基因、微生物、转换方法及制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因、微生物、转换方法及制造方法。
【背景技术】
[0002] 近些年，从化石资源枯竭或全球变暖对策等观点来看，以可再生资源为原料的化 合物制造工艺受到了关注。特别是，以生物质作为原料的、利用生物化学工艺来制造各种聚 合物原料化合物或化学品原料化合物的、所谓的生物炼制被广泛研宄。
[0003] 作为被期待进行生物质的原料转化的化合物，可举出丁二醇（指1，3-丁二醇及 1，4-丁二醇）。例如，1，4-丁二醇被用作精密有机化学品的合成原料、聚酯及工程塑料的单 体单位等，1，3- 丁二醇被用作有机溶剂或化妆品基质等。无论1，4- 丁二醇还是1，3- 丁二 醇的情况，均对于以生物质等可再生资源为原料的生物化学工艺的要求变大。
[0004] 作为利用生物化学工艺的丁二醇的制造方法，例如可举出专利文献1~3及非专 利文献1记载的方法。
[0005] 专利文献1 :(日本）专利第4380704号公报
[0006] 专利文献2 :国际公布2008/115840号公报
[0007] 专利文献3 :国际公布2010/127319号公报
[0008] 非专利文献 1 :Harry Yim et al.，Metabolic engineering of Escherichia coli for direct production of 1，4-butanediol，Nature Chemical Biology，7, 445-452 (2011).
【发明内容】
[0009] 〈本发明所要解决的技术问题〉
[0010] 然而，专利文献1~3及非专利文献1记载的方法的工艺复杂。
[0011] 针对上述问题，要提供一种新的1，4- 丁二醇的制造方法，其能够经济地获得丁二 醇。另外，提供与该制造方法关联的转换方法、以及能够适用于该制造方法及该转换方法的 基因、微生物。
[0012] 〈用于解决技术问题的方案〉
[0013] 作为本发明人为解决上述问题而进行积极研宄的结果，发现了特定的基因较有 效，并得到本发明。换言之，本发明包括以下内容。
[0014] [1] 一种基因，其为下述（a)~（c)中任一项所述的基因：
[0015] (a)具有序列号1的喊基序列的基因；
[0016] (b)具有在序列号1的碱基序列中缺失、取代或插入一个或多个碱基的碱基序列 的基因，其中该基因具有相对于序列号1的喊基序列的90%以上的同一性的喊基序列；
[0017] (c)在严格条件下将具有序列号1记载的碱基序列的基因与具有互补的碱基序列 的基因杂交的基因，
[0018] 其中，所述基因通过与编码烯酰CoA水合酶的基因组合，从而能够对微生物或该 微生物的培养物赋予将3-羟基丁酰CoA转换成4-羟基丁酰CoA、或将4-羟基丁酰CoA转 换成3-羟基丁酰CoA的能力。
[0019] [2]根据[1]所述的基因，其中，所述微生物是大肠杆菌、酵母、棒状杆菌、或梭菌。
[0020] [3] -种微生物，其包括根据[1]所述的基因、以及编码烯酰CoA水合酶的基因。
[0021] [4]根据[3]所述的微生物，其中，所述微生物还包括编码酰基CoA还原酶的基因。
[0022] [5] -种转换方法，其利用根据[3]所述的微生物或该微生物的培养物，将3-羟基 丁酰CoA转换成4-羟基丁酰CoA、或将4-羟基丁酰CoA转换成3-羟基丁酰CoA。
[0023] [6] -种制造方法，其利用根据[4]所述的微生物或该微生物的培养物来制造 1，4_ 丁二醇。
[0024] [7]根据[6]所述的制造方法，其中，所述微生物包含编码乙酰乙酰CoA合酶或乙 酰乙酰CoA还原酶中的至少一者的基因。
[0025] [8]根据[6]所述的制造方法，其中，从乙酰CoA经由3-羟基丁酰CoA来制造 1，4_ 丁二醇。
[0026] 〈发明的效果〉
[0027] 能够提供一种经济的1，4- 丁二醇的制造方法。另外，能够提供与该制造方法关联 的转换方法、以及能够适用于该制造方法及该转换方法的基因、微生物。
【附图说明】
[0028] 图1是用于对本实施方式的3-羟基丁酰和4-羟基丁酰之间的转换方法进行说明 的概要图。
【具体实施方式】
[0029] 以下，使用图1对本发明进行详细说明。需要说明的是，在本说明书中，"CoA"意 味着辅酶A。
[0030] (基因）
[0031] 首先，对本实施方式的基因进行说明，该基因通过与编码烯酰CoA水合酶的基因 组合，从而能够对微生物或该微生物的培养物赋予将3-羟基丁酰CoA转换成4-羟基丁酰 CoA、或将4-羟基丁酰CoA转换成3-羟基丁酰CoA的能力。
[0032] 本实施方式的基因是具有序列号1的碱基序列的基因和其同源物。本实施方式的 基因通过与编码烯酰CoA水合酶的基因组合并通过转化而在微生物体内表达，从而能够应 用到例如3-羟基丁酰和4-羟基丁酰之间的转换方法、或1，4- 丁二醇的制造方法。
[0033] 本实施方式中的同源物（homolog)包括直系同源物和旁系同源物。直系同源物是 指在从共同祖先的基因分化而生成的种类之间对应的基因及由该基因得到的酶的组合。旁 系同源物是指在同种内，在不是通过分化而是通过基因重复而生成的种类之间对应的基因 及由该基因得到的酶的组合。同源物是指与直系同源物、旁系同源物无关地、在序列上具有 同一性的基因及由该基因得到的酶。
[0034] 具体来说，具有序列号1记载的碱基序列的基因的同源物基因包括含有与序列号 1记载的碱基序列具有90%以上的同一性、优选95%以上的同一性的碱基序列的基因，更 优选是缺失、取代或插入了一个或多个该基因的碱基的基因。
[0035] 另外，该同源物基因包括在严格条件下将具有序列号1记载的碱基序列的基因与 具有互补的碱基序列的基因杂交的基因。具体来说，通过应用针对公知的数据库的同源性 检索程序（例如BLAST、FASTA)、或基于在利用由认定基因的至少一部分构成的探针（由该 基因的碱基序列构成的DNA和由互补的碱基序列构成的DNA)的严格条件下的杂交或聚合 酶链反应（PCR)等常规方法，能够取得基因（或由该基因的转化得到的酶）。另外，只要是本 领域的技术人员，就能够通过对碱基序列进行取代，来亲自进行设计。需要说明的是，作为 在此所说的严格条件，例如可以举出非专利文献Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION(Joseph Sambrook, David ff.Russell. , Cold Spring Harbor Laboratory Press)中记载的进行杂交的条件。具体来说，是在包含6 XSSC (IX SSC的组成：为0. 15M氯 化钠、0. 015M 柠檬酸钠，pH:7. 0)、0. 5% SDS、5XDenhardt 溶液及 100mg/mL 鲱鱼精子 DNA 的溶液中，与探针一起在65°C下保持恒温8~16小时，进行杂交的条件。
[0036] (微生物）
[0037] 作为能够导入本实施方式的基因及编码烯酰CoA水合酶的基因的转化宿主微生 物的例子，只要是能够使用基因重组技术的微生物，便无特别限定。从产业利用的观点来 看，作为具体例子，可以举出大肠杆菌、酵母、棒状杆菌、或梭菌属细菌。作为酵母，可举出 酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母等。作为棒状杆菌，可举 出谷氨酸棒杆菌、有效棒杆菌（Corynebacterium efficiens)、短杆菌（Brevibacterium divaricatum)、糖短杆菌、immariophilum 短杆菌（Brevibacterium immariophilum)、乳 发酵短杆菌、玫瑰色短杆菌、黄色短杆菌、生硫短杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、醋谷棒杆菌、帚 石南棒杆菌、百合棒状杆菌、mellassecola棒状杆菌（Corynebacterium mellassecola)、 嗜氨微杆菌等。作为梭菌，可举出克氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、氨基酪酸梭菌、拜氏梭菌、 saccharoperbutylacetonicum 梭菌（Clostridium saccharoperbutylacetonicum)等。其 中，由于使用大肠杆菌、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母，或谷氨酸棒杆菌容易进行转化，因此优选 使用，更优选使用大肠杆菌。
[0038] 另外，本实施方式的转化微生物可以用于微生物培养菌体本身或其培养物的各种 形态。具体来说，本实施方式中的微生物的培养物包含微生物培养菌体的培养基或由缓冲 液等介质构成的悬浊物、来自微生物培养菌体的无细胞抽出液、以及从该无细胞抽出液浓 缩、精炼或提取对该反应进行催化的成分的处理物等处理物。本实施方式中的微生物的培 养物还包含将该微生物的处理物固定在难溶性的载体上的物质。作为该类固定载体，可以 举出聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚-N-乙烯基甲酰胺、聚烯丙胺、聚乙烯亚胺、甲基纤维素、葡 甘露聚糖、藻酸盐、角叉菜胶等、以及其共聚物或交联化物等、形成封装了该微生物菌体或 其处理物的水难溶性的固体含量的化合物。其可以单独使用一种，也可以混合使用两种以 上。另外，活性炭、多孔陶瓷、玻璃纤维、多孔聚合物成型体、硝化纤维素膜等、在预先作为固 形物形成的物体上保持微生物或者其提取液或提取成分的物体也可以被用作微生物的培 养物。
[0039] (转换方法）
[0040] 如上所述，本实施方式的基因通过与编码烯酰CoA水合酶的基因组合并通过转化 而在微生物体内表达，从而能够应用到3-羟基丁酰和4-羟基丁酰之间的转换方法。
[0041] 图1表示出用于对本实施方式的3-羟基丁酰和4-羟基丁酰之间的转换方法进行 说明的概要图。如果向下述微生物体内供给3-羟基丁酰CoA，则通过该基因的作用，羟基 (0H基）发生重排反应，3-羟基丁酰CoA被转换成4-羟基丁酰C〇A(S105及S107)。另外， 如果向该微生物体内供给4-羟基丁酰CoA，则通过该基因的作用，0H基发生重排反应，4-羟 基丁酰CoA被转换成3-羟基丁酰CoA。
[0042] 序列号1所示的基因的针对氨基酸序列的翻译结果、与可参见GenBank的 登记号AJ250267的源于氨基酪酸梭菌（Clostridium aminobutyri