用于制备富含由微藻产生的叶黄素的组合物的方法
【专利说明】用于制备富含由微藻产生的叶黄素的组合物的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及一种用于获得富含由微藻更具体地是由小球藻科的微藻产生的、甚至 更确切地由普通小球藻产生的叶黄素的组合物的方法。
[0002] 现有技术水平的呈现
[0003] 类萌萝卜素在某种程度上是在非常大量的生物有机体中广泛分布的橙色素或黄 色素。它们是脂溶的并且通常可易于由有机体模拟。
[0004] 它们属于萜类化合物的化学家族，形成自异戊二烯结构与脂肪族结构或脂环族结 构的聚合反应。普遍公认的是，它们遵循类似于脂类的那些代谢途径的代谢途径。
[0005] 它们是由所有绿色植物合成的，并且是由很多真菌和细菌（包括蓝藻细菌）以及 由所有藻类合成的。它们是由动物在它们的食品中吸收的。
[0006] 类萌萝卜素具有抗氧化剂特性，并且已经对其针对预防癌症以及其他人类疾病进 行了研宄。
[0007] 类萌萝卜素天然存在于可食用的叶子、花和果实中，并且易于获得自花（例如万 寿菊）、浆果类、以及根组织（例如胡萝卜）。
[0008] 类萌萝卜素的代表性实例包括a -胡萝卜素、0 -胡萝卜素和番茄红素。
[0009] e-胡萝卜素和番茄红素一般以游离的非组合形式存在，这种形式被限制在植物 细胞的叶绿体内。
[0010] 胡萝卜醇（Xanthophyll)是通过添加氧原子（醇、酮、环氧等官能团），衍生自胡萝 卜素的黄色分子。
[0011] 在某些黄色或橙色水果和蔬菜中，胡萝卜醇是丰富的，这些水果和蔬菜例如是桃、 芒果、番木瓜、西梅、南瓜和橙子。
[0012] 它们还被发现于植物细胞的叶绿体或有色体中，具体地在某些黄色的、橙色的或 红色的花的花瓣中，以及在藻类中，例如在褐藻（褐藻纲）中，在那里它们掩蔽了叶绿素。
[0013] 胡萝卜醇是尤其有助于眼睛健康的抗氧化剂。
[0014] 胡萝卜醇的实例包括叶黄素（lutein)、虾青素、角黄素、玉米黄素、隐黄素、等。
[0015] 一些胡萝卜醇存在于植物的花中，例如万寿菊中，一般是处于酸（例如棕榈酸和 豆蔻酸）的二酯的形式。
[0016] 一般而言，游离形式的类萌萝卜素还存在于绿色植物、绿叶和绿色植物质的叶绿 体中，这些绿色植物例如是苜蓿、菠菜或羽衣甘蓝。
[0017] 当它们以食品或作为食品补充剂被消耗时，游离形式的类萌萝卜素具有更好的吸 收。
[0018] 叶黄素是在眼睛的黄斑中以及在视网膜的中心部分以高浓度被发现的具 有式4-[18_(4-羟基-2, 6, 6-三甲基环己-1-烯-1-基）-3, 7, 12, 16-四甲基十八 碳-1，3, 5, 7, 9, 11，13, 15, 17-壬烯-1-基]-3, 5, 5-三甲基环己-2-烯-1-醇的胡萝卜醇 色素。
[0019] 在过滤掉紫外光波长以防止对眼球晶状体以及对黄斑的损伤中，它在其中起到重 要作用。
[0020] 此外，叶黄素具有抗氧化剂特性，这使之有可能保护富含多不饱和脂肪酸的黄斑， 对抗光诱导的自由基。
[0021] 身体不能产生叶黄素，因此，必须通过膳食摄取。
[0022] 因此，叶黄素已经变得日益用于营养补充剂，以便预防和/或治疗与年龄相关的 黄斑变性（或ARMD)、白内障、以及色素性视网膜炎引起的失明。
[0023] 叶黄素提取物的最常见来源精确地说是金盏花，它包含已知最高水平之一的叶黄 素，并且具有仅包含低浓度的其他类萌萝卜素的优点。
[0024] 通过用溶剂提取，从菊科的法国万寿菊（万寿菊）的花中常规地获得处于晶态形 式的叶黄素，以产生一种油树脂（包含70%的叶黄素）。
[0025] 然后通过进行其他系列的提取，用溶剂（己烷、戊烷、二氯甲烷、乙醇、甲醇）或使 用1，2-丙二醇和盐酸钾，纯化该油树脂。
[0026] 这种两步模式的提取是例如描述在国际专利申请W02012/064186中。
[0027] 这两种方法产生一种最终产物，该最终产物已经除去了 99 %至99. 9 %的有机提 取溶剂。
[0028] 在销售前，晶态叶黄素可以掺入玉米油的悬液中。
[0029] 例如在文献中，专利US 4 048 203、US 5 382 714和US 5 648 564传授了用于纯 化来自万寿菊花瓣的、处于脂肪酸酯形式的叶黄素的方法，其中用烃基溶剂处理干万寿菊 花瓣。
[0030] 相对于从绿色植物提取叶黄素，它可能是有利的，因为它并不需要皂化并且然后 裂解以释放处于游离形式的叶黄素的额外步骤，当它被消耗时，所述形式有望用于更好的 吸收。
[0031] 然而，从植物提取和纯化叶黄素、还有胡萝卜素、以及脂肪酸不是非常经济的，因 为它需要很多昂贵的纯化步骤和大量时间从而从存在于植物材料中的大量其他化合物中 分尚它们。
[0032] 此外，万寿菊花的叶黄素含量仍然很低（0. 3mg/g的干物质）。
[0033] 因此，在使用微藻作为这种类胡萝卜素的替代来源方面，存在与日俱增的兴趣。
[0034] 例如，已经提出缪里尔藻属（Muriellopsis)的微藻，若夫小球藻（Chlorella zofingiensis)，阿尔默瑞栅藻（Scenedesmus almeriensis)和原始小球藻型作为叶黄素的 潜在来源。
[0035] 尽管如此，描述的叶黄素生产力仍不够高，不足以在工业规模上经济地实行。
[0036] 已经描述了多个程序，例如国际申请W0 89/006910的程序，用以从培养的藻类细 胞中获得叶黄素或富含叶黄素的组合物。
[0037] 在专利EP 1 808 483中，更具体地，使用的方法由以下组成：在真空下离心、沉淀 或过滤，以便浓缩细胞，并且干燥浓缩的细胞。
[0038] 然后优选地将干燥的细胞生物质在真空下的包装中或优选地通过将氮气引入塑 料袋中以除去氧气而储存在低温下（例如_20°C或甚至更低）。
[0039] 专利EP 1 808 483还推荐将抗氧化剂和乳化剂添加至收获的细胞悬液中。
[0040] 除了回收富含叶黄素的生物质，专利EP 1 808 483描述了使叶黄素具有更好的 生物利用率的可能性。优选的方法进而包括使收集的细胞破裂，并且干燥它们，以便获得叶 黄素或富含叶黄素的组合物。
[0041] 推荐使用标准珠磨机，在珠磨机中在适当的抗氧化剂（以便防止叶黄素氧化）的 存在下，生物质的悬液崩解在水中的悬液中。
[0042] 干燥后，获得了"小型的颗粒"型的粉状产物。由此获得的粉末可以进而直接用于 旨在用于人类消费的食品应用中，例如食品补充剂，或用作与其他成分的混合物，例如水产 养殖中的鱼粉。
[0043] 在另一方法中，叶黄素可以借助用于用非极性溶剂进行提取的方法来浓缩，以便 将其配制在食品补充剂或药用产品中。
[0044] 尤其已经在植物领域描述了用非极性溶剂或用超临界流体提取叶黄素。
[0045] 因此，在专利US 6 106 720中，例如描述了用于从藻类、从胡萝卜汁、或从番茄皮 提取类胡萝卜素的方法，所述方法包括在特别高的压力和温度条件下（450至1200巴并且 50°C至300°C )，在一个柱中，用水预饱和超临界二氧化碳流。
[0046] 在专利US 4 632 837中，描述了用于从食用香草（例如莳萝、龙蒿叶和含羞草花） 的新鲜植物产生浓缩的提取物的方法，所述方法包括在0至40°C的温度下并且在80-200巴 的压力下，用超临界〇) 2进行提取，并且在20至60巴的压力并且0至20°C的温度下，用乙 醚或戊烷分离提取物。
[0047] 专利US 4 466 923描述了通过同时应用从60°C至80°C的温度和从700至1200 巴的压力，从豆科植物种子、从谷物胚芽以及从动物的肉，进行脂类的超临界co 2提取。
[0048] 专利US 5 120 558就其本身而言描述了用于从香料（例如鼠尾草、香子兰、胡椒、 芹菜、姜或肉桂）进行提取的方法，采用了超临界〇)2的所述方法是在400和600巴之间并 且80°C至120°C的温度下，连续用四个提取池进行，并且从香料进行分级分离，从而获得油 树脂。
[0049] 因此，所有这些方法尤其已经被用于高等植物，并且它们中没有一个提示可能将 此类方法外推以用于一般而言从微藻、并且特别是从小球藻提取叶黄素。
[0050] 此外，清晰可见的是，据此这些方法受制于该缺陷，有必要通过实施高的压力和温 度操作条件、或通过将其与另一种非极性有机溶剂进行组合来改进超临界流体的溶解能 力。
[0051] 因此，本发明的根本问题是提供用于获得富含由微藻产生的叶黄素的组合物的替 代方法。
[0052] 发明概述
[0053] 本发明的主题是用于制备富含由微藻更具体地由小球藻科的微藻产生的、甚至更 具体地由普通小球藻产生的叶黄素的组合物的方法，其特征在于该方法包括：
[0054] 1)从微藻生物质制备细胞裂解物，