葡萄糖和木糖两者的发酵培养基使得可能使用对于评价的各种酵母菌 株相当的生物质的量来评价木糖向乙醇的转化。事实上，酵母菌株首先发酵葡萄糖和木糖 混合物中的葡萄糖，然后发酵葡萄糖和木糖。
[0067] 在至少一种发酵抑制剂存在的情况下代谢木糖的能力被描述为对所述发酵抑制 剂的耐受性。
[0068] 在本发明的上下文中，发酵抑制剂优选为乙酸。
[0069] 它是乙酸的非离子化形式，从某一浓度开始，称为毒性浓度，这负责其毒性，因此， 负责其抑制作用。
[0070] 例如，乙酸（pH 4. 4)的4000ppm的浓度对于不耐受乙酸的菌株（诸如1-4538酵 母菌株）而言是毒性浓度。
[0071] 在厌氧条件下的发酵过程中，乙酸的抑制作用特别导致糖向生物量和向乙醇的转 化起始的延迟。
[0072] 对乙酸的耐受性在本文中相对于糖向乙醇的转化起始的延迟，S卩，乙醇发酵的起 始的延迟，进行测量。
[0073] 代表作为时间的函数产生的乙醇的量的乙醇发酵曲线通常包含三个阶段：
[0074] _潜伏期，在其过程中，没有乙醇产生，
[0075] -乙醇产生期，和
[0076] _平台期，其对应于发酵结束。
[0077] 乙醇发酵的起始的延迟在本文中对应于线原点的x轴，其代表乙醇产率的最大导 数。
[0078] 更简单地，乙醇发酵的起始的延迟在本文中对应于线原点的x轴，其代表乙醇产 生期的斜率。
[0079] 对乙酸耐受的酵母菌株在本文中定义为在包含4000ppm乙酸（pH 4. 4)的发酵培 养基中具有小于30小时、优选小于29小时、更优选小于28小时的乙醇发酵的起始的延迟 的酵母菌株。
[0080] 用于评价对乙酸的耐受性的发酵培养基优选为合成培养基，更优选YFAc培养基。
[0081] YFAc培养基的组成如下：150g/kg葡萄糖、5g/kg酵母提取物、4. 7g/kg DAP(磷 酸氢二按）、11. 5g/kg 朽1 檬酸、4g/kg 乙酸、13. 5g/kg 朽1 檬酸钠、lml/kg Tween 80、2ml/kg ZnS04(10. 6g/l)、2. 5ml/kg MgS04. 7H20(400g/l)、lml/kg 硫胺素（18. 24g/l)、lml/kg P比口多 醇（5. 28g/l)、lml/kg 生物素（1. 76g/l)、lml/kg 泛酸盐（3. 8g/l)、2. 5ml/kg 烟酸（8g/l)、 lml/kg内消旋肌醇（50g/l)，lml/kg核黄素（在lg/1)、lml/kg对氨基苯甲酸盐（1. 2g/l)， 用KOH将pH调节至4. 4。
[0082] 用于评价对乙酸的耐受性的酵母菌株的接种量优选为0. 25g干物质/kg发酵培养 基。
[0083] 乙醇发酵曲线的时间t = 0对应于将酵母菌株接种到发酵培养基中的时间。
[0084] 乙醇发酵在厌氧条件下，优选在32°C和温和搅拌（例如90rpm)下进行。
[0085] 搅拌温和，以便不需要充氧。
[0086] 优选例如通过YFAc培养基中的酸/碱对的缓冲能力，例如乙酸/乙酸盐缓冲能力 来控制培养基的pH。
[0087] 在YFAc发酵培养基中，对乙酸不耐受的酵母菌株可以具有至少40小时的乙醇发 酵起始的延迟。
[0088] 本发明人已经寻求获得甚至在乙酸存在的情况下能够代谢木糖的酵母菌株，从在 将木糖转化为乙醇方面有效的酵母菌株开始。
[0089] 选择作为从赋予其对乙酸的耐受性的特征的观点来看改进的起始菌株的在木糖 转化为乙醇方面有效的酵母菌株是1-4538酵母菌株，其在布达佩斯条约下在2011年10 月5日保藏于CNCM(国家微生物培养物保藏中心），25，rue du Docteur Roux，75724Paris cedex 15,法国。
[0090] 1-4538酵母菌株在包含55g葡萄糖和45g木糖/kg培养基的YFGX发酵培养基中 在60小时内将至少90%木糖转化为乙醇。
[0091] 然而，1-4538酵母菌株对乙酸特别敏感；它在包含4000ppm乙酸（pH 4. 4)的YFAc 发酵培养基中具有至少40小时的乙醇发酵起始的延迟。
[0092] 1-4538酵母菌株是通过定向进化从酵母菌株获得的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)菌株，所述酵母菌株通过以下遗传修饰：
[0093] -在pADHl启动子和CYC1终止子的控制下插入至少一个拷贝的编码Clostridium phytofermentans的木糖异构酶（XI)的外源基因，
[0094] -在pADHl启动子和CYC1终止子的控制下插入至少一个拷贝的编码树干毕赤酵母 (Pichiastipitis)的木糖醇脱氢酶（XDH)的外源基因，
[0095] -至少一个拷贝的TALI内源基因，将其置于pPGKl启动子的控制下，
[0096] -至少一个拷贝的TKL1内源基因，将其置于pTDH3启动子的控制下，
[0097] -至少一个拷贝的RPE1内源基因，将其置于pTDH3启动子的控制下，
[0098] -至少一个拷贝的RKI1内源基因，将其置于pTDH3启动子的控制下，
[0099] -在pADHl启动子和CYC1终止子的控制下插入至少一个拷贝的编码木酮糖激酶 (XKS1)的内源基因，
[0100] -缺失至少一个拷贝的编码醛糖还原酶的GRE3内源基因的开放阅读框。
[0101] 1-4538酵母菌株不含任何残留的可选择标记。
[0102] 1-4538酵母菌株不包含编码外源来源的XR的基因，也不包含araA、araB或AraD 基因。
[0103] 编码Clostridium phytofermentans的木糖异构酶（XI)的外源基因是文献 DE102008031350中描述的优化序列SEQ ID N0:3的基因。
[0104] 编码树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶（XDH)的外源基因是Genbank上参考序列 X55392. 1的基因。
[0105] pADHl、pPGKl和pTDH3启动子是酿酒酵母的启动子。
[0106] CYC1终止子是酿酒酵母的启动子。
[0107] 1-4538酵母菌株是非整倍体的工业酵母菌株。
[0108] 1-4538酵母菌株是原养型的。
[0109] 为了在1-4538酵母菌株上赋予对乙酸的耐受性的性质，但基本上不改变其代谢 木糖的能力，本发明人已经选择使用菌株杂交技术。
[0110] 据本发明人所知，这是首次杂交技术用于改进遗传修饰的非整倍体酵母菌株。
[0111] 事实上，当起始酵母菌株如下时，本领域技术人员将不会乍看之下将预期使用杂 交技术：
[0112] -包含不少于八个遗传修饰，其必须先验被转移到选择的分离子，
[0113] -是非整倍体酵母菌株且在不存在严格二倍体的情况下存在分离问题，
[0114] -已经经历在定向进化背景下的诱变步骤，这可能是杂交困难的原因，特别是在导 致萌发问题（germination problems)的染色体易位的情况下。
[0115] 因此，在1-4538酵母菌株和对乙酸耐受且未经遗传修饰、即不具有木糖发酵所需 的遗传机制的酵母菌株之间进行杂交。
[0116] 用于杂交的对乙酸耐受的酵母菌株在YFAc发酵培养基中具有小于14小时的乙醇 发酵起始的延迟。
[0117] 杂交的结果不是结论性的：尽管对乙酸耐受的特征确实被转移到杂合体，但后者 的效率远低于用于将木糖转化为乙醇的起始1-4538酵母菌株。
[0118] 在最好的情况下，获得的杂合体在包含55g葡萄糖和45g木糖/kg培养基的YFGX 发酵培养基中在60小时内将40%木糖转化为乙醇。
[0119] 发明人试图通过定向进化改进这些杂合体的木糖发酵，但没有进一步成功。
[0120] 因此本发明人已经证明，为了通过杂交转移对乙酸耐受的特征，而不损失有效代 谢木糖的能力，必需将1-4538酵母菌株与对乙酸耐受且具有类似的遗传背景（即其也具有 代谢木糖的遗传机制）、但无需在代谢木糖方面有效的酵母菌株杂交。
[0121] 使用的既对乙酸耐受、且还具有代谢木糖的遗传机制的酵母菌株是根据布达佩斯 条约于2012年5月24日以编号I 4627保藏于CNCM(国家微生物培养物保藏中心），25， rue du Docteur Roux，75724Paris cedexl5,法国的酿酒酵母菌株。
[0122] 因此，通过杂交1-4538酵母菌株与1-4627酵母菌株，本发明人已经获得了既能效 代谢木糖又对乙酸耐受的酵母菌株。
[0123] 因此，本发明的目的是以编号1-4627保藏于CNCM的酵母菌株。
[0124] 1-4627菌株构成了用于获得根据本发明的酵母菌株的两种起始菌株之一。
[0125] 1-4627酵母菌株是一种新颖酵母菌株，其通过将对乙酸耐受且未经遗传修饰的非 整倍体酵母菌株与经遗传修饰的非整倍体酵母菌株杂交的原始方法而获得。
[0126] 因此，1-4627酵母菌株已经通过以下方式获得：
[0127] -选择对乙酸耐受、即在YFAc发酵培养基中具有小于14小时的乙醇发酵起始的延 迟的酵母菌株。
[0128] -选择通过以下遗传修饰的酵母菌株：
[0129] 〇在pADHl启动子和CYC1终止子的控制下插入至少一个拷贝的编码Clostridium phytofermentans的木糖异构酶（XI)的外源基因，
[0130] 〇在pADHl启动子和CYC1终止子的控制下插入至少一个拷贝的编码树干毕赤酵 母的木糖醇脱氢酶（XDH)的外源基因，
[0131] 〇至少一个拷贝的TALI内源基因，将其置于pPGKl启动子的控制下，
[0132] 〇至少一个拷贝的TKL1内源基因，将其置于pTDH3启动子的控制下，
[0133] 〇至少一个拷贝的RPE1内源基因，将其置于pTDH3启动子的控制下，
[0134] 〇至少一个拷贝的RKI1内源基因，将其置于pTDH3启动子的控制下，
[0135] 〇在pADHl启动子和CYC1终止子的控制下插入至少一个拷贝的编码木酮糖激酶 (XKS1)的内源基因，
[0136] 〇缺失至少一个拷贝的编码醛糖还原酶的GRE3内源基因的开放阅读框，
[0137] -将所述对乙酸耐受的酵母菌株与所述遗传修饰的酵母菌株杂交，以便获得杂合 体，
[0138] _定向进化所述杂合体，以便获得1-4627酵母菌株。
[0139] 1-4627酵母菌株包含在pADHl启动子和CYC1终止子的控制下的至少一个拷贝的 编码Clostridium phytofermentans的木糖异构酶（XI)的外源基因、在pADHl启动子和 CYC1终止子的控制下的至少一个拷贝的编码树干