专利名称：利用小孢子培养选育油菜三隐性核不育临保系的方法
技术领域：
本发明属于作物遗传育种技术领域，特别是涉及一种利用小孢子培养选育油菜三隐性核不育临保系的方法。
背景技术：
杂种优势利用为解决人类的温饱问题起到了举足轻重的作用。玉米、水稻、油菜和高粱等作物杂交种的大面积推广为其它物种的杂种优势利用提供了借鉴。油菜是我国重要的油料作物，杂交种的推广和利用已经达到了 75%以上，并且还有进一步扩大的趋势。油菜杂种优势利用的方法主要有细胞质雄性不育系、细胞核雄性不育系、自交不亲和系、基因工程雄性不育系和化学杀雄等方法。其中使用较多的细胞核雄性不育系主要包括显性细胞核雄性不育、双隐性细胞核雄性不育和三隐性细胞核雄性不育等。细胞质雄性不育也被称为是细胞质和细胞核互作雄性不育系，以下简称为细胞质雄性不育。目前使用最多的细胞质雄性不育系为Polima雄性不育系和Sian 2A雄性不育系，这也是最早具有使用价值而被利用到大田生产的雄性不育系，它们为中国乃至世界的油菜生产做出了巨大的贡献，但由于此两类不育系受环境的影响而出现育性波动，导致制种纯度降低。Ogu不育系经过长时间的改良目前已成为国外主要利用的一种细胞质雄性不育。它具有育性彻底和不受环境的影响等优点，但其恢复基因来源单一，恢复系和不育系都需要转育，育种周期相对较长，且不育系选育时会出现死蕾现象。其它类型的细胞质雄性不育，如nap，tour等不育系有一定的缺陷而应用较少。基因工程雄性不育最具有代表性的为利用TA^-barnase基因转基因不育。该不育系育性彻底，育性不受环境影响。缺点是在培育新的杂交组合时，不育系和恢复系要同时转育，育种周期较长，并且为转基因不育，在使用推广及大面积生产时程序复杂。化学杀雄技术由于不需要培育不育系和恢复系，程序简单有效，逐渐受到人们的关注，但为了达到较好的杀雄效果，需要研究化学杀雄剂的剂量、次数和喷洒时间等规律，且存在不同的化学杀雄剂受植株基因型控制等问题。自交不亲和系目前应用较少。显性细胞核不育由于恢复系培育需要大量转育，同时需要不育系的培育和临保系的选育，选育过程显得复杂。尽管目前已培育出核杂7号(上海市农科院，2003 )等显性核不育杂交种，但人们还是利用较少。隐性细胞核不育系不育性彻底，不受环境的影响，恢复系相当广泛，潜力巨大。陈凤祥等(1995)打破常规，首先提出和选育出隐性上位互作核不育临保系，首创了隐性核不育纯合两用系、临保系、恢复系三系杂交油菜选育及制种方法，突破了“隐性核不育找不到保持系”的传统观点，并且选育出了一系列的皖油系列的品种。三隐性核不育系统的临保系能够解决核不育在制种时需要拔掉50%的可育工作，其独的特优势越来越受人们的青睐。然而，三隐性核不育系统能否成功选育最关键在于临保系的选育。 通常的做法是将三隐性核不育系杂交种自交，在F2代或与亲本回交的BClFl中选择可育单株与不育单株大量测交，同时对应的测验种株系需要自交得到自交种子。下季将测交种和自交种一起种植，若测交组合出现全不育，则其对应的测验种株系为临保系。一般选育一个具有临保系基因型的单株需要配制数百个测交组合，并进行大面积种植和多年测定，外加一定的机遇方可选育成功。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用小孢子培养选育油菜三隐性核不育临保系的方法。用ml和m2表示三隐性核不育的两个隐性基因，而rf表示上位抑制基因。杂种优势利用时所用的1 :1不育系基因型为mlmlm2m2RfRf(不育)Mlmlmai^RfRf(可育)或mlmlm2m2RfRf (不育)mlmlM2m2RfRf (可育)，临保系基因型为mlmlman2rfrf，恢复系基因型一般为 mlmlM2M2RfRf, MlMlM2M2RfRf, MlMlm2m2RfRf。根据恢复系基因型，三隐性核不育系杂交种的基因型为 mlmlM2m2RfRf: mlmlM2m2Rfrf=l 1 ；Mlmlm2m2RfRf Mlmlm2m2Rfrf=l 1 ； MlmlM2m2RfRf: MlmlM2m2Rfrf=l 1。若按照F2代进行选择临保系，成功选择临保系的概率分别为1/32，1/32和1/64 (因为恢复系的基因型通常为MlMlM2M2RfR，所以此种比例占主要部分)。若需要四倍的临保系基因型的覆盖率，则需要测交组合数分别为1 ，1 和256 个。若不清楚三隐性核不育系杂交种的基因型时，最安全的测交组合应该为256个以上，同时自交测验种需要种植256个单株，并且保证每个测交种和自交种都可以得到一百粒种子以上。本发明通过小孢子培育技术获得三隐性核不育系的DH系，可以将选育速度提高到4-8倍，种植面积仅为常规方法的1/8-1/4，具体方法为
1)将三隐性核不育系杂交种田间种植；
2)待单株主花序开第一朵花时，将种植单株混合取样，取2-3mm花蕾按常规处理进行小孢子培养；
3)秋水仙碱加倍，生根培养，移栽大田，开花时，将可育单株与不育单株杂交(肉眼判断，将未加倍成功的单株剔除)，按保证临保系基因型单株被选中改良的四倍，测交32个可育单株，同时将可育单株自交；
4)分别种植测交种和自交种50株以上，若测交种出现全不育，则对应的测验种为临保系；若出现全可育或不育可育同时出现的组合，则被淘汰；
5)将临保系与优良的三隐性核不育系1:1中的不育系杂交，然后再与临保系回交，扩大种植面积，选择与1 :1两型系表型相似的可育单株自交纯化，即可得到改良临保系。本发明具有如下的优点
1本发明提供的选育临保系的方法可节约劳力4-8倍，因为恢复系的基因型通常为 MlMlM2M2RfRf，所以节约资源为8倍，且选育临保系的单株的种植面积仅为传统方法的 1/8-1/4，是一种高效快速选育临保系的方法。2本发明提供的方法还可以应用于其它物种隐性核不育临保系的选育和显性核不育的恢复系的选育。
具体实施例方式低成本高效选育油菜三隐性核不育系临保系
1)将三隐性核不育系杂交种种植于田间5行(3米/行)，精心管理，使其长势旺盛；
2)从单株开第一朵花开始，将种植单株混合取样，取2-3mm的花蕾进行小孢子培养；3)秋水仙碱小孢子加倍处理，生根处理，移栽至大田，行距和株距均为40cM，精心管理，保证长势旺盛，使来年植株分支较多，可育株自交种结实较多，不育株分支较多便于与可育株杂交，确信将来可以得到正常倍性的单株数量在32株以上；
4)开花时，拔掉单倍体植株；
5)将可育单株套袋自交，同时套袋不育单株；
6)将可育单株的花粉授粉于不育单株，确保授粉的可育单株数目为32以上(4倍于临保系基因型的覆盖率)；
7)将测交种与对应的自交种放在一起种植，出现的全不育测交组合所对应的测验种即为临保系；
8)选择长势旺盛、花期正常、抗病能力较强的临保系与其它的三隐性核不育系两型系 1 1中的不育单株杂交，然后再与临保系回交，在较大面积下进行种植，选择与1:1系表型相似的可育单株自交。多次选择至基因纯合，最终获得改良的稳定三隐性核不育系临保系。
权利要求
1.利用小孢子培养选育油菜三隐性核不育临保系的方法，其特征在于，具体方法为1)将三隐性核不育系杂交种田间种植；2)待单株主花序开第一朵花时，将种植单株混合取样，取2-3mm花蕾按常规处理进行小孢子培养；3)秋水仙碱加倍，生根培养，移栽大田，开花时，将可育单株与不育单株杂交，按保证临保系基因型单株被选中改良的四倍，测交32个可育单株，同时将可育单株自交；4)分别种植测交种和自交种50株以上，若测交种出现全不育，则对应的测验种为临保系；若出现全可育或不育可育同时出现的组合，则被淘汰；5)将临保系与优良的三隐性核不育系1:1中的不育系杂交，然后再与临保系回交，扩大种植面积，选择与1 :1两型系表型相似的可育单株自交纯化，即可得到改良临保系。
全文摘要
本发明提供了一种利用小孢子培养低成本快速选育油菜三隐性核不育临保系的方法，属于遗传育种技术领域。该方法利用三隐性核不育配制的杂交种进行小孢子培养，然后染色体加倍，可以一次性将有关的两个隐性不育基因和上位抑制基因同时纯化，将可育DH系单株与不育单株测交，测交种出现的全不育所对应的测验种即为临保系。与传统临保系的选育方法方法相比，免去了制种时需要去掉50%的可育株而费时费力的问题，避免了传统的临保系选育方法需要配制大量测交组合和大面积田间种植试验的麻烦，可节约劳力3/4-7/8，效率提高4-8倍。
文档编号A01H4/00GK102172221SQ201110050050
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月2日 优先权日2011年3月2日
发明者付东辉, 李加纳, 殷家明, 肖美丽 申请人:西南大学