ontpellier、法国）或ISREC服务器中可利用的ALIGN程序中。为了比较氨基 酸序列而使用ALIGN程序的情况下，例如可以利用PAM120残基质量表，使间隙长度惩罚项 (gap lenth penalty) = 12、间隙惩罚项（gap penalty) = 4〇
[0172] 两个氨基酸序列的同源性可以使用GCG软件包的GAP程序，使用Bl〇SS〇m62矩阵 或PAM250矩阵，以间隙加权=12、10、8、6或4,间隙长加权=2、3或4来确定。另外，两个 核酸序列的同源度可以使用GCG软件包（http ://www. gcg. com中能够利用）的GAP程序， 以间隙加权=50、间隙长加权=3来确定。
[0173] 本发明的蛋白质可以是更大的蛋白质（例如融合蛋白质）的一部分。作为融合蛋 白质中所添加的序列，例如可以举出多重组氨酸残基这样的有助于精制的序列、确保重组 生产时的稳定性的添加序列等。
[0174] 具有上述氨基酸序列的本蛋白质可以通过基因工程方法容易地调制。例如可以用 编码本蛋白质的DNA对合适的宿主细胞（例如大肠杆菌）进行转染，回收在转染体内表达 的蛋白质，由此进行调制。所回收的蛋白质根据目的进行适当调制。只要由此作为重组蛋 白质得到本蛋白质即可，可为各种修饰。例如，若将编码本蛋白质的DNA和其他合适的DNA 插入相同的载体中，使用该载体，进行重组蛋白质的生产，则能够得到由连接了任意的肽或 蛋白质的重组蛋白质形成的本蛋白质。另外，也可以实施糖链及/或脂质的添加、或者N末 端或C末端的处理之类修饰。通过以上的修饰，能够简便地进行重组蛋白质的提取和精制、 或者生物学功能的增加等。
[0175] < 2.基因、重组载体、转染体>
[0176] (1)基因
[0177] 本发明中提供编码上述蛋白质的基因。一个方案中，本发明的基因包含编码序列 号10的氨基酸序列的DNA。该方案的具体例是由序列号6或序列号9的碱基序列组成的 DNA〇
[0178] 但是，一般而言，对编码某个蛋白质的DNA的一部分施加了改变的情况下，改变后 的DNA编码的蛋白质有时具有与改变前的DNA编码的蛋白质同等的功能。即，DNA序列的改 变对编码的蛋白质的功能没有实质影响，编码的蛋白质的功能在改变前后被维持。因此，在 本发明中，作为其他的方案，提供具有与序列号6或序列号9的碱基序列等价的碱基序列、 编码具有糖质氧化酶活性的蛋白质的DNA(以下也称为"等价DNA"）。此处的"等价碱基序 列"是指与序列号6或序列号9所示的核酸部分不同，但其所编码的蛋白质的功能（此处为 糖质氧化酶活性）没有因该差异而受到实质影响的碱基序列。
[0179] 等价DNA的具体例是对与序列号6或序列号9的碱基序列互补的碱基序列，在 严格条件下进行杂交的DNA。此处的"严格条件"是指形成所谓的特异性杂交、不形成非 特异性杂交的条件。这样的严格条件是本领域技术人员公知的，例如可以参照分子克隆 (Molecular Cloning)(第三版，冷泉港实验室出版，纽约）、现代分子生物学方法（Current protocols in molecular biology) (Frederick M.Ausubel et al?编，1987)进行设定。作 为严格条件，例如可以举出使用杂交液（50%甲酰胺、10XSSC(0. 15M NaCl，15mM柠檬酸钠， 口117.0)、5\061111&"以容液、1%505、10%葡聚糖硫酸、10 1^/1111的改性鲑鱼精0嫩、501111磷 酸缓冲液（pH 7. 5))，在约42°C~约50°C培养，之后使用0? 1XSSC、0. 1% SDS在约65°C~ 约70°C进行清洗的条件。作为更优选的严格条件，例如可以举出作为杂交液使用50%甲酰 胺、5XSSC(0.15M NaCl，15mM 柠檬酸钠，pH 7.0)、lXDenhardt 溶液、1%SDS、10% 葡聚糖 硫酸、l〇μg/ml的改性鲑鱼精DNA、50mM磷酸缓冲液（pH 7. 5))的条件。
[0180] 作为等价DNA的其他具体例，可以举出由以序列号6或序列号9所示的碱基序列 为基准，包含1或多个（优选为1~几个）碱基的取代、缺失、插入、添加或倒位的碱基序列 组成的、编码具有糖质氧化酶活性的蛋白质的DNA。碱基的取代、缺失等可以在多个部位发 生。此处的"多个"根据该DNA编码的蛋白质的立体构造中的氨基酸残基的位置、种类而不 同，例如为2~40碱基，优选为2~20碱基，更优选为2~10碱基。以上的等价DNA例 如可以利用限制酶处理、基于外切酶、DNA连接酶等的处理、基于位置指定突变导入法（分 子克隆（Molecular Cloning)，第三版，第13章，冷泉港实验室出版，纽约）、随机突变导入 法（分子克隆（Molecular Cloning)，第三版，第13章，冷泉港实验室出版，纽约）的突变 导入等，对具有序列号6或序列号9所表示的碱基序列的DNA进行改变，使其包含碱基的取 代、缺失、插入、添加及/或倒位而得到。另外，也可以通过紫外线照射等其他方法得到等价 DNA〇
[0181] 作为等价DNA的其他例，可以举出源于SNP(单核苷酸多态性）所代表的多态性， 能够识别上述那样的碱基差异的DNA。
[0182] 本发明的基因可参考本说明书或所附序列表公开的序列信息，使用标准的基因工 程方法、分子生物学方法、生化方法等而调制成分离的状态。具体而言，可以由合适的顶头 抱霉（Acremonium chrysogenum)的基因组DNA文库或cDNA文库或顶头抱霉（Acremonium chrysogenum)的菌体内提取液，适当利用对本发明的基因可特异性杂交的低聚核苷酸探 针?引物而调制。低聚核苷酸探针?引物可使用市售的自动化DNA合成装置等容易地合 成。应予说明，对于为了调制本发明的基因而使用的文库的制作方法，例如可以参照分子克 隆（Molecular Cloning)，第三版，冷泉港实验室出版，纽约。
[0183] 例如，若为具有序列号6或序列号9的喊基序列的基因，则可利用以该喊基序列 或其互补序列的整体或一部分为探针的杂交法进行分离。另外，可利用使用以对该碱基序 列的一部分特异性杂交的方式设计的合成低聚核苷酸引物的核酸扩增反应（例如PCR)进 行扩增以及分离。另外，还可以基于序列号10所示的氨基酸序列、序列号6或序列号9的 碱基序列的信息，通过化学合成而得到作为目标的基因（参考文献：Gene，60(l)，115 - 127(1987))。
[0184] 以下给出本发明的基因的取得方法的具体例。首先，从顶头孢霉（Acremonium chrysogenum)中分离、精制本酶（糖质氧化酶），获得涉及该部分氨基酸序列的信息。作为 部分氨基酸序列确定方法，例如、将精制的糖质氧化酶直接按照常规方法，通过埃德曼降解 法（Journal of Biological Chemistry、第 256 卷、第 7990 ~7997 页（1981))，供氨基酸 序列分析（蛋白质序列476A、Applied Biosystems公司制等）。使蛋白质水解酶作用，进 行限定水解，对得到的肽片段进行分离、精制，对得到的精制肽片段进行氨基酸序列分析是 有效的。
[0185] 基于由此得到的部分氨基酸序列信息，对糖质氧化酶基因进行克隆。例如可利用 杂交法或PCR进行克隆。在利用杂交法的情况下，例如可以使用分子克隆（第三版，第13 章，冷泉港实验室出版，纽约）中记载的方法。
[0186] 在利用PCR法的情况下，可以使用以下的方法。首先，以产生糖质氧化酶的微生 物的基因组DNA为模板，使用基于部分氨基酸序列的信息设计的合成寡核苷酸引物，进行 PCR反应，得到目标基因片段。PCR法基于PCR技术〔PCR Technology、Erlich HA编纂、 Stocktonpress公司、1989年发行〕中记载的方法进行。进而，对于该扩增DNA片段，通过通 常使用的方法、例如通过双脱氧链终止法确定碱基序列时，所确定的序列中除了合成低聚 核苷酸引物的序列之外观察到对应于糖质氧化酶的部分氨基酸序列的序列，能够获得目标 糖质氧化酶基因的一部分。以得到的基因片段为探针，进一步进行杂交法等，由此能够将编 码糖质氧化酶全长的基因克隆。
[0187] 在后述的实施例中，利用PCR法确定编码顶头孢霉（Acremonium chrysogenum)所 产生的糖质氧化酶的基因的序列。编码来自于顶头孢霉（Acremonium chrysogenum)的糖 质氧化酶的基因的全部碱基序列示于序列号6,编码该酶的cDNA的全部碱基序列示于序列 号9。另外，确定了该碱基序列所编码的氨基酸序列（序列号10)。应予说明，对应于序列 号10所示的氨基酸序列的碱基序列除了序列号6或序列号9中记载的以外，还存在多个。
[0188] 通过将全部碱基序列都明确了的糖质氧化酶基因（序列号6)的整体或者一部分 用作杂交用探针，能够从产生其他糖质氧化酶的微生物的基因组DNA文库或者cDNA文库中 选出与序列号6或序列号9的糖质氧化酶基因同源性高的DNA。
[0189] 同样地可设计PCR用引物。通过使用该引物进行PCR反应，能够检测与上述糖质 氧化酶基因同源性高的基因片段，进而还能够得到其基因整体。
[0190] 制备如上所述得到的基因的蛋白质，测定其糖质氧化酶活性，由此能够确认是否 为编码具有糖质氧化酶活性的蛋白质的基因。另外，通过将得到的基因的碱基序列（或其 所编码的氨基酸序列）与上述糖质氧化酶基因的碱基序列（或其所编码的氨基酸序列）进 行比较，可以研宄基因构造、同源性，判定是否编码具有糖质氧化酶活性的蛋白质。
[0191] 因为一次构造以及基因构造确定，所以可通过导入随机突变或者部位特异性而得 到改变型糖质氧化酶（实施了 1个或多个氨基酸残基的缺失、添加、插入或取代的基因）。 由此，能够得到编码虽然具有糖质氧化酶活性、但最佳温度、稳定温度、最佳PH、稳定pH、基 质特异性等性质不同的糖质氧化酶的基因。另外，能够采用基因工程方法制备改变型糖质 氧化酶。
[0192] 此处，导入突变时的计划可参考例如基因序列方面的特征序列而进行。特征性序 列的参考例如可通过预测该蛋白质的立体构造、考虑与已知蛋白质的同源性来进行。
[0193] 作为导入随机突变的方法，例如可以举出对DNA进行化学处理的方法，即，使亚 硫酸氢钠作用，引发将胞嘧啶碱基转换成尿嘧啶碱基的转型突变的方法（Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA、第 79 卷、第 1408 ~1412 页（1982));生 化方法，即在〔a - S〕dNTP存在下合成双链的过程中产生碱基取代的方法（Gene、第64卷、 第313~319页（1988));使用PCR的方法，即在反应体系中加入锰进行PCR，降低核苷酸的 导入准确性的方法（Analytical Biochemistry、第224卷、第347~353页（1995))等。
[0194] 作为导入部位特异性突变的方法，例如可以举出利用琥珀突变的方法（gapped duplex 法、Nucleic Acids Research、第 12 卷、第 24 号、第 9441 ~9456 页（1984))、利用 限制酶的识别部位的方法（Analytical Biochemistry、第200卷、第81~88页（1992)、 GENE、第102卷、第67~70页（1991))、利用dut(dUTPase)和ung(尿嘧啶DNA糖酶）突 变的方法（Kunkel 法、Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA、 第82卷、第488~492页（1985))、利用使用DNA聚合酶以及DNA连接酶的琥珀突变的方 法（Oligonucleotide - directed Dual Amber (0DA)法、GENE、第 152 卷、第 271 ~275 页 (1995)、日本特开平7 - 2892