鉴定结球叶用莴苣品种的方法
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定结球叶用莴苣品种的方法，采用SSR分子标记法对结球叶用莴苣进行品种鉴定，SSR分子标记法在结球叶用莴苣多态性研究中，其专用引物如下：SML026；SML022；SML021；SML015；SML013；SML002；SML001；SH86；SH66；SH49；SH43；SH42；KSL271；KSL173；KSL123；KSL115；KSL97；KSL92；KSL87；KSL51；KSL32；KSL26。用上述专用引物获取结球叶用莴苣SSR指纹图谱和待鉴定品种的指纹，将待测品种的指纹与所述的SSR指纹图谱进行对比，获得鉴定结果。能方便、准确的鉴定结球叶用莴苣品种。
【专利说明】
鉴定结球叶用莴苣品种的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种鉴定结球叶用莴苣品种技术，尤其涉及一种鉴定结球叶用莴苣品 种的方法。
【背景技术】
[0002] 目前，我国国家蔬菜种质资源库收集和保存结球叶用莴苣种质资源200余份，但目 前生产上使用的栽培品种多数引自国外。结球叶用莴苣是一种低投入、高收益、营养价值丰 富的速生蔬菜，近年来栽培面积迅速扩大，逐渐成为人们食用的首选绿叶蔬菜之一。但是， 我国结球叶用莴苣的栽培品种主要靠引进国外已有品种，具有自主知识产权的品种和类型 很有限，并且在品种资源搜集、鉴定上几乎是空白。因此，需要多角度、多方法开展种质资源 的创新工作，开发出品质优良的结球叶用莴苣新品种，来满足当前生产的需要。种质资源是 蔬菜遗传育种和品种改良的基本材料，种质资源的鉴定和筛选是培育和改良优异品种的一 项基础工作。由于不同地区之间频繁引种，使得品种名称十分混乱，同物异名和同名异物的 现象非常普遍。所以，利用SSR指纹图谱技术鉴定结球叶用莴苣品种很有必要。
[0003] 现阶段，对于蔬菜的种质资源鉴定，大多用的基于PCR技术的DNA标记技术，可综合 为三大类：一是以分子杂交为基础的标记技术，主要是RFLP( Restrict ion Fragment Length Polymorphism)及VNTR(Variable number tandem repeat);二是以PCR为基础的标 记技术，如RAroWandom Amplified Polymorphic DNA)、SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions)、STS(Sequence Tagged Site)、SSR(Simple Sequence Repeat)、ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat)nDAF(DNA Amplified Fingerprinting)^.ERPAR(Ex-tended Random Primer Amplified Regions)等；三是酶切和PCR相结合的标记技术，主要 有AFLP(Amplified ragment Length Polymorphism)和CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)。此外，还有一类新近发展起来的基于单个核苷酸多态性的DNA标 记，即SNP(Simple Nucleotide Polymorphism)。随着逆转座子研究，一项基于反转录转座 子的植物分子标记技术一RTN技术得到了很大的发展，主要有SSAP( Sequence-1 Variation Polymorphism)、RIAP(Inverse Retrotransposon Amplified Polymorphism)、RBIP (Retrotransposon based Insertion Polymorphism)等5种。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种使用方便、结果准确的鉴定结球叶用莴苣品种的方法。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0006] 本发明的鉴定结球叶用莴苣品种的方法，采用SSR分子标记法对结球叶用莴苣进 行品种鉴定，所述的SSR分子标记法在结球叶用莴苣多态性研究中，其专用引物如下：
[0007] (1)SML026
[0008] (2)SML022
[0009] (3)SML021
[0010] (4)SML015
[0011] (5)SML013
[0012] (6)SML002
[0013] (7)SML001
[0014] (8)SH86
[0015] (9)SH66
[0016] (l〇)SH49
[0017] (11)SH43
[0018] (12)SH42
[0019] (13)KSL271
[0020] (14)KSL173
[0021] (15)KSL123
[0022] (16)KSL115
[0023] (17)KSL97
[0024] (18)KSL92
[0025] (19)KSL87
[0026] (20)KSL51
[0027] (21)KSL32
[0028] (22)KSL26
[0029] 用所述专用引物获取结球叶用莴苣SSR指纹图谱，并用所述专用引物获取待鉴定 品种的指纹，将待测品种的指纹与所述的SSR指纹图谱进行对比，获得鉴定结果。
[0030] 由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明实施例提供的鉴定结球叶用莴苣 品种的方法，能方便、准确的鉴定结球叶用莴苣品种。
【具体实施方式】
[0031 ]下面将对本发明实施例作进一步地详细描述。
[0032] 本发明的鉴定结球叶用莴苣品种的方法，其较佳的【具体实施方式】是：
[0033] 采用SSR分子标记法对结球叶用莴苣进行品种鉴定，所述的SSR分子标记法在结球 叶用莴苣多态性研究中，其专用引物如下：
[0034] (1)SML026
[0035] (2)SML022
[0036] (3)SML021
[0037] (4)SML015
[0038] (5)SML013
[0039] (6)SML002
[0040] (7)SML001
[0041] (8)SH86
[0042] (9)SH66
[0043] (l〇)SH49
[0044] (11)SH43
[0045] (12)SH42
[0046] (13)KSL271
[0047] (14)KSL173
[0048] (15)KSL123
[0049] (16)KSL115
[0050] (17)KSL97
[0051 ] (18)KSL92
[0052] (19)KSL87
[0053] (20)KSL51
[0054] (21)KSL32
[0055] (22)KSL26
[0056] 用所述专用引物获取结球叶用莴苣SSR指纹图谱，并用所述专用引物获取待鉴定 品种的指纹，将待测品种的指纹与所述的SSR指纹图谱进行对比，获得鉴定结果。
[0057]通过以下方法获取结球叶用莴苣SSR指纹图谱，包括以下步骤：
[0058] A、以叶用莴苣的基因组DNA为模板，用所述专用引物进行PCR扩增；
[0059] B、将步骤A中得到的扩增产物进行毛细管电泳，分别记录品种中SSR片段的长度；
[0060] C、按照电泳的峰值图读数，有峰记为1，无峰记为0,根据(0，1)数据矩阵，构建SSR 指纹图谱。
[0061] 应用于品种鉴定时，将待鉴定品种的DNA用所述专用引物经PCR产物扩增，将产物 对应的条带填写入相应的（〇，1)标记表中得出待测品种的指纹，而后将待测品种的指纹与 上述的SSR指纹图谱进行对比，直接获得鉴定结果。
[0062] 具体实施例：
[0063]实例1、用SSR分子标记法建立结球叶用莴苣指纹图谱。
[0064]操作流程为：制备模板DNA-DNA扩增4毛细管电泳4统计分析结果。具体方法和 过程如下：
[0065] 1、使用改良的CTAB法提取的叶用莴苣基因组DNA:
[0066]提取的基因组DNA经Eppendorf Biophotometer测定OD26Q/OD28Q值在 1 ·7-1 ·9范围 内。将DNA提取液稀释成lOOng/μΙ，取3μ1 DNA样品加入ΙμL loading buffer稀释液，在1% 的琼脂糖凝胶上检测，稳压4V/cm，电泳45min。电泳结果显示，DNA主带清晰，无降解现象， RNA去除干净，可以作为模板。
[0067] 2、SSR引物的设计和筛选：
[0068] 在SSR分子标记实验中，不同引物组合对某一特定基因组的扩增效率是不同的。弓丨 物扩增效率的高低由它产生的多态性条带数决定。本实例对109对引物组合进行分别进行 扩增，从中筛选出了22对谱带分布均匀，条带丰富，多态性较高且谱带质量较好的引物组 合，可用于提供样品种质资源遗传多样性研究。这十一对引物如下：
[0069] 引物对 1: SML026 ;GGGTTCTCATTGGCTGACAT/TGTCTTCCAACCAAAACATACA(GAA)ii
[0070] 引物对 2: SML022 ;GGGCCTCAAATCCTCTCTG/TGTTCTTCCCCTCTTTGGAA(ATC)i3 [0071 ]引物对 3: SML021; TTGGGAGAATTTTCATTTCCA/AGTCATCTTTTTCACCCCACA(TA)8
[0072] 引物对 4: SML015; TTGAGGAGGGCATTTACGTC/GAGGCGTATCTCCAAGGTGT(TGTTA)i6
[0073] 引物对5: SMLO13; TCCCATGATGGAGAGACTCA/CCCAAAAGGGAATAGCAACC(GAA) i4 (CTG) 5
[0074] 引物对 6: SML002 ;GTGATTGCATGCCAAATGAA/TTAGTAGCCCGCATGCTTTT(TTC)i7
[0075] 引物对 7: SML001; ccatggatcctgtgtgaaga/caccatgttccacttccactt(catgat)6
[0076] 引物对 8: SH86 ;GTCTGTGTGGITTTGGT/TGTGGTGGAGTGTGATTT(CT)2〇
[0077] 引物对 9: SH66 ;GGTAGGGCAGTCAAGCAAGA/AATGATGAITTTGCCCTTGG(TC)28
[0078] 引物对10: SH49 ;GGAGATTGAGAGGAAAA/GAGTGGAAGGGAAATAG(AG)25
[0079] 引物对11: SH43; CTCTCGTTCCTTTTGTTGGTTT/TGGTAGTGGCTTCCTTGCTATT(AC)i〇
[0080] 引物对12: SH42 ;GCAAGCTAAAGGGCTTTTTGT/CAGCCTGGGAATATTTACTCTGA(ATT)27 [0081 ]引物对13 :KSL271; ACAAAGGCAAGATTGGGTCA/GCGGATATGCAGCCATAACA(ATG)i2
[0082] 引物对 14:KSL173; ATAGTCACGACTCACGCCCA/CCATTTTCCTCTTTCTGCGA (CT) i4
[0083] 引物对 15: KSL123; ATTGTAACTTCTGCGGGCCT/GCCTCACATGTTCTTCCCCT (ATC) i3
[0084] 引物对 16: KSL115; CATTGCACTCCGTCATCTCC/GGGTTGATTCCGAAAGTTCC (CT) 11
[0085] 引物对 17 :KSL97; CGCAGAAAAGGGATCAGACA/TCAGAGACACTGCAAAAGGGA(CT)ii
[0086] 引物对 18: KSL92; GGTCTCTTTCCTCTGCCCTG/TCGCGTTCTGAAGTAGCCAT (CT) 2〇
[0087] 引物对 19: KSL87; GCGGGATCGATACTTACCCT/ATCATCGACGGGCTTTTCTT (CT) π
[0088] 引物对 20 :KSL51; CCCCTACCACCACCAAAGTC/TACCAAATGACATGCACCCC(ATG)i〇
[0089] 引物对21 :KSL32; CGGGGAGCATTTAGTGTGTG/AATTTGGGGTCCGATTTGAG(CT)i4
[0090] 引物对22: KSL26; GGGCTTTCTCTCCTTTCCTTT/AATTTGGATCCTGTCGAGGG (TC) 16
[0091] 3、DNA的扩增，如下表1:
[0092]
[0093] 94°C 预变性 5min;94°C 变性 30sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 45sec，循环 38次；最 后72 °C延伸1 Omin。4 °C保温待用。
[0094] 表2.SSR扩增统计结果：
[0095]
[0096] 4.获取结球叶用莴苣的指纹图谱：
[0097] 根据扩增带的强弱，以及清晰度确定遗传变异的带，淘汰假象带。在电泳图谱中进 行比较，确定单态带和多态带。选取电泳平板上清晰可辨的电泳条带，以"Γ和"0"分别记录 条带的有无，在同一迀移距离上有带赋值"Γ，无带赋值"0"。
[0098] 实例2、结球叶用莴苣的SSR指纹图谱分析与应用：
[0099] 根据22对引物的扩增结果，用(0，1)法绘制得出结球叶用莴苣的指纹图谱，如表3:
[0100] 表3:结球叶用莴苣的指纹图谱(部分）
[0101]
[0102] 应用于品种鉴定时，将待鉴定品种的DNA，用22对引物经PCR产物扩增，将产物对应 的条带填写入相应的（〇，1)标记表中得出待测品种的指纹，而后将待测品种的指纹与上述 的指纹图谱(表3)进行对比，可直接获得鉴定结果。
[0103] 如某一品种经上述流程得出指纹为：
[0104] 010001000010010000100010000000100010000000001000000000000000100101000 0001000001010000010000100000000100001000001000000000100001000000100000
[0105] 将此指纹与表3提供的指纹对比，则可知此品种为GJ-31。
[0106] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范 围为准。
【主权项】
1. 一种鉴定结球叶用莴苣品种的方法，其特征在于，采用SSR分子标记法对结球叶用莴 苣进行品种鉴定，所述的SSR分子标记法在结球叶用莴苣多态性研究中，其专用引物如下： (DSML026 (2) SML022 (3) SML021 ⑷SML015 (5) SML013 (6) SML002 (7) SMLOOl (8) SH86 (9) SH66 (10) SH49 (11) SH43 (12) SH42 (13) KSL271 (14) KSL173 (15) KSL123 (16) KSL115 (17) KSL97 (18) KSL92 (19) KSL87 (20) KSL51 (21) KSL32 (22) KSL26 用所述专用引物获取结球叶用莴苣SSR指纹图谱，并用所述专用引物获取待鉴定品种 的指纹，将待测品种的指纹与所述的SSR指纹图谱进行对比，获得鉴定结果。2. 根据权利要求1所述的鉴定结球叶用莴苣品种的方法，其特征在于，通过以下方法获 取结球叶用莴苣SSR指纹图谱，包括以下步骤： A、 以叶用莴苣的基因组DNA为模板，用所述专用引物进行PCR扩增； B、 将步骤A中得到的扩增产物进行毛细管电泳，分别记录品种中SSR片段的长度； C、 按照电泳的峰值图读数，有峰记为1，无峰记为0,根据(0，1)数据矩阵，构建SSR指纹 图谱。3. 根据权利要求2所述的鉴定结球叶用莴苣品种的方法，其特征在于，应用于品种鉴定 时，将待鉴定品种的DNA用所述专用引物经PCR产物扩增，将产物对应的条带填写入相应的 (〇，1)标记表中得出待测品种的指纹，而后将待测品种的指纹与上述的SSR指纹图谱进行对 比，直接获得鉴定结果。
【文档编号】C12Q1/68GK105907866SQ201610348755
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】范双喜, 张鹏航, 韩莹琰, 罗江, 高琦, 刘超杰, 谷建田
【申请人】北京农学院