一种鉴定玉米雄性育性基因功能的方法

一种鉴定玉米雄性育性基因功能的方法
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定玉米雄性育性基因功能的方法。本发明所提供的方法可概述为通过转基因和群体配制以及开发与目的性状紧密连锁的分子标记，获得并鉴定出在玉米隐性纯合突变背景下表达正常有功能的待测基因的个体，同时验证其表型，从而验证待测基因的功能。本发明通过群体配制，解决了可做为遗传转化受体的玉米材料是雄性可育表型，控制玉米雄性育性的基因的功能无法通过转基因直接进行鉴定的问题；还通过巧妙利用与雄性育性紧密连锁的分子标记，解决了含有正常目的基因的转基因片段导入玉米雄性不育材料后，对分离后代中的转基因阳性植株无法鉴定区分出目的基因纯合突变背景的难题。
【专利说明】
一种鉴定玉米雄性育性基因功能的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种鉴定玉米雄性育性基因功能的方法。
【背景技术】
[0002] 雄性不育是植物中普遍存在的现象，是指雄性生殖器官无法产生正常花粉，但雌 性生殖器官发育正常，能接受正常花粉而受精结实，并能将该不育性遗传给后代的现象。雄 性不育现象主要表现在雄蕊畸形或退化，或花药瘦小、萎缩，以及缺少花粉或花粉空瘪无生 活力等方面。玉米的雄性不育包括质核互作的雄性不育和细胞核基因控制的雄性不育。在 玉米的雄性生殖器官发育过程中，任何一个细胞核雄性育性基因发生突变都有可能导致雄 性不育。这种雄性不育可以分为显性核不育和隐性核不育，且以隐性核不育居多。因此玉米 的细胞核雄性不育现象多数是由隐性单基因控制的。目前已经发现的玉米细胞核隐性不育 材料已经多达几十个，但克隆的基因却不多。
[0003] 当图位克隆玉米雄性隐性核不育基因时，定位区间缩小到一定范围后，两端的分 子标记与目的基因的连锁程度紧密、交换率低，群体扩大到几万个单株依然很难筛选出交 换单株，定位区间很难进一步缩小。而此时定位区间内包含的基因个数已经不多，为了确定 哪一个基因是目的基因，即鉴定基因的功能，需要利用转基因技术，将目的基因在对应的玉 米雄性不育材料中表达，通过检测玉米的雄性育性是否得到恢复，从而鉴定该基因的功能。 但是，玉米的遗传多样性十分丰富，不同玉米材料之间的转化能力差别非常大，适宜做为玉 米遗传转化受体的只集中在ΗΠΙ、综3、综31等少数玉米材料。因此直接以玉米雄性不育材 料为受体进行遗传转化的方式很难实现。如果以适宜遗传转化的玉米材料为受体，转化目 的基因，由于受体材料中本就含有目的基因且可以正常表达并行使功能，即雄性可育，因此 再将目的基因整合至受体材料的染色体上，无法观测到雄性育性从不育到可育的变化，即 无法鉴定目的基因的功能。
[0004] 另一大难点是，即便利用下述方法:将目的基因转化至适宜做为受体的材料中，然 后再将转基因片段通过传统育种的方式导入相应的雄性不育材料，通过在雄性不育基因纯 合突变背景下引入转基因片段，使得玉米雄性育性表型恢复，从而证明目的基因的雄性育 性功能。由于转基因片段含有正常的目的基因序列，在分离的后代中所有转基因阳性个体 都能够扩增出正常的目的基因，因此无法鉴定出既为转基因阳性又为目的基因纯合突变背 景的个体，使得此方法也不可行，也就无从对目的基因的功能进行鉴定。

【发明内容】

[0005] 本发明针对可做为遗传转化受体的玉米材料是雄性可育表型，控制玉米雄性育性 的基因的功能无法通过转基因直接进行鉴定的问题，提供一种验证玉米雄性育性基因功能 的方法。该方法还解决了含有正常目的基因的转基因片段导入玉米雄性不育材料后，分离 后代中无法鉴定出目的基因纯合突变背景个体的难题。
[0006] 当精细定位玉米雄性隐性核不育基因至很小的范围时，两端的分子标记与目的基 因的连锁程度高、交换率低，很难进一步筛选出交换单株从而继续缩小定位区间。此时可针 对定位区间为数不多的基因进行功能验证，能够在相应的玉米雄性不育突变体背景下恢复 雄性育性的基因，即鉴定为目的基因。
[0007] 本发明所提供的一种有效的验证待测基因为雄性育性基因的方法，可概述为通过 转基因和群体配制以及开发与目的性状紧密连锁的分子标记，获得并鉴定出在玉米隐性纯 合突变背景下表达正常有功能的待测基因的个体，同时验证其表型，从而验证待测基因的 功能。
[0008] 本发明所提供的验证待测基因为雄性育性基因的方法，适用于所述雄性育性基因 只有发生纯合突变时才具有雄性不育表型(所述雄性育性基因发生杂合突变仍具有雄性可 育表型，即本发明中所述雄性育性基因为雄性育性隐性核基因），且所述雄性不育突变体植 株不适于作为遗传转化受体的材料的情况。该方法具体可包括如下步骤：
[0009] (a)将待测基因导入受体植物，从所得转基因植株中获得能够表达所述待测基因 的To代转基因阳性植株；
[0010] 所述受体植物含有所述待测基因且雄性可育;所述待测基因源自于与所述受体植 物相同的物种；
[0011] (b)根据所述受体植物所属物种基因组上的所述待测基因正常与否，以及步骤(a) 所得转基因植株是否阳性，确定基因型表示方法，如下：
[0012] 若所述受体植物所属物种基因组上的所述待测基因正常，则以基因型AA表示；若 将所述受体植物所属物种基因组上的所述待测基因发生了纯合突变则以基因型aa表示，发 生了杂合突变则以基因型Aa表示；
[0013] 若步骤(a)中所得的转基因植株为转基因阳性植株，则以基因型B-表示，那么转基 因阳性的杂合植株的基因型是Bb，转基因阳性的纯合植株的基因型是BB;与所述转基因阳 性植株对应的转基因阴性植株或非转基因植株则以基因型bb表示；
[0014] (c)根据步骤(b)确定的基因型表示方法，确定步骤(a)中的所述To代转基因阳性 植株的基因型为AABb;以基因型为AABb的所述To代转基因阳性植株为父本，以基因型为 aabb的雄性不育突变体植株为母本进行杂交，获得h代群体(所述^代群体有两种基因型， 即AaBb和Aabb);
[0015] (d)从所述FHf群体中选择基因型为AaBb的单株作为父本，以基因型为aabb的雄 性不育突变体植株为母本进行再次杂交，获得杂交后代(所述杂交后代有四种基因型，即 AaBb、Aabb、aaBb和aabb)。该方法配制出的群体后代基因型种类简单，并可获得最高比例的 目的基因型(aaBb)单株。
[0016] 所述突变是指所述待测基因无法表达具有正常功能的相应蛋白的突变。
[0017] (e)从步骤(d)获得所述杂交后代中选择基因型为aaBb的单株，根据所述基因型为 aaBb的单株的表型按照如下确定所述待测基因是否为雄性育性基因：若所述基因型为aaBb 的单株为雄性可育表型，则所述待测基因为雄性育性基因。
[0018] 原因分析：其中aaBb基因型的单株，其背景为纯合突变(aa)，表型本应为雄性不 育。如果该基因型的单株的表型却是雄性可育，则说明遗传转化的所述待测基因（B)可以恢 复雄性育性，为雄性育性基因。
[0019] 在所述方法的步骤(a)中，将所述待测基因导入所述受体植物中是通过如下实现 的:将所述待测基因构建到植物表达载体中，获得能够表达所述待测基因的重组表达载体； 将所述重组表达载体导入所述受体植物。
[0020] 其中，构建所述重组表达载体时，可以采用组成型启动子或时空特异启动子或诱 导型启动子或所述待测基因自身启动子启动所述待测基因的转录。
[0021] 所述方法涉及到如下两个关键问题：一是如何区分Bb和bb基因型，筛选出转基因 阳性(AaBb和aaBb)单株;二是如何区分Aa和aa基因型。本发明是如何有效解决这两个关键 问题的?具体分析如下：
[0022]若要区分Bb和bb基因型，由于遗传转化的所述待测基因在所述受体植物基因组上 本就存在，如果将引物对设计在所述待测基因上，那么所述受体植物基因组上的所述待测 基因片段可以被扩增，即使是转基因阴性(bb基因型）依然可以扩增出B的条带。因此要使用 整合到所述受体植物所属物种基因组上的非所述受体植物所属物种基因组片段为模板，即 将引物对设计在整合到所述受体植物所属物种基因组上的非所述受体植物所属物种基因 组片段上，或将一条引物设计在该片段上，另一条引物设计在所述待测基因上。这样，只有 转基因阳性(Bb)植株可以扩增出目的条带。
[0023] 在AaBb和aaBb中区分Aa和aa基因型是难点。在所述受体植物中所述待测基因的基 因型是AA，在所述雄性不育突变体植株中所述待测基因的基因型是aa，两者的DNA序列是不 同的。当一个单株的基因型是Aa时，可以同时检测到A和a两种基因型的DNA序列。在本群体 中，若一个单株的基因型为aaBb，由于转基因阳性(B)使得所述受体植物所属物种基因组中 已经整合了正常的所述待测基因，即可以检测到A基因型的DNA序列。因此基因型为aaBb的 单株也可以同时检测到A和a两种基因型的DNA序列。这样就无法区分AaBb和aaBb基因型。 [0024]从遗传学来讲，如果在染色体上两个基因 /DNA片段距离越远，那么两者发生交换 的频率越高;反之，两者距离越近，发生交换的频率越低。如果一段DNA片段(分子标记)与一 个基因的距离非常近，发生交换的频率非常低，可称该分子标记是基因的紧密连锁分子标 记。将位于基因两侧的紧密连锁分子标记结合使用，则可用于判断夹在两个分子标记之间 的基因的基因型。因此可通过开发与所述受体植物所属物种雄性育性性状紧密连锁的分子 标记，并从中筛选出在所述受体植物和所述雄性不育突变体植株之间有多态性的紧密连锁 分子标记，免去对所述待测基因序列的检测，通过对所述待测基因两侧的分子标记进行检 测，鉴定出含有所述待测基因的整个定位区间是来自于所述受体植物还是来自于所述雄性 不育突变体植株，从而反映所述待测基因的基因型，实现Aa和aa基因型的区分。
[0025] 结合Aa和aa基因型的区分结果和Bb和bb基因型的区分结果，筛选出基因型为aaBb 的单株，进行表型鉴定。由于aaBb基因型的单株，其整个雄性育性性状定位区间来自于所述 雄性不育突变体植株，表型本应为雄性不育，然而由于转基因阳性(Bb)使得所述受体植物 所属物种基因组上整合了所述待测基因，aaBb基因型的单株的表型实则为雄性可育。因此， 如果基因型鉴定为aaBb的单株，其表型为雄性可育，则可得出转化的所述待测基因可以使 对应的背景为雄性不育突变体的植株的雄性育性得以恢复，所述待测基因即为雄性育性基 因。
[0026]根据上述分析，在所述方法的步骤(d)中，从所述?:代群体(所述^代群体有两种基 因型，即AaBb和Aabb)中选择所述基因型为AaBb的单株具体可通过如下实现：以所述h代群 体中的各单株的基因组DNA为模板，采用引物对Μ进行PCR扩增，能够扩增出目的条带的单株 其基因型为AaBb，不能扩增出所述目的条带的单株其基因型为Aabb;所述引物对Μ中的两条 引物均设计在整合到所述受体植物所属物种基因组上的非所述受体植物所属物种基因组 片段上，或者将一条引物设计在该片段上，另一条引物设计在所述待测基因上。
[0027]根据上述分析，在所述方法的步骤(e)中，从所述杂交后代(所述杂交后代有四种 基因型，即AaBb、Aabb、aaBb和aabb)中选择所述基因型为aaBb的单株具体可通过如下实现： [0028] (al)以所述杂交后代中的各单株的基因组DNA为模板，采用引物对Μ进行PCR扩增， 能够扩增出目的条带的单株其基因型为AaBb或aaBb，不能扩增出所述目的条带的单株其基 因型为Aabb或aabb;所述引物对Μ中的两条引物均设计在整合到所述受体植物所属物种基 因组上的非所述受体植物所属物种基因组片段上，或者将一条引物设计在该片段上，另一 条引物设计在所述待测基因上；
[0029] (a2)以步骤(al)获得的基因型为AaBb和aaBb的植株为检测群体，采用在所述受体 植物(AA)和所述雄性不育突变体植株(aa)之间存在多态性且与所述受体植物所属物种基 因组上所述待测基因紧密连锁的分子标记进行检测，根据检测结果从所述检测群体中选择 含有所述待测基因的整个定位区间来自于所述雄性不育突变体植株(aa)的单株，即为基因 型为aaBb的单株。
[0030] 当然，其中所述(al)和所述(a2)两个步骤的先后顺序可以根据实际情况进行调 整。
[0031] 在本发明的一个实施例中，所述植物具体为玉米。由于玉米丰富的遗传多样性，不 同玉米材料之间的遗传转化效率差别非常大。适宜做为玉米遗传转化受体的材料只集中在 ΗΠΙ、综3、综31等少数雄性可育的玉米材料中，直接以玉米雄性不育材料为受体进行遗传 转化的方式很难实现。本发明实施例中的所述受体植物具体为玉米品种ΗΠΙ;所述雄性不 育突变体植株具体为玉米突变体ms*-6044。
[0032] 相应的，所述雄性育性基因为ZmlAPl基因；所述ZmlAPl基因为如下1)-4)中任一的 DNA分子：
[0033] 1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0034] 2)序列表中序列3所示的DNA分子；
[0035] 3)序列表中序列3的第249-1997位所示的DNA分子；
[0036] 4)序列表中序列4所示的DNA分子。
[0037]相应的，在所述方法的步骤(a2)中，位于所述定位区间左端的分子标记为K57,位 于所述定位区间右端的分子标记为K10;对应于所述K57的引物对为引物对1;对应于所述 K10的引物对为引物对2;所述引物对1由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA分子组 成;所述引物对2由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA分子组成。
[0038]在所述方法的步骤(a2)中，以所述检测群体中的待测单株的基因组DNA为模板，以 所述引物对1和所述引物对2分别进行PCR扩增，并将扩增产物分别进行凝胶电泳，得到对应 所述引物对1的带型A1，以及对应所述引物对2的带型B1;若所述带型A1与标准带型A1-致， 且所述带型B1与标准带型B1-致，则所述待测单株中所述定位区间来自于所述雄性不育突 变体植株(aa)，即所述待测单株的基因型为aaBb。所述标准带型A1为以所述雄性不育突变 体植株(aa)的基因组DNA为模板，以所述引物对1进行PCR扩增，并将扩增产物进行凝胶电泳 所得的带型;所述标准带型B1为以所述雄性不育突变体植株(aa)的基因组DNA为模板，以所 述引物对2进行PCR扩增，并将扩增产物进行凝胶电泳所得的带型。获得所述带型A1和所述 标准带型A1时采用的凝胶电泳条件一致;获得所述带型B1和所述标准带型B1时采用的凝胶 电泳条件一致。
[0039] 在所述方法的步骤(a2)中，以所述检测群体中的待测单株的基因组DNA为模板，以 所述引物对1和所述引物对2分别进行PCR扩增，并将扩增产物分别进行凝胶电泳，得到对应 所述引物对1的带型A2，以及对应所述引物对2的带型B2;若所述带型A2与标准带型A2-致， 且所述带型B2与标准带型B2-致，则所述待测单株中所述定位区间来自于所述受体植物 (AA)和所述雄性不育突变体植株(aa)的杂交FHf(Aa)，即所述待测单株的基因型为AaBb。 所述标准带型A2为以所述杂交FHf(Aa)的基因组DNA为模板，以所述引物对1进行PCR扩增， 并将扩增产物进行凝胶电泳所得的带型;所述标准带型B2为以所述杂交FHf(Aa)的基因组 DNA为模板，以所述引物对2进行PCR扩增，并将扩增产物进行凝胶电泳所得的带型。获得所 述带型A2和所述标准带型A2时采用的凝胶电泳条件一致;获得所述带型B2和所述标准带型 B2时采用的凝胶电泳条件一致。
[0040] 在所述方法的步骤(d)和步骤(a 1)中，所述引物对Μ由序列表中序列9和序列10所 示的两条单链DNA分子组成。
[0041] 本发明为玉米雄性育性基因的功能验证提供了有效的鉴定方法。通过群体配制， 解决了可做为遗传转化受体的玉米材料是雄性可育表型，控制玉米雄性育性的基因的功能 无法通过转基因直接进行鉴定的问题。还通过巧妙利用与雄性育性紧密连锁的分子标记， 解决了含有正常目的基因的转基因片段导入玉米雄性不育材料后，对分离后代中的转基因 阳性植株无法鉴定区分出目的基因纯合突变背景的难题。使得将目的基因在对应的玉米雄 性不育材料中表达，通过检测玉米的雄性育性是否得到恢复，从而鉴定该基因的功能成为 可能。本发明是在图位克隆玉米雄性育性的隐性单基因至极小范围时，对其内包含的为数 不多的候选基因进行功能鉴定并最终确定目的基因的行之有效的方法。同时也是对通过同 源克隆等其他方法克隆到的玉米雄性育性的隐性单基因进行功能鉴定的行之有效的方法。
【附图说明】
[0042] 图1为玉米突变体ms*-6044与野生型的表型对比图。其中，A、C、E、G为野生型，B、D、 F、H为ms*-6044突变体。A和B，植株形态;C和D，雄穗花药外挂情况;E和F，花药形态;G和Η，花 粉1%Ι2-ΚΙ染色。
[0043]图2为ZmlAPl基因（实际还包括了启动子等基因上游和下游的序列）PCR产物的琼 脂糖凝胶电泳图。
[0044] 图3为PCR产物经ΚρηΙ和Hindm双酶切后的电泳图。
[0045] 图4为转基因后代群体配制示意图。
[0046]图5为ZmlAPl基因的功能验证图。其中，A:转基因检测（3、4、5是基因型为aaBb的植 株，经鉴定为转基因阳性，1是对照，即转化玉米受体Hi II时用的p3300-ZmIAPl质粒作为模 板扩增所得的阳性对照基因型为aaBb植株的雄性可育表型;C:基因型为aaBb植株的花 粉1%I 2-KI染色。
[0047]图6为群体配制过程中各世代和各类型单株的定位区间分子标记示意图及电泳 图。其中，Α:群体配制过程中各世代和各类型单株的定位区间分子标记示意图；Β:分子标记 K57鉴定群体后代单株基因型电泳图（1是突变体ms*-6044,2是受体ΗΠΙ，3-10是群体单 株）；C:分子标记K10鉴定群体后代单株基因型电泳图（1是突变体ms*-6044,2是受体ΗΠΙ， 3-10是群体单株）。
【具体实施方式】
[0048] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0049] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0050] 玉米突变体ms*_6044:由Maize Genetics Cooperation Stock Center保存，Co-op ID: 104G;Description: 104G ms*_6044。该玉米突变体在该保藏中心的具体网页链接如 下：http: //www .maizegdb · org/data_center/stock?id = 130311 〇
[0051] 实施例1、鉴定雄性育性基因的方法的建立
[0052]本实施例以玉米雄性育性基因 ZmlAPl为例，阐述本发明的具体实施方法。ZmlAPl 基因是以玉米雄性不育突变体ms*-6044为亲本组配群体并图位克隆，获得的候选基因。为 鉴定ZmlAPl基因是否具有玉米雄性育性的功能，将其构建到植物表达载体pCAMBIA3300中 获得重组质粒，并经农杆菌介导转化至玉米受体Hi II中，而后组配群体，鉴定筛选以ms*-6044纯合突变为背景的转基因阳性植株，并检测表型。
[0053] 一、玉米突变体ms*_6044的表型
[0054]与正常植株相比，玉米突变体ms*-6044在植株整体形态方面没有异常（图1中A和 B)，但是其雄穗的花药不外挂（图1中C和D)，经解剖其花药干瘪瘦小（图1中E和F)，花药内部 用1 % I2-KI溶液染色未观察到饱满成熟的花粉粒（图1中G和H)，表现为彻底的雄性不育现 象。该现象在北京和海南连续4年观察表型一致，不育特性稳定，且在大田条件下肉眼即可 区分是否为雄性不育。
[0055] 二、ZmlAPl基因的克隆
[0056] 1、初步判定玉米突变体ms*_6044的表型由隐性单基因控制 [0057] 以玉米突变体ms*-6044为母本，以玉米自交系B73或郑58为父本组配田间表 型均为雄性可育。而后以玉米突变体ms*-6044为母本，以Fi为父本构建回交群体(BCiFi)， B&Fi群体在田间可分为雄性可育个体和雄性不育个体两种类型，且两种类型的比例经卡方 检验符合1:1(表1)。由此推测玉米突变体ms*-6044的表型由隐性单基因控制。
[0058] 表1 B&F!群体不同表型个体的比例统计
[0059]
[0060] X〇.〇52(l) = 3.84 [0061 ] 2、ZmIAPl基因的克隆
[0062]进一步根据步骤1组配的BQFi群体，将控制雄性不育这一突变性状的基因定位到 玉米一号染色体80.96cM到81. lcM之间，以公布的B73基因组测序结果为参考物理距离约为 140kb，共包括四个基因。其中基因号为GRMZM2G434500的序列在ms*-6044突变体与玉米自 交系B73/郑58之间存在差异，突变体有一个1.3kb的插入，B73和郑58没有这一插入，基因编 码蛋白可以正确翻译，将此基因命名为ZmlAPl。相应的，ms*-6044突变体中的ZmlAPl基因发 生了突变，将突变后的相应基因命名为zmiapl。
[0063] 以玉米自交系B73的基因组DNA为模板，采用引物对FI /R1进行PCR扩增，所得PCR产 物的序列为序列表中序列2,序列2即为ZmlAPl基因在玉米基因组中的序列。提取玉米自交 系B73的总RNA，反转录为cDNA，采用引物对F2/R2进行PCR扩增，所得PCR产物的序列为序列 表中序列3,序列3即为ZmlAPl基因的cDNA序列，其中第249-1997位为CDS。序列2和序列3均 编码序列表中序列1所不的ZmlAPl蛋白。
[0064] FI:5 '-CTCACAGCAAATTCGTCTCAC-3 '；
[0065] R1：5'-TTAAAATTAAGGGAAAATTAAATAG-3'〇
[0066] F2:5 '-TCGTCATCCAGCTCCGTT-3 '；
[0067] R2:5 '-GCCTAGTCCCTAGACCATGCTGAA-3 '。
[0068] 三、p3300-ZmIAPl 载体的构建
[0069] 设计针对ZmlAPl基因的基因组序列的特异引物。具体序列为：
[0070] P1-F:5 '-CCAAGGGTGACAGAATACA-3 '；
[0071 ] Pl-R:5 '-ATTGCGATGGGAGCGTAT-3 '。
[0072] 其中，P1-F位于ZmlAPl基因起始密码子ATG上游3323bp，Pl-R位于ZmlAPl基因终止 密码子下游1404bp。
[0073] 以玉米自交系B7 3的基因组DNA为模板，采用引物对P1-F/P1-R进行PCR扩增，扩增 获得的PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带（图2)。进一步将目标条带胶回收 测序，显示其序列如序列表中序列4所示。
[0074] 将此PCR产物(序列4)用ΚρηΙ和Hindm双酶切，酶切产物经过1.0%的凝胶电泳检 测，如图3所示，得到两条条带，长度分别为5.2kb和1.3kb左右，将5.2kb(上游1919bp+ ZmlAPl基因1922bp+下游1358bp)的目的条带回收，与经同样双酶切的pCAMBIA3300的骨架 大片段相连，经酶切和测序鉴定，构建成为互补载体p3300-ZmIAPl。
[0075] 重组表达载体p3300-ZmIAPl的结构描述:将pCAMBIA3300载体的酶切位点ΚρηΙ和 Hindm之间的小片段替换为序列表中序列4的第1406-6601位所示DNA片段后得到的重组质 粒。
[0076]四、玉米遗传转化实验
[0077]由天津吉诺沃生物科技有限公司完成重组表达载体p3300_ZmIAPl向玉米品种Hi Π 的遗传转化，具体的转化方法是常规的农杆菌介导的玉米幼胚的遗传转化。
[0078]五、转基因后代群体配制
[0079]为鉴定ZmlAPl基因是否具有玉米雄性育性功能，将转p3300-ZmIAPl载体的To代转 基因植株与玉米雄性不育突变体ms*-6044杂交并回交，配制成群体，从而获得具有ms*-6044雄性不育背景的转基因植株。
[0080] 在此，将玉米基因组上正常的ZmlAPl基因（纯合）以基因型AA表示，突变的zmiapl 基因（纯合）以基因型aa表示。玉米受体Hi Π 是雄性育性正常的材料，因此ZmlAPl基因在Hi Π 中的基因型是AA，而在玉米突变体ms*-6044中的基因型是aa。同时，将转基因阴性植株或 非转基因植株的基因型以bb表示，将转基因阳性植株（即含有ZmlAPl基因的互补载体片段 已整合到玉米基因组上）以B表示，那么转基因杂合植株的基因型是Bb，转基因纯合植株的 基因型是BB。
[0081]转基因后代群体的配制（图4)，首先以To代转基因阳性植株(AABb)为父本，玉米突 变体ms*_6044(aabb)为母本，组配FuFi群体包含两种基因型，即AaBb和Aabb。提取Fi各个单 株的基因组DNA鉴定其是否为转基因阳性(B)。选择转基因阳性植株即AaBb基因型单株为父 本，以玉米突变体ms*-6044(aabb)为母本，再次杂交，其后代共产生四种基因型：AaBb、 八 &1*、&&813、&&1*。其中基因型为 &&813的单株，其背景为雄性不育(&&)，同时又是转基因阳性 植株，是本实验的目的植株。
[0082]六、转基因群体后代基因型鉴定 [0083] 1、确定是否为转基因阳性(B)的方法
[0084] 确定是否为转基因阳性(B)的方法具体如下：将转基因后代群体中的单株提取基 因组DNA，以此为模板，以P2-F和P2-R为引物，扩增获得大小1396bp的目的条带为转基因阳 性，无此条带为转基因阴性。同时以转化前的p3300-ZmIAPl质粒为模板进行扩增，做为阳性 对照。
[0085] P2-F:5'-CTCCACCATGTTATCACATCAATCC-3'（位于pCAMBIA3300载体上启动标记基 因的CaMV35S启动子上，序列9)
[0086] P2-R:5'-CGTCTTTGTCTTTCGCGTAGC-3'（位于p3300-ZmIAPl的酶切位点ΚρηΙ和Hind ΙΠ 之间的插入片段上，即序列4的第2185-2205位的反向互补序列，序列10)。
[0087]图5中A的泳道3、4、5为鉴定为转基因阳性的植株，泳道1是以转化前的p3300-ZmlAPl质粒为模板的结果，是阳性对照。
[0088] 2、确定玉米基因组上雄性不育性状定位区间内的基因型(aa)的方法
[0089]具体如下:首先，在定位区间两侧设计分子标记，以玉米受体ΗΠΙ和雄性不育突变 体ms*_6044的基因组DNA为模板，筛选出多态性分子标记，详见表2。
[0090] 选取定位区间左端的分子标记K57和定位区间右端的分子标记K10,来扩增玉米受 体ΗΠΙ、雄性不育突变体ms*-6044和转基因群体单株的基因组DNA，如图6中A所示，玉米受 体ΗΠΙ的基因型是K57K10/K57K10,雄性不育突变体ms*-6044是k57kl0/k57kl0,转基因群 体单株有四种情况，分别是 K57K10/k57kl0、K57kl0/k57kl0、k57K10/k57kl0、k57kl0/ k57kl0。转基因群体单株两侧的分子标记都同时是ms*-6044材料的带型时，即k57kl0/ k57kl0,就确定该单株这一段基因组DNA的双链都是来自突变体ms*-6044,那么这一段区间 的基因型就是aa。
[0091] 采用分子标记K57和K10鉴定步骤五群体配制最终所得的杂交回交后代（四种基因 型:AaBb、Aabb、aaBb、aabb)的1 %琼脂糖凝胶电泳结果具体如图6中13和(：所示。由图可见，其 中部分单株采用分子标记K57和K10进行鉴定所得带型均与ms*-6044材料的带型相同，则该 部分单株的基因型为aa;另外一部分单株采用分子标记K57和K10进行鉴定所得带型为玉米 品种Hi Π 的带型和ms*-6044材料的带型的叠加，则该部分单株的基因型为Aa。
[0092] 表2 !1;[11与1118*-6044之间的多态性分子标记
[0093]
[0094] 七、转基因群体后代表型鉴定
[0095] 植株表型是否为雄性可育，具体通过如下两种方法鉴定：1、观察盛花期雄穗的花 药是否外挂，不外挂为雄性不育，外挂为雄性可育。2、花药内部用1 % I2-KI溶液染色，未观 察到黑色圆形饱满成熟的花粉粒为雄性不育，观察到黑色圆形饱满成熟的花粉粒为雄性可 育。
[0096] 本发明检测的4个转化事件共63个aaBb基因型单株其表型均为雄性可育（图5中Β 和C，图中显示盛花期花药饱满且外挂，花药内经1% I2-KI染色全部花粉均呈现黑色圆形 饱满状，鉴定为有活力的花粉），同时分离出的33个aabb基因型单株的表型均为雄性不育 (盛花期花药干瘪且不外挂，花药内没有经1% I2-KI染色鉴定为有活力的花粉）。因此鉴定 出，转化的ZmlAPl基因可以互补ms*-6044纯合突变的雄性育性表型，证实ZmlAPl基因为雄 性育性基因。
【主权项】
1. 一种验证待测基因为雄性育性基因的方法，所述雄性育性基因只有发生纯合突变时 才具有雄性不育表型，其特征在于:所述方法包括如下步骤： (a) 将待测基因导入受体植物，从所得转基因植株中获得能够表达所述待测基因的T0代 转基因阳性植株； 所述受体植物含有所述待测基因且雄性可育;所述待测基因源自于与所述受体植物相 同的物种； (b) 根据所述受体植物所属物种基因组上的所述待测基因正常与否，以及步骤(a)所得 转基因植株是否阳性，确定基因型表示方法，如下： 若所述受体植物所属物种基因组上的所述待测基因正常，则以基因型AA表示；若将所 述受体植物所属物种基因组上的所述待测基因发生了纯合突变则以基因型aa表示，发生了 杂合突变则以基因型Aa表示； 若步骤(a)中所得的转基因植株为转基因阳性植株，则以基因型B-表示，那么转基因阳 性的杂合植株的基因型是Bb，转基因阳性的纯合植株的基因型是BB;与所述转基因阳性植 株对应的转基因阴性植株或非转基因植株则以基因型bb表示； (c) 根据步骤(b)确定的基因型表示方法，确定步骤(a)中的所述To代转基因阳性植株的 基因型为AABb;以基因型为AABb的所述To代转基因阳性植株为父本，以基因型为aabb的雄 性不育突变体植株为母本进行杂交，获得^代群体； (d) 从所述^代群体中选择基因型为AaBb的单株作为父本，以基因型为aabb的雄性不育 突变体植株为母本进行再次杂交，获得杂交后代； (e) 从步骤(d)获得所述杂交后代中选择基因型为aaBb的单株，根据所述基因型为aaBb 的单株的表型按照如下确定所述待测基因是否为雄性育性基因：若所述基因型为aaBb的单 株为雄性可育表型，则所述待测基因为雄性育性基因。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(a)中，将所述待测基因导入所述受体 植物中是通过如下实现的：将所述待测基因构建到植物表达载体中，获得能够表达所述待 测基因的重组表达载体;将所述重组表达载体导入所述受体植物。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:步骤(d)中，从所述^代群体中选择所述 基因型为AaBb的单株是通过如下实现的：以所述F 1代群体中的各单株的基因组DNA为模板， 采用引物对M进行PCR扩增，能够扩增出目的条带的单株其基因型为AaBb，不能扩增出所述 目的条带的单株其基因型为Aabb; 所述引物对M中的两条引物均设计在整合到所述受体植物所属物种基因组上的非所述 受体植物所属物种基因组片段上，或者将一条引物设计在该片段上，另一条引物设计在所 述待测基因上。4. 根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:步骤(e)中，从所述杂交后代中选 择所述基因型为aaBb的单株是通过如下实现的： (al)以所述杂交后代中的各单株的基因组DNA为模板，采用引物对M进行PCR扩增，能够 扩增出目的条带的单株其基因型为AaBb或aaBb，不能扩增出所述目的条带的单株其基因型 为Aabb或aabb;所述引物对M中的两条引物均设计在整合到所述受体植物所属物种基因组 上的非所述受体植物所属物种基因组片段上，或者将一条引物设计在该片段上，另一条引 物设计在所述待测基因上； (a2)以步骤(al)获得的基因型为AaBb和aaBb的植株为检测群体，采用在所述受体植物 和所述雄性不育突变体植株之间存在多态性且与所述受体植物所属物种基因组上所述待 测基因紧密连锁的分子标记进行检测，根据检测结果从所述检测群体中选择含有所述待测 基因的整个定位区间来自于所述雄性不育突变体植株的单株，即为基因型为aaBb的单株。5. 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述植物为玉米。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述雄性育性基因为ZmIAPl基因；所述 ZmIAPl基因为如下1)-4)中任一的DNA分子： 1) 序列表中序列2所示的DNA分子； 2) 序列表中序列3所示的DNA分子； 3) 序列表中序列3的第249-1997位所示的DNA分子； 4) 序列表中序列4所示的DNA分子。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(a2)中，位于所述定位区间左端的分 子标记为K57,位于所述定位区间右端的分子标记为K10;对应于所述K57的引物对为引物对 1;对应于所述KlO的引物对为引物对2;所述引物对1由序列表中序列5和序列6所示的两条 单链DNA分子组成;所述引物对2由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA分子组成。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(a2)中，以所述检测群体中的待测单 株的基因组DNA为模板，以所述引物对1和所述引物对2分别进行PCR扩增，并将扩增产物分 别进行凝胶电泳，得到对应所述引物对1的带型Al，以及对应所述引物对2的带型BI;若所述 带型Al与标准带型Al-致，且所述带型Bl与标准带型Bl-致，则所述待测单株中所述定位 区间来自于所述雄性不育突变体植株； 所述标准带型Al为以所述雄性不育突变体植株的基因组DNA为模板，以所述引物对1进 行PCR扩增，并将扩增产物进行凝胶电泳所得的带型;所述标准带型Bl为以所述雄性不育突 变体植株的基因组DNA为模板，以所述引物对2进行PCR扩增，并将扩增产物进行凝胶电泳所 得的带型； 获得所述带型Al和所述标准带型Al时采用的凝胶电泳条件一致;获得所述带型Bl和所 述标准带型Bl时采用的凝胶电泳条件一致。9. 根据权利要求3-8中任一所述的方法，其特征在于:步骤(d)和步骤(al)中，所述引物 对M由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA分子组成。
【文档编号】C12N15/82GK105907865SQ201610322941
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】赵丽, 陈化榜, 张华
【申请人】中国科学院遗传与发育生物学研究所