专利名称：：大白菜核质互作雄性不育的srap标记及其用于辅助选择育种的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于农业的蔬菜品种选育与生物
技术领域：
，涉及白菜的品种选育和分子标记辅助选择育种方法，特别是一种大白菜核质互作雄性不育的SRAP标记及其用于辅助选择育种的应用。近三十多年以来，植物雄性不育一直是作物遗传育种、生物学研究的热门领域。细胞质雄性不育(cytoplasmicmalesterility,CMS)是其中最有利用价值的雄性不育类型。而以叶球为产品的大白菜，虽然不需要恢复系，利用方便，但用携带恢复基因的材料选育不育系程序麻烦、周期长，采用分子标记技术可以在苗期判断是否带有可育基因和不育基因、加快选育步伐。西北农林科技大学园艺学院蔬菜科学系自20世纪70年代开展大白菜雄性不育研究，先后育成了CMS3411-7和CMS7311等不同来源、不同性状的大白菜异源胞质雄性不育系，并应用于杂交一代大白菜制种。由于传统的育性表型选择要等到开花，通过田间直接观察完成。对于携带恢复基因的优良材料，要将其转育为不育系，必须经过杂交，自交，同时用不育系测交判断其基因型等过程，操作起来费时费力，周期长，育种进程慢。为了加快大白菜胞质雄性不育育种速度，采用现代生物技术，进行分子标记辅助育种十分迫切。分子标记是近年来研究的热门领域，它以DNA为研究对象，具有以下显著的优越性(1)直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否的问题；(2)数量极多，遍及整个基因组，可检测到的基因座位几乎是无限的；(3)多态性高，自然界存在着许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；(4)表现为"中性"，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；'(5)有许多分子标记表现为共显性(codominance),能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息，因而现已形成许多分子标记系统。SRAP(Sequence-relatedamplifiedpolymorphism,SRAP)是由美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros博士于2001年提出，又叫基于序列扩增多态性(sequencebasedamplifiedpolymorphism,SBAP)，作为——禾中新的分子标记技术，SRAP具有简便、稳定、中等产率的特点，在基因组中分布均匀，高频率的共显性则明显优于AFLP标记。SRAP是基于PCR的分子标记技术，具有与RAPD同样的操作简便性，仅在扩增产物的检测上采用较复杂的聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染技术，但是与琼脂糖凝胶检测相比，分辨率大大提高，而且不使用溴化乙锭，不会造成环境污染，减少操作危险性。多次重复试验结果稳定，克服了RAPD重复性稳定性差的缺点。与AFLP相比，它无须繁琐的操作，成本较低。SRAP的上游引物和下游引物可以通用，两两搭配组合，省却了引物开发的困难，减少了合成引物的费用，同时也大大提高了引物的使用率。总之，分子标记不受基因表达时间、显隐关系、环境因素等条件影响，利用与目标性状紧密连锁的分子标记可在生育早期阶段进行选择，减少了选择的盲目性，縮短了育种年限，从而可以大大提高育种效率，加快育种进程。
发明内容本发明的目的在于。提供一种大白菜核质互作雄性不育的SRAP标记及其采用该SRAP标记用于辅助选择育种的应用。本发明采用SRAP技术，寻找与育性基因紧密连锁的SRAP分子标记，为开展大白菜核质互作雄性不育分子标记辅助育种奠定基础。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案一种大白菜核质互作雄性不育的SRAP标记，其特征在于，该SRAP标记是特异片断Rf24-5-3和特异片断ms16-23-3，特异片断Rf24_5-3的全长为366bp，特异片断msl6-23-3的全长为372bp，其核酸序列分别为特异片断Rf24-5-3:7!S46Ta:AWa;6^4/47GCTAACCTAACCGACTATTMCTAATTTACTGTAGTTGGGCTTGTTTGGGCTTAGTTGGACTCTTGTCTCTTTCATATTTGCTATGTAACTTTGAAAAAAGCCATTGTATTCCTATTTGGAAACATCTTCAAGGTA6TC7m^CgCC。特异片断msl6-23-3:7^6TO:yU4a76^y47GCTAACCTAACCGACTATTMCTAATTTACACCAATCAAATTCACCGCGAACTCTTGTCTGGGCTTATTAACCGACTTATTTGGGCTTAGATGGGCTTGTTTGGGCTTAGTTGGACTCTTGTCTCTTTCATTTTTGCTATGTAACTTTGAAAAACTCCATTGTAGAGTGTGGACCATTTATCTTCTTTACMAMGTCMCTCTTTCCTTATCAGMTCTCCCTCCCATCGCTTTAACTATCGCAATACACCGACTTCACATCTTCAAGGTA67r^77T67^C6K^7r。上述特异片断Rf24-5-3及特异片断msl6-23-3的两端为SRAP引物，其序列为Me3:5'TGAGTCCAAACCGGAAT3'17bpEm3:5'GTCTGCGTACGMTTGAC3'18bp上述大白菜核质互作雄性不育的SRAP标记，经发明人的实验证明，能够用于辅助选择育种的应用。其辅助选择育种的方法是，首先进行大白菜核质互作雄性不育系与优良恢复系杂交、然后单株自交得到F2代育性分离群体材料，接着进行单株DNA提取，SRAP引物扩增，SRAP标记在分离群体中分离规律分析，带有阳性SRAP标记单株的选择，具体包括下列步骤-1)基因重组群体材料的准备以大白菜核质互作雄性不育系和恢复系杂交，单株自交，选取100粒200粒饱满的F2代种子和亲本种子催芽春化后播种于大田，在幼苗期给F2单株编号，于苗期取幼苗嫩叶片提取DNA备用，开花期鉴定植株育性；2)DNA提取A.取0.2g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入1.5mL的离心管中，放入液氮中速冻，用75%酒精浸泡过的干净塑料研磨棒迅速研磨至粉末；B.向离心管中加700uL经65。C预热的1XCTAB提取液，提取液的配方是CTAB2%，Tris-HC110Ommol/L，EDTA20ramol/L，NaCl1.4mol/L，再加入8uLP-巯基乙醇，迅速混匀；C.随后将离心管放入65'C水浴中，每间隔5min分钟摇一次，水浴30min;D.取出离心管，加入与离心管内的液体等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其中，酚氯仿异戊醇=25:24:1，摇匀15min后，常温下12000r/min离心10min;E.将上层液相(约700"L)转移到另一离心管中，并加入等体积的氯仿异戊醇，其比例为24:1，轻轻摇匀10min，常温下12000r/min离心10min;'F.取上清(约500uL)，加入2倍体积的预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20。C条件下沉淀30min，4。C条件下12000r/min离心10min;G.弃上清，加入500ul75%乙醇洗涤沉淀2次，沉淀物室温晾干；H.加入500uLTE缓冲液溶解DNA，加入0.3yLRNaseA(10Ug/uL)，混匀后离心，37。C保温30min;I.待DNA完全溶解后，加入3mol/LNaAC溶液50uL和2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-2(rC条件下沉淀30min;J.在4。C，12000r/m条件下离心10min，弃上清，加入75%的乙醇清洗沉淀12次，后加入75%乙醇，-20。C保存备用；提取的DNA，经纯度检测，证实纯化较好，一般用灭菌的400500uLddH20稀释，存于4。C中备用；3)SRAP—PCR扩增SRAP-PCR扩增在25uLPCR反应体系中进行，反应体系中有10XPCR缓冲液2.5uL，7邻DNA聚合酶lUnit,MgCl2浓度为3.0mmol/L，上、下游特异性引物浓度分别为0.2umol/L，4种dNTP浓度各为0.2mmol/L，模板DNA40ng;PCR反应程序为预变性94°C/5min、94°C/60s、35°C/60s、72°C/60s，4个循环后，94°C/60s、50°C/60s、72°C/60s,从第六步开始35个循环，72。C延伸lOmin;电泳将扩增产物与5uL的6XLoadingbuffer混匀，取4uL点入6%非变性聚丙烯酰胺凝胶中，在250V下电泳2.5h,经0.29&AgN03染色后用数码相机照相，以DL2000marker为标准分子量；4)SRAP标记与细胞质雄性不育性状的连锁关系针对目标基因的重组F2及F3群体，统计纯合型雄性可育的单株、纯合型雄性不育的单株和杂和型雄性可育单株中SRAP标记的数量，me3em3-366与可育核基因之间的交换值为3.876%,me3em3-372与不育核基因之间的交换值为4.142%。表明366bp带与可育基因连锁，372bp带与不育基因连锁。5)SRAP标记的特征及其选择策略该SRAP标记为共显性标记，在纯合可育单株中能够扩增me3em3-366特异带、不育单株中能够扩增me3em3-372特异带、杂合可育单株同时具有两条带；对于重组分离群体，只要后代单株中检测存在特异条带me3em3-36就一定携带可育核基因，存在特异条带me3em3-372就一定携带不育核基因，无需等到开花时期选择，通过SRAP标记间接选择育性性状，能够早期、快速、准确选择分子育种。本发明对258个F2群体单株DNA用SRAP引物进行PCR扩增表明，在186个雄性可育株中183株有366bp特异带，72个雄性不育株中65株无366bp特异带，重组型植株10株，占总植株数的3.876%,即366bp标记带与可育基因之间的交换值为3.876%。对186株可育株自交后代观察得到了122株的育性分离结果，占65.6%，其中40个纯合雄性可育株中38株有372bp特异带，82杂合雄性可育株中77株有372bp特异带，考虑到&可育株家系群体縮小，对不育株按相同比例縮小为47个雄性不育株都有372bp特异带，重组型植株7株，占总植株数的4.142%，即372bp标记带与不育基因之间的交换值为4.142%。在观察的122个F3株系中，113个株系的育性表现与其F2单株的特异标记相一致，准确性达92.62%。图1是CTAB法提取的大白菜基因组DNA检测图，其中M:DNA标准分子量入-DNA;1-16:随机选取的16个单株DNA;图2是可育池与不育池特异引物的筛选图，其中M:DNA标准分子量DL2000;箭头所指的为可育池中扩增出的特异谱带me3em3-366;F:可育池DNA;S:不育池DNA;图3是引物me3em3对亲本和建池单株的检测结果图，其中M:DNA标准分子量DL2000;F:可育池DNA;S:不育池DNA;C:恢复系；F1:杂交一代；A:不育系；1-10:可育单株；11-20:不育单株；2，6:纯合可育单株;18:交换单株；图4是me3em3引物对F2单株检测结果图，其中M:DNA标准分子量DL2000;2卜32:可育单株；33-44:不育单株；26，30-32:纯合可育单株；图5是me3em3特异标记在其它材料中的检测结果图，其中M:DNA标准分子量DL2000;F:可育DNA池；S:不育DNA池；45-47:不育系06J37;48-50:恢复系01S275-3;51-53:恢复系01S279-3;54-67:F^代;以下结合附图和发明人给出的利用大白菜核质互作雄性不育的SRAP标记进行分子辅助选择育种方法对本发明作进一步的详细说明。具体实施例方式本发明以大白菜胞质雄性不育系06J45、恢复系01S325-1，及其杂交产生的R代、F2群体、F3家系为标记筛选材料，以不育系06J37、恢复系01S275-3、01S279-3及2个不育系06J452、06J37和3个恢复系01S325-1、01S275-3、01S279-3的17个Fi代群体为验证材料。研究利用SRAP技术筛选与细胞质雄性不育相关的特异性引物，进一步对特异片段克隆测序，通过&代及F3家系分离表现，计算连锁距离，将SRAP标记应用于分子育种。首先进行特异性引物筛选，特异性条带的克隆测序，SRAP引物的验证与分离群体分离规律分析。具体如下1.大白菜细胞质雄性不育恢复性及不育性的遗传分析对06J45X01S325-1的&分离群体258株植株进行了育性调査，结果雄性可育株186株，雄性不育株72株，经x2测验表明雄性可育与雄性不育的分离符合3:l(x。2二1.013，x。。s,=3.841)，表明该雄性不育系的育性恢复由单个显性基因控制，不育性由一对隐性基因控制。2.小量法DNA提取12A.取0.2g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入1.5mL的离心管中，放入液氮中速冻，用75%酒精浸泡过的干净塑料研磨棒迅速研磨至粉末；B.向离心管中加700uL经65-C预热的1XCTAB提取液，提取液的配方为CTAB2%，Tris-HC1100mmol/L，EDTA20mmol/L，NaCl1.4mol/L;再加入8uLP-巯基乙醇，迅速混匀；C.随后将离心管放入65t:水浴中，水浴30min，中间每间隔5min分钟摇一次；D.取出离心管，加入与离心管内液体等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其中，酚氯仿异戊醇=25:24:1,摇匀15min后，常温下12000r/min离心10min;E.将上层液相(约700uL)转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇，其比例为24:1，轻轻摇匀10min，常温下12000r/min离心10min;F.取上清(约500yL)加入2倍体积的预冷的无水乙醇，轻轻混匀，使DNA抱团，-2(TC条件下沉淀30min，4。C条件下12000r/min离心10min;G.弃上清，加入500p175%乙醇洗涤沉淀2次，沉淀物室温晾干；H.加入500uLTE缓冲液溶解DNA，加入0.3yLRNaseA(10yg/uL)，混匀，离心后37"C保温30min;I.待DNA完全溶解后，加入3mol/LNaAC溶液50uL和2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20。C条件下沉淀30min;J.在4。C，12000r/m条件下离心10min，弃上清，加入75%的乙醇清洗沉淀12次，后加入75%乙醇，-2(TC保存备用；提取的DNA，经纯度检测，证实纯化较好(如附图1)，用灭菌的400500uLddH20稀释，存于4。C中备用。3.多态性SRAP引物的筛选扩增多态性引物筛选和标记分析本试验共用88种SRAP引物组合在可育池和不育池中进行了扩增，经过统计，每个泳道大约有20条带左右。最后筛选到6对有多态性的引物对，其中me3em3经3次重复扩增，在可育池和不育池之间均表现出一致的差异，即可育池DNA扩增产物比不育池DNA扩增产物多出1条大小为366bp的特异带(如附图2)。进而用该引物对亲本和建池单株扩增，结果366bp的特异带稳定出现(如附图3)，说明该带与育性基因密切相关，命名为me3em3-366，同时发现引物me3em3扩增亲本06J45和01S325-1、R(如附图3)，结果出现了3种带型，分别是恢复可育株01S325-1扩增出单一366bp特异带、不育株06J45扩增出单一372bp带、Fi同时扩增出366bp和372bp带，在可育株建池单株中2株出现了可育株带型、8株出现了R的带型，不育株建池单株中1株为Fi的带型、9株为不育株带型，可见这两条带具有共显性特点。4.SRAP共显性标记的验证及连锁分析用引物me3em3扩增分析F2分离群体(如附图3、图4)。经过统计3种带型比例为父本带型h代带型母本带型=59:131:68，经x2测验符合1:2:1的分离规律(x。2二0.691，xQ.。5,22=5.991)，由此可见该SRAP标记是一种共显性标记，可以区分纯合体与杂合体。经过F3家系表现型对F2可育株单株基因型的推断发现，上述比例与F2代育性基因型的分离比例相同，在观察的122个Fs株系中，113个株系的育性表现与其F2单株的特异标记相一致，准确性达92.62%(如表l)，即这三种带型分别代表了3种育性基因型1(RfRf):2(Rfrf):1(rfrf)的分离比例，366bp带与可育基因连锁，372bp带与不育基因连锁。为了确定特异片段与育性基因之间的遗传距离，用引物me3em3扩增了由06J45X01S325-1建成的F2分离群体的258个单株，结果186个雄性可育株中183株有366bp特异带，72个雄性不育株中65株无366bp特异带，重组型植株IO株，占总植株数的3.876%，S卩366bp标记带与可育基因之间的交换值为3.876%。对186株可育株自交后代观察得到了122株的育性分离结果，占65.6%,其中40个纯合雄性可育株中38株有372bp特异带，82杂合雄性可育株中77株有372bp特异带，考虑到可育株家系群体縮小，对不育株按相同比例縮小为47个雄性不育株都有372bp特异带，重组型植株7株，占总植株数的4.142%，(如表l)。表1me3ern3特异标记与育性基因的遗传连锁分析<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>5.SRAP共显性标记的选择效果为了验证SRAP标记me3em3-366在胞质雄性不育基因转育过程中辅助雄性不育选择的效果，选取与SRAP标记筛选所用试材不同的不育系06J37(随机选取三个单株)；恢复系01S275-3、01S279-3(每个随机选取三个单株)；2个不育系与3个恢复系的后代群体Fi代群体17个(每个群体随机选取三个单株)，进行SRAP标记分析(如附图5)。结果不育系、恢复系和Fi完全再现了上述3种带型，说明以上这些材料和筛选标记所用的材料具有相同的遗传背景，并且这些材料利用该标记进行选择时预测的准确性达到100%，即该SRAP标记辅助选择的准确性达到100%。这一结果表明该SRAP标记在大白菜胞质雄性不育基因的转育中可用于雄性不育基因的辅助选择。6.SRAP共显性标记序列分析从具有父本带型及母本带型单株的聚丙烯酰胺凝胶上分别切下特异条带Rf24-5-3和msl6-23-3进行克隆测序，结果表明，特异条带Rf24-5-3包含引物序列的特异片段长度为366bp，特异条带msl6-23-3包含引物序列的特异片段长度为372bp。特异片段msl6-23-3仅比特异片段Rf24-5-3多了6个碱基。特异条带Rf24-5-3全长366bp,序列如下7Y^GTCC4^4(X(ya^7UCTAACCTAACCGACTATTAACTAATTTACTGTAGTTGGGCTTGTTTGGGCTTAGTTGGACTCTTGTCTCTTTCATATTTGCTATGTAACTTTGAAAAAAGCCATTGTAGAGAGTAGACAGCGTCTCTCGAATCTGCTTAATCTTCCTCTCCTCACCTTTAATCAATCATCTCCTCCATCCAACTTCTTTTATCTCCTTCTCGCATTTATCTTCTTTACAAAAAAGTCAACCCTTTCCTTATCAGAATCTCCCTCCCATAGCTTTGACTGTCGCAATACCTTAAGATTGATCACTACTCCGACTTTCCTATTTGGAAACATCTTCAAGGTAG7rA47TCG7MCCyC4GrC特异条带msl6-23-3全长372bp,序列如下TO4CT7C4^0:GGA47UCTAACCTAACCGACTATTAACTAATTTACACCAATCAAATTCACCGCGAACTCTTGTCTGGGCTTATTAACCGACTTATTTGGGCTTAGATGGGCTTGTTTGGGCTTAGTTGGACTCTTGTCTCTTTCATTTTTGCTATGTAACTTTGAAAAACTCCATTGTAGAGTGTGGACAGCGTCTCTGGAATCTGCTTAATCTTCCTCCTCACCTTTAATCATCTTCTTTTATCTCCTTCTCGCATTTATCTTCTTTACAAAAAGTCAACTCTTTCCTTATCAGAATCTCCCTCCCATCGCTTTAACTATCGCAATACACCGACTTCACATCTTCAAGGTAGrC^7TCC^CGOGTC两端为SRAP引物序列Me3:5,TGAGTCCAAACCGGAAT3'17bpEm3:5，GTCTGCGTACGAATTGAC3'18bp16将这两段核苷酸序列分别输入GenBank，用Blast程序对核酸序列库进行同源性搜索和序列比较，结果都未找到同源序列，说明该序列为大白菜中的新序列。因此将这两条特异带命名为特异片断Rf24-5-3和特异片断ms16-23-3。SRAP标记的特异片断Rf24-5-3和特异片断msl6-23-3的核酸序列特异片断Rf24-5-3全长366bp,序列如下rG/4GrCC^L40:GG^471GCTAACCTAACCGACTATTAACTAATTTACTGTAGTTGGGCTTGTTTGGGCTTAGTTGGACTCTTGTCTCTTTCATATTTGCTATGTAACTTTGAAAAAAGCCATTGTAGAGAGTAGACAGCGTCTCTCGAATCTGCTTAATCTTCCTCTCCTCACCTTTAATCAATCATCTCCTCCATCCAACTTCTTTTATCTCCTTCTCGCATTTATCTTCTTTACAAAAAAGTCAACCCTTTCCTTATCAGAATCTCCCTCCCATAGCTTTGACTGTCGCAATACCTTAAGATTGATCACTACTCCGACTTTCCTATTTGGAAACATCTTCAAGGTAGrC447TCG7MgyC4G7r特异片断msl6-23-3全长372bp,序列如下rC7v4GTCG^C:a7G^KK:TAACCTAACCGACTATTAACTAATTTACACCAATCAAATTCACCGCGAACTCTTGTCTGGGCTTATTAACCGACTTATTTGGGCTTAGATGGGCTTGTTTGGGCTTAGTTGGACTCTTGTCTCTTTCATTTTTGCTATGTAACTTTGAAAAACTCCATTGTAGAGTGTGGACAGCGTCTCTGGAATCTGCTTAATCTTCCTCCTCACCTTTAATCATCTTCTTTTATCTCCTTCTCGCATTTATCTTCTTTACAAAAAGTCAACTCTTTCCTTATCAGAATCTCCCTCCCATCGCTTTAACTATCGCAATACACCGACTTCACATCTTCAAGGTAG7r^L47TC(y7^CGC4grC两端为SRAP引物序列Me3:5，TGAGTCCAAACCGGAAT3，17bpEm3:5，GTCTGCGTACGAATTGAC3，18bp权利要求1.一种大白菜核质互作雄性不育的SRAP标记，其特征在于，该SRAP标记的特异片断Rf24-5-3核酸序列为<u>TGAGTCCAAACCGGAAT</u>GCTAACCTAACCGACTATTAACTAATTTACTGTAGTTGGGCTTGTTTGGGCTTAGTTGGACTCTTGTCTCTTTCATATTTGCTATGTAACTTTGAAAAAAGCCATTGTAGAGAGTAGACAGCGTCTCTCGAATCTGCTTAATCTTCCTCTCCTCACCTTTAATCAATCATCTCCTCCATCCAACTTCTTTTATCTCCTTCTCGCATTTATCTTCTTTACAAAAAAGTCAACCCTTTCCTTATCAGAATCTCCCTCCCATAGCTTTGACTGTCGCAATACCTTAAGATTGATCACTACTCCGACTTTCCTATTTGGAAACATCTTCAAGGTAGTCAATTCGTACGCAGTC。2.—种大白菜核质互作雄性不育的SRAP标记，其特征在于，该SRAP标记的特异片断msl6-23-3核酸序列为ra4GrCCM^4CCGG^7UCTAACCTAACCGACTATTAACTAATTTACACCAATCAAATTCACCGCGAACTCTTGTCTGGGCTTATTAACCGACTTATTTGGGCTTAGATGGGCTTGTTTGGGCTTAGTTGGACTCTTGTCTCTTTCATTTTTGCTATGTAACTTTGAAAAACTCCATTGTAGAGTGTGGACAGCGTCTCTGGAATCTGCTTAATCTTCCTCCTCACCTTTAATCATCTTCTTTTATCTCCTTCTCGCATTTATCTTCTTTACAAAAAGTCAACTCTTTCCTTATCAGAATCTCCCTCCCATCGCTTTAACTATCGCAATACACCGACTTCACATCTTCAAGGTA(7rC^7TCCGOGrC。3.权利要求1或2所述的大白菜核质互作雄性不育的SRAP标记用于大白菜核质互作雄性不育性状的辅助选择育种应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的特异片断Rf24-5-3及特异片断msl6-23-3的两端为SRAP引物，其序列为Me3:5，TGAGTCCAAACCGGAAT3'Em3:5,GTCTGCGTACGAATTGAC3，。5.如权利要求3的所述的应用，其特征在于，所述的辅助选择育种是，首先进行大白菜核质互作雄性不育系与优良恢复系杂交、然后单株自交得到F2代育性分离群体材料，接着进行单株DNA提取，SRAP引物的扩增，SRAP标记在分离群体中分离规律分析，带有阳性SRAP标记单株的选择。6.如权利要求5的所述的应用，其特征在于，所述的辅助选择育种的具体步骤是1)基因重组群体材料的准备-以大白菜核质互作雄性不育系和恢复系杂交，单株自交，选取100粒200粒饱满的F2代种子和亲本种子催芽春化后播种于大田，在幼苗期，给R单株编号，于苗期取幼苗嫩叶片提取DNA备用，开花期鉴定植株育性；2)DNA提取A.取0.2g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入1.5mL的离心管中，放入液氮中速冻，用75%酒精浸泡过的塑料研磨棒迅速研磨至粉末；B.向离心管中加700"L经65'C预热的1XCTAB提取液，提取液的配方是CTAB:2%，Tris-HC1100mmol/L，EDTA20mmol/L，NaCl1.4mol/L，再加入8uLe-巯基乙醇，迅速混匀；C.随后将离心管放入65'C水浴中，每间隔5min分钟摇一次，水浴30min;D.取出离心管，加入与离心管内的液体等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其中，酚氯仿异戊醇=25:24:1，摇匀15min后，常温下画0r/min离心10min;E.将适量上层液相转移到另一离心管中，并加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液，其中，氯仿异戊醇=24:1，轻轻摇匀10min，常温下12000r/min离心10min;F.取适量上清，加入2倍体积的预冷的无水乙醇，轻轻混匀，使DNA抱团，-2(TC条件下沉淀30min，4"C条件下12000r/min离心10min;G.弃上清，加入500ul的75%乙醇洗涤沉淀2次，沉淀物室温晾干；H.加入500uL的TE缓冲液溶解DNA，并加入0.3"L的RNaseA，混匀，离心后37'C保温30min;I.待DNA完全溶解后，加入3mol/L的NaAC溶液50uL和2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀，使DNA抱团，-2(TC条件下沉淀30min;J.在4。C、12000r/m条件下离心10min，弃上清，加入75%乙醇清洗沉淀12次，后加入75Q/^乙醇-2(TC保存备用；提取的DNA，经纯度检测后，用灭菌的400iiL500nL的ddH20稀释，存于4'C中备用；3)SRAP—PCR扩增SRAP-PCR扩增在25uLPCR反应体系中进行，反应体系中有10XPCR缓冲液2.5ixL，7邵DNA聚合酶1Unit,MgCl2浓度为3.0mmol/L，上、下游特异性引物浓度分别为0.2"mol/L，4种dNTP浓度各为0.2画1/L，模板DNA40ng;PCR反应程序为:预变性94。C/5min、94°C/60s、35。C/60s、72°C/60s，4个循环后，94°C/60s、50°C/60s、72°C/60s，从第六步开始35个循环，72。C延伸10min;电泳将扩增产物与L的6XLoadingbuffer混匀，取4ixL点入6%非变性聚丙烯酰胺凝胶中，在250V下电泳2.5h，经0.2y。AgN03染色后用数码相机照相，以DL2000marker为标准分子量；4)SRAP标记与细胞质雄性不育性状的连锁关系针对目标基因的重组F2及F3群体，统计纯合型雄性可育的单株、纯合型雄性不育的单株和杂和型雄性可育单株中SRAP标记的数量，me3em3-366与可育核基因之间的交换值为3.876%,me3em3-372与不育核基因之间的交换值为4.142%，表明366bp带与可育基因连锁，372bp带与不育基因连锁；5)SRAP标记的特征及其选择策略该SRAP标记为共显性标记，在纯合可育单株中能够扩增me3em3-366特异带，不育单株中能够扩增me3em3-372特异带，杂合可育单株同时具有两条带；对于重组分离群体，只要后代单株中检测存在特异条带me3em3-36，就一定携带可育核基因，存在特异条带me3em3-372，就一定携带不育核基因，而无需等到开花时期选择，通过SRAP标记间接选择育性性状，能够早期准确选择分子育种。全文摘要本发明公开了一种大白菜核质互作雄性不育SRAP标记及其辅助选择育种的方法，该方法以核质互作雄性不育系和其对应的恢复系及其杂交二代分离群体的基因组DNA为模板，通过SRAP分析，多次重复试验，筛选到了与核质互作雄性不育基因连锁的共显性SRAP标记，该SRAP标记是特异片断Rf24-5-3和特异片断ms16-23-3，纯合可育株具有me3em3-366特异带、不育株具有me3em3-372特异带、杂合可育株同时具有两条带；me3em3-366与可育核基因之间的交换值为3.876％，me3em3-372与不育核基因之间的交换值为4.142％。该SRAP标记对F2可育株基因型的鉴定结果与F3家系育性分离的鉴定结果的一致性为92.62％，对另外几份材料可育基因检测的准确率为100％。应用这个SRAP标记，可以进行大白菜核质互作雄性不育性状的早期分子辅助选择，加快育种进度。文档编号C12Q1/68GK101440408SQ200810236450公开日2009年5月27日申请日期2008年12月25日优先权日2008年12月25日发明者万恩梅,卓祖闯,玉张,张明科,张鲁刚,惠麦侠申请人:西北农林科技大学