能够代谢木糖且对抑制剂耐受的酵母菌株、其获得方法及其用图
【专利说明】能够代谢木糖且对抑制剂耐受的酵母菌株、其获得方法及 其用途 发明领域
[0001] 本发明涉及能够代谢木糖且还表现出对至少一种发酵抑制剂的耐受性的酵母菌 株的领域，涉及其获得方法，涉及从所述酵母菌株获得的酵母和涉及其用于在包含木糖的 培养基中、任选在至少一种发酵抑制剂存在的情况下产生发酵产物的用途。
【背景技术】
[0002] 文献PCT/EP2011/071616描述了用于经由表达XI-XDH代谢途径在含有至少一种 戊糖的培养基中产生乙醇的酵母。所述文献首次描述了木糖异构酶（XI)活性的过表达与 木糖醇脱氢酶（XDH)活性的过表达的组合，并且显示木糖醇脱氢酶活性的过表达使得可 能防止木糖醇对木糖异构酶活性的抑制。文献PCT/EP2011/071616描述了，例如，以编号 1-4538于2011年10月5日保藏于CNCM[国家微生物培养物保藏中心]的酵母菌株。
[0003] 酵母从木质纤维素水解产物工业生产乙醇不仅需要用于代谢戊糖的遗传机制，而 且需要对这些木质纤维素水解产物中存在的发酵抑制剂的耐受性的特性。
[0004] 发酵抑制剂在木质纤维素生物质的预处理和水解过程中产生。发酵抑制剂有糠醛 类（糠醛，HMF)、酚类化合物类和有机酸类（乙酸、乙酰丙酸、甲酸）。
[0005] 已经描述了对抗发酵抑制剂的作用的各种方式，其中有发酵培养基的解毒、发酵 方法的改进或酵母对发酵抑制剂的耐受性的改进。
[0006] 酵母对发酵抑制剂的耐受性，例如，已经通过定向进化或通过环境适应 (acclimatization)来遗传改进（Almeida 和 Hahn-HSgerdal， International Sugar Journal，2009, Vol. 111，No. 1323) 〇
[0007] 然而，提供给出以下酵母的工业酵母菌株似乎是困难的，所述酵母既对于在包含 至少一种戊糖的发酵培养基中的乙醇生产是有效的，又对至少一种发酵抑制剂耐受。
[0008] 因此，的确需要提供甚至在至少一种发酵抑制剂诸如乙酸存在的情况下能够代谢 至少一种戊糖（例如木糖）的新型酵母菌株，所述酵母菌株甚至在至少一种发酵抑制剂存 在的情况下提供有效生产乙醇的酵母。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明的第一个目的涉及以编号1-4627保藏于CNCM[国家微生物培养物保藏中 心]的酵母菌株。
[0011] 本发明的第二个目的涉及用于获得能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株的方 法，其包括以下步骤：
[0012] -将以编号1-4538保藏于CNCM[国家微生物培养物保藏中心]的酵母菌株与以编 号1-4627保藏于CNCM的酵母菌株杂交，以便获得至少一种杂合体，
[0013] -选择能够代谢木糖且对乙酸耐受的至少一种杂合体。
[0014] 本发明的第三个目的涉及能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株，其可以借助如 上所定义的方法获得。
[0015] 本发明的第四个目的涉及衍生自如上所定义的酵母菌株的酵母菌株，其特征在于 所述衍生的酵母菌株能够代谢木糖且对乙酸耐受。
[0016] 本发明的第五个目的涉及通过培养如上所定义的酵母菌株或通过培养如上所定 义的衍生的酵母菌株而获得的酵母。
[0017] 本发明的第六个目的涉及用于产生至少一种发酵产物的方法，其包括使用如上所 定义的酵母在厌氧条件下发酵的步骤。
[0018] 本发明的第七个目的涉及如上所定义的酵母用于优选在包含木糖和/或一种发 酵抑制剂的发酵培养基中产生至少一种发酵产物的用途。
【附图说明】
[0019] 图1:1-4538酵母菌株(菱形）、H1酵母菌株（正方形）、ED1酵母菌株（三角形）、 ED2酵母菌株（圆形）和ED3酵母菌株（十字）在YFGX-Ac发酵培养基中在32°C下随时间 (以小时计）的乙醇产量（以g/kg发酵培养基计）。
[0020] 图2:1-4538酵母菌株(菱形）、ED1酵母菌株（三角形）和ED2酵母菌株（圆形） 在培养基A中在32°C下随时间（以小时计）的乙醇产量（以g/kg发酵培养基计）。
[0021] B 3:1-4538酵母菌株（菱形）、EDI酵母菌株（三角形）、ED2酵母菌株（圆形） 和ED3酵母菌株（十字）在培养基A中在35°C下随时间（以小时计）的乙醇产量（以g/ kg发酵培养基计）。
[0022] B 4:1-4538酵母菌株（菱形）、EDI酵母菌株（三角形）、ED2酵母菌株（圆形） 和ED3酵母菌株（十字）在培养基B中在35°C下随时间（以小时计）的乙醇产量（以g/ kg发酵培养基计）。
[0023] 定义
[0024] 表述"酵母菌株"表示酵母细胞的相对均匀群体。
[0025] 酵母菌株获得自克隆的分离，克隆是获得自单一酵母细胞的细胞群体。
[0026] 术语"外源"基因意指所考虑物种的酵母菌株中非天然存在的基因。
[0027] 术语"内源"基因意指所考虑物种的酵母菌株中天然存在的基因。
[0028] 木糖异构酶或XI在本文中表示能够在单一步骤中将D-木糖转化为D-木酮糖且 其对应于分类EC5. 3. 1. 5的酶。
[0029] 木糖醇脱氢酶或XDH在本文中表示能够在单一步骤中将木糖醇转化为D-木酮糖 且其对应于分类EC 1. 1. 1. 9的酶。
[0030] 木糖还原酶或XR在本文中表示能够在单一步骤中将D-木糖转化为木糖醇且其对 应于分类EC 1. 1. 1. 307的酶。
[0031] D-木酮糖激酶或)(KS在本文中表示能够在单一步骤中将D-木酮糖转化为D-木酮 糖-5-磷酸且其对应于分类EC 2. 7. 1. 17的酶。
[0032] GRE3基因编码对应于分类EC 1. 1. 1. 21的醛糖还原酶。
[0033] RPE1基因编码对应于分类EC 5. 1. 3. 1的D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶。
[0034] RKI1基因编码对应于分类EC 5. 3. 1. 6的核糖-5-磷酸酮醇-异构酶。
[0035] TKL1基因编码对应于分类EC2. 2. 1. 1的转酮醇酶。
[0036] TALI基因编码对应于分类EC2. 2. 1. 2的转醛醇酶。
[0037] 原养型酵母菌株是能够在基础培养基上生长的酵母菌株。具体而言，根据本发明 的原养型酵母菌株能够合成其生长所需的所有氨基酸和碱。
[0038] 基础培养基是包含碳源（CxHyOz)、无机氮源、钾源、磷源、硫源、镁源、钙源、铁源、微 量元素源和水的培养基。
[0039] 基础培养基的一个实例是向其中添加碳源（例如糖）和无机氮源（例如硫酸铵） 的YNB(酵母氮基）培养基。
[0040] YNB培养基每升包含：2yg生物素、400yg泛酸钙、2yg叶酸、2000yg肌醇、 400 y g烟酸、200 y g对氨基苯甲酸、400 y g盐酸吡哆醇、200 y g核黄素、400 y g盐酸硫胺 素、500 y g硼酸、40 y g硫酸铜、100 y g碘化钾、200 y g氯化铁、400 y g硫酸锰、200 y g钼酸 钠、400 y g硫酸锌、lg磷酸二氢钾、500mg硫酸镁、100mg氯化钠、100mg氯化H5g/1硫酸 铵，最终pH 5. 4。
[0041] 表述"衍生的酵母菌株"表示通过一次或多次杂交和/或通过突变和/或通过遗 传转化衍生的酵母菌株。
[0042] 通过杂交衍生的酵母菌株可以通过将根据本发明的酵母菌株与相同的酵母菌株、 根据本发明的另一种酵母菌株、或与任何其他酵母菌株杂交来获得。
[0043] 通过突变衍生的酵母菌株可以是已经在其基因组中经历至少一个自发突变或通 过诱变诱导的至少一个突变的酵母菌株。衍生菌株的突变可以是或可以不是沉默的。
[0044] 表述"诱变"既表示通过施加辐射（例如UV辐射）或使用化学诱变剂获得的随机 诱变，又表示通过转座或通过外源DNA片段的整合的插入或定点诱变。
[0045] 通过遗传转化衍生的酵母菌株是其中已经引入DNA序列的酵母菌株，所述DNA序 列优选由质粒提供，或直接整合到基因组中。
[0046] 发明详述
[0047] 本发明的目的是提供甚至在至少一种发酵抑制剂诸如乙酸存在的情况下能够代 谢至少一种戊糖（特别是木糖）的酵母菌株。
[0048] 对于本发明的目的，能够代谢木糖的酵母菌株是能够在包含木糖的培养基中在厌 氧条件下生产乙醇的酵母菌株。
[0049] 具体地，能够代谢木糖的酵母菌株是能够将木糖转化为乙醇（即能够发酵木糖） 的酵母菌株。
[0050] 木糖向乙醇的转化由木糖向木酮糖的直接或间接异构化，随后使用戊糖磷酸途径 的非氧化部分中所得木酮糖而产生。
[0051] 对于本发明的目的，能够代谢木糖的酵母菌株是能够在包含55g葡萄糖和45g木 糖/kg发酵培养基的发酵培养基中在厌氧条件下在60小时内将至少70%、优选至少80%、 更优选至少90%的木糖转化为乙醇的酵母菌株。
[0052] 用于测量转化为乙醇的木糖的百分比的酵母菌株的接种量优选为0. 25g干物质/ kg发酵培养基。
[0053] 从酵母菌株接种到发酵培养基中开始计算60小时的时间段。
[0054] 用于测量转化为乙醇的木糖的百分比的发酵培养基优选为合成培养基。
[0055] 合成培养基是确切化学组成已知的培养基。
[0056] 根据本发明的合成培养基包含碳源、氮源、磷源和还有对于酵母菌株的生长必需 的维生素和矿物质。
[0057] 在一个优选的实施方案中，用于测量转化为乙醇的木糖的百分比的发酵培养基是 包含55g/kg葡萄糖、45g/kg木糖、10g/kg酵母提取物、10g/kg蛋白胨和2000ppm乙酸的 YFGX合成培养基（用K0H将pH调节至5)。
[0058] 在YFGX培养基中，pH5的以2000ppm的浓度存在的乙酸没有抑制作用。
[0059] 发酵优选在32 °C下在温和搅拌（例如90rpm)下进行。
[0060] 搅拌温和，以便不需要充氧。
[0061] 优选例如通过YFGX培养基中的酸/碱对的缓冲能力，例如乙酸/乙酸盐缓冲能力 来控制培养基的pH。
[0062] 发酵培养基中存在的乙醇量通过本领域技术人员已知的任何适当的方式来测量。
[0063] 它可以涉及生产的乙醇的直接测量，或经由与乙醇生产相关的参数（诸如质量损 失）的间接测量。
[0064] 例如，乙醇生产可以通过色谱法，尤其是通过HPLC(高效液相色谱）、酶试剂盒（例 如，来自Boehringer的乙醇测定试剂盒）或使用重络酸钾的测定法，来测量。
[0065] 发酵培养基中存在的木糖量通过本领域技术人员已知的任何适当的方式，优选通 过色谱法，尤其是通过HPLC，来测量。
[0066] 使用包含