. 0 ；橄榄油10. 0 ；pH 7. 5经过平板初筛和摇瓶复筛获得的嗜盐古生菌在高盐培养基上生长良好，菌落表面 光滑，边缘整齐，红色。革兰氏染色阴性，镜检为杆状。为鉴定其类型，分别对其进行了分子 鉴定和生理生化鉴定，该菌好氧或兼性厌氧，生长温度范围为30 60°C，最适生长温度为 420C ；适宜生长pH范围6. 0 9. 0，最适生长pH 7. 0 ；在0. 5 5. 2mol/L NaCl范围内均能 生长，最适生长浓度为3. 5mol/L。该菌仅能较好的利用蔗糖、果糖，淀粉水解试验、明胶水解 试验、酪素降解试验、硝酸盐还原试验呈阳性；喷哚试验、过氧化氢酶试验、硫化氢试验呈阴 性。该菌株16S rDNA全长序列为1581bp (GenBank登录号EU557270)，与具有最高同源性的菌株 Haloterrigena thermotolerans strain IOR (GenBank 登录号AY994199) 的相似度为 99%，结合形态特征和生理生化特性，将其鉴定为嗜盐古生菌Haloterrigena sp.，命名为 Haloterrigena sp. Z4。该生物材料保藏信息该极端嗜盐菌的分类名称为Haloterrigena thermotolerans，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心简称中国 微生物菌种保藏中心，地址为北京市朝阳区大屯路(中科院微生物研究所)，保藏日期为 2008年4月21日，保藏编号CGMCC No2463。在发酵研究过程中发现，该菌可以以橄榄油、花生油、芝麻油、菜籽油、茶油为诱导 物产脂肪酶，添加橄榄油，42°C、pH 7. 5、妝(1浓度3.511101/1时产酶最高，达到22~ ml 。
图1不同诱变物对产酶的影响图2NaCl浓度、pH和温度对产酶的影响有益效果提供了一种具有工业应用潜力的高产嗜盐脂肪酶的优良菌株。
具体实施例方式实施例1 嗜盐脂肪酶高产菌株的筛选将菌种转接活化，37°C培养，挑取单菌落并点种于橄榄油_若丹明B平板37°C培 养7 14天，挑选有荧光圈的菌落经划线分离后获得单菌落，接种于斜面培养基保存并进 行摇瓶发酵复筛。实施例2 脂肪酶酶活的测定脂肪酶酶活的测定采用比色法，其原理是p-NPB在脂肪酶的催化下分解生成一 分子对硝基苯酚，对硝基苯酚在410nm处有最大吸收峰，通过测量反应液在410nm处的吸光 值，可定量测定P-NPB氧化量，从而计算出脂肪酶的酶活单位。测定方法参考文献进行，具体如下溶液Α:176μ1 ρ-ΝΡΒ溶于IOmL异丙醇，4°C保存溶液B :pH 8. 0，50mM Tris-HCl 缓冲液使用时将溶液A与溶液B按1 :9的体积比混合，配成3. 6mL底物反应液，加入 400 μ 1粗酶液，37°C反应lOmin，在410nm测吸光值。脂肪酶1个酶活单位的定义每分钟释放1 μ mol对硝基苯酚所需的酶量。酶活(U/ml)= (A410-O. 1084) X 2. 5 + 0. 0511实施例3 :16s rDNA菌种鉴定取指数生长期新鲜菌液，离心收集菌体，按基因组抽提试剂盒提取基因组DNA。扩 增用引物为古生菌通用引物，如下P1 正向引物 5 ‘ -ATTCCGGTTGATCCTGC-3 ‘P2 反向引物 5 ‘ -AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3 ‘PCR反应采用50 μ 1的体系，具体如下IOXbuffer5ul
dNTPs (2. 5mM)P1(IOpM)P2(IOpM)Taq DNA 聚合酶(5U/ul)Template DNAddH20
4ul 2ul 2ul
0. 6ul Iul
35. 4ulPCR扩增条件95°C变性lmin，50°C退火45s，72°C延伸90s，50 μ L体系，30个循 环。PCR扩增产物的纯化按上海生工生物技术公司的小量胶回收PCR产物纯化试剂盒说明， 测序由上海生工生物技术公司完成。经测序后获得的16S rDNA序列，在GenBank中进行BLAST比对确定其种属。
实施例4 发酵过程研究摇瓶培养方法斜面种子活化后接入种子培养基，培养12h，按10%接种量接入发 酵培养基进行产酶培养。不同诱导物对产酶的影响种子培养基中添加不同浓度的诱导物，37°C摇瓶发酵 84h，测定发酵液脂肪酶活力，以不添加诱导物的做为对照。温度对产酶的影响分别在30、37、42、50、60°C摇瓶发酵84h，测定发酵液脂肪酶 活力，绘制产酶曲线。初始pH对产酶的影响发酵培养基初始pH分别为4、5、6、7、7. 5、8、9、10、11，37°C 摇瓶发酵84h，测定发酵液脂肪酶活力，绘制产酶曲线。盐浓度对产酶的影响发酵培养基NaCl浓度分别为0. 5、1. 5、2. 5、3. 5、4. 5、 5. 2mol/L，37°C摇瓶发酵84h，测定发酵液脂肪酶活力，绘制产酶曲线。
权利要求
一种能高产嗜盐脂肪酶的属于Haloterrigena sp.属的极端嗜盐菌菌株。
2.如权利要求1的菌株，其具有以下特征a.可以在0.5 5. 2mol/L NaCl浓度培养基中生长。b.在以橄榄油为诱导物的高盐发酵培养基中大量积累嗜盐脂肪酶。c.所产脂肪酶具有显著的嗜盐特点，在0.5 5. 2mol/L NaCl环境中均保持高活性。
3.如权利要求1的菌株，其是能产嗜盐脂肪酶的Haloterrigenasp.属的极端嗜盐菌。
全文摘要
本发明属生物技术领域，具体涉及一种能产嗜盐脂肪酶的属于Haloterrigena sp.属的红色嗜盐古生菌菌株。本发明的菌株是从内蒙古锡林浩特地区盐湖中筛选得到的。发酵研究发现以1％橄榄油为诱导物该红色菌株的产脂肪酶活力达到25U/ml。
文档编号C12N1/20GK101892169SQ20081023585
公开日2010年11月24日 申请日期2008年11月28日 优先权日2008年11月28日
发明者张晓梅, 张萌, 窦文芳, 许正宏, 许泓瑜 申请人:江南大学