专利名称：微生物中可诱导型基因的检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过诱导mRNA表达并检测诱导的mRNA，来检测微生物，特别是分枝杆菌属(Mycobacterium)生长缓慢的细菌存在的方法。
背景技术：
尽管存在有效的抗菌疗法，结核病仍然是世界上致病和致死的主要根源，并越来越遍及全世界。结核性脑膜炎的早期诊断和治疗的迅速启动改善了这种疾病的后果，但是通过常规方法检测脑脊髓液(CSF)中的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)始终是一个挑战。诊断分枝杆菌的挑战在于结核分枝杆菌生物体数量少并且生长缓慢，从而限制了采用耐酸染色和培养技术检测(Molavi A和J.L.Lefrock.，Med.Clin.North.Am.69315-331.1985)。
几个研究小组已描述了用于灵敏并特异性检测临床样本中结核分枝杆菌的PCR分析。通过PCR扩增特异性靶核酸序列直接鉴定临床样本中的分枝杆菌具有在感染的同一天诊断的能力。已将PCR技术应用于实际临床样本，但是受可检测样本量小、临床样本中存在的生物体量低、由于污染导致假阳性和存在PCR抑制剂等方面限制(Kox等，J.Clin Micro32672-678，1994)。
检测的预测值极大地依赖于研究的临床样品中阳性结核分枝杆菌样本的发生率。Grosset和Mouton建议在PCR技术充分可靠并且存在内部和外部质量控制程序前，不应将PCR用于结核病的日常诊断(Grosset J.和Y Mouton.，Tubercle Lung dis 76183-184，1995)。在一次国际合作质量控制研究中，30个实验室中只有5个实验室正确地鉴定出所有20个样本中存在或不存在分枝杆菌DNA(Noordhoek G.T.J.Clin.Microbiology 342522-2525.1996)。该研究还显示缺乏特异性是比缺乏灵敏性更主要的问题。目前，基于扩增的检测技术还没有替代常规诊断技术(Piersimoni等，363601-3604，1998，J.Clin Microbioogy；另参见Piersimoni等，35193-196，1997，J.Clin Microbioogy)。
副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratubreculosis)是一种慢性肠道病原菌，其可感染包括灵长类的许多不同的动物种类(Chiodini等，Comell Vet.74218-262，1984)。在100年前该生物体作为德国牛的肠道慢性炎症的病因首次鉴定出来。动物中约内氏病或副结核病的分类特征是感染的肠道中存在数百万杆菌型耐酸分枝杆菌及巨噬细胞而很少有另外的炎性细胞浸润。副结核分枝杆菌很难以来自这些动物的杆菌形式培养。动物中的多杆菌-少微生物型的副结核病的临床病理学谱令人想起人类中以瘤型麻风和结核样麻风为代表的极其严重的情况。近年来由于实验室中通过常规培养来鉴定这种物质不时遇到极大困难，所以极大地延缓了我们对结核分枝杆菌及由它引起的疾病的理解进程(Chiodini等，Clin.Microbiol.Rev.290-117，1989)。在英国尤其在高峰期，零售消毒牛奶中存在残留的结核分枝杆菌是非常危险的。
因此，仍然需要检测分枝杆菌属，特别是检测结核分枝杆菌的灵敏、特异的方法。
发明内容
根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种检测待测样本中微生物存在的方法，该方法包括将待测样本暴露于能诱导所述微生物中至少一个基因表达的诱导物下并检测从暴露于所述诱导物而被诱导的基因转录的mRNA的存在。
在一个优选实施方式中，所述微生物可以为生长缓慢的细菌。优选生长缓慢的细菌包括，例如，疏螺旋体属(Borreliae)、片球菌属(Pediococcus)、支原体属(Mycoplasma)、和分枝杆菌属的株系。
最优选本方法用于检测分枝杆菌属，特别是结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌(如鸟分枝杆菌副结核亚种(M.avium subsp.paratuberculosis))和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)。
怀疑含有微生物的“待测样本”通常主要是取自用于检测所述微生物存在的个体的临床样本。
检测特异性mRNA序列存在优选对从待测样本中分离的核酸制备物进行检测。该核酸制备物必须包含mRNA，然而，根据用于检测特异性mRNA存在的技术的特征，该核酸制备物没有必要是纯化的聚腺苷酸化mRNA制备物，并且，整个RNA制备物甚至同时含有RNA和基因组DNA的整个核酸制备物也适于作为起始原料。实质上，本领域已知的用于分离包含mRNA的核酸制备物的任何技术可以用于从待测样本分离核酸。优选的技术为US-A-5,234,809和EP-B-0389,063中描述的“Boom”分离方法。该方法可以用于分离同时含有RNA和DNA的核酸制备物，其基于在离液剂硫氰酸胍(GuSCN)存在下，二氧化硅颗粒的核酸结合特性。
在一个优选实施方式中，检测从暴露于诱导物而被诱导的基因转录的mRNA存在的步骤包括进行扩增反应以扩增全长或部分mRNA并检测扩增反应的特异性产物。更优选地，扩增反应为反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)或依赖核酸序列的扩增(NASBA)。
本领域熟知将RT-PCR用于检测特异性mRNA序列。可以在标准课本中找到进行RT-PCR并检测RT-PCR反应的特异性产物的方法，例如PCR方案方法和应用指南(PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications)，Eds Innis等，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥，加利福尼亚，1990；生物分析中的PCR分子生物学方法(PCR inBioanalysisMethods in Molecular Biology)，卷92，S.J.Smeltzer编辑，Humana出版社，Totowa，NJ.，1998)。NASBA是扩增RNA的相对新的方法(参见Compton，自然(Nature)，35091-92(1991))。NASBA是本领域普通技术人员熟知的，并且描述于，例如US-A-5,409,818中。NASBA是体外大量产生靶RNA序列的有效方法，其可以检测原待测样本中存在的浓度非常低的靶RNA序列。
NASBA方法是基于使用与PCR的引物组合类似的引物组合，但一个引物用启动子序列，如T7启动子修饰。已显示NASBA扩增的灵敏性和特异性与PCR相同并且比多数RT-PCR方案更好。由于NASBA方法是一种等温分析且依赖RNA酶H，所以它不能用于扩增DNA。
NASBA优选按照如下步骤进行(a)组装反应混合物，该混合物包含适用于通过NASBA扩增靶微生物mRNA一段区域的NASBA P1和NASBA P2引物对(见下)、RNA指导的DNA聚合酶、水解RNA-DNA杂合体的RNA链而不水解单链或双链RNA或DNA的核糖核酸酶、识别NASBA P1引物中存在的启动子序列的RNA聚合酶以及核糖核苷三磷酸和脱氧核糖核苷三磷酸；(b)在允许NASBA扩增反应的反应条件下将反应介质与从怀疑含有微生物的待测样本中分离的核酸制备物一起温育；并且(c)检测和/或定量测定NASBA扩增反应的任何微生物特异性产物。
可采用许多不同的方法检测NASBA反应的特异性产物(即，靶RNA的正义和/或反义拷贝)。在一个方法中，可使用能特异性退火于NASBA产物的靶特异性杂交探针来检测NASBA产物。所述杂交探针可结合于显色标记，例如荧光、发光、放射性或化学发光化合物或酶标记或本领域普通技术人员已知的其它类型的标记。这些标记的精确特性并不是特别关键，但是它应该能够通过其本身或与一种或多种额外物质结合(如酶的底物)，产生外源方法可检测的信号。
所谓的“实时NASBA”也在本发明的范围内，该方法可以在反应的过程中，持续监测NASBA反应产物的形成。如WO95/13399所述，这可通过采用“分子标灯”探针完成，所述的分子标灯探针包含能够退火于NASBA产物的靶特异性序列、形成发夹的寡核苷酸序列和一对荧光剂/淬灭剂。以下将更详细地描述分子标灯技术。如果在扩增之前将分子标灯探针加入反应混合物中，其可以实时监测NASBA产物的形成(参见Leone等，核酸研究(Nucleic Acids Research)，1998，卷26，2150-2155)。
在进一步的方法中，如下所述，分子标灯技术可与一个NASBA扩增中使用的寡核苷酸引物结合，以利于实时监测NASBA反应而不需要单独的杂交探针。
在更进一步的方法中，可以采用一种通用的已标记检测探针监测NASBA反应产物，该探针可与引物2的5’端的核苷酸序列杂交。这与Organon Teknika提供的“NucliSensTM”检测系统等同。在该系统中，可采用靶特异性捕获探针获得针对靶mRNA的NASBA产物的特异性，所述的靶特异性捕获探针包含如本文所述与固体支撑物例如磁性微珠结合的探针寡核苷酸。最优选地，通用的带有标记的检测探针是由OrganonTeknika提供的ECLTM检测探针。NASBA复制子与HPV-特异性捕获探针和通用的ECL探针杂交(通过引物2的互补序列)。杂交后，微珠/复制子/ECL探针复合体可被捕获在自动ECL读数器的磁电极上(如Organon Teknika提供的NucliSensTM读数器)。随后，电压脉冲引发ECLTM反应。
“被诱导的基因或多个基因”可以是能被外界刺激如化学试剂或环境变化诱导的任何基因。一个或多个基因表达的诱导及随后特异性检测至少一个诱导基因的转录本增加了扩增的水平，因此与依赖mRNA表达而没有诱导步骤的检测方法相比提高了灵敏性。
实质上，“诱导物”可以是任何能诱导靶微生物种类中一个或多个基因表达的物质。诱导物可以是化学物质或环境刺激，如，暴露于特定波长的光下。
将需要检测微生物存在的待测样本暴露于诱导物一段时间以足以诱导产生期望的基因表达。所需要的精确暴露时间将根据诱导物和被诱导的靶基因的特性而变化。对于任何给定的诱导物/基因组合可通过例行试验依照经验决定。在暴露于诱导物之后，可如上所述，从待测样本中分离核酸。
在一个实施方式中，本发明提供一种检测微生物的方法，该方法基于将待测样本暴露于氧或过氧化氢来诱导编码过氧化物歧化酶的基因的表达，然后检测与该基因对应的mRNA转录本的存在。该方法优选用于检测分枝杆菌属，更有利于结核分枝杆菌或副结核分枝杆菌，但也适用于检测任何具有过氧化物歧化酶基因的微生物，其中由于暴露于氧或过氧化氢而诱导该基因的表达。在结核分枝杆菌中将编码过氧化物歧化酶的基因表示为sodA(GenBank登记号AF061030；SEQ ID NO57和58)。在鸟分枝杆菌副结核亚种中，将编码过氧化物歧化酶的基因表示为sod(GenBank登记号AF180816；SEQ ID NO59和60)。其它种类微生物的SodA/sod同系物也可用本领域技术人员熟知的方法鉴定，例如通过检索可公开获得的序列数据库和/或通过直接筛选基因组DNA。
检测与过氧化物歧化酶基因对应的mRNA转录本存在的步骤可通过采用RT-PCR或NASBA扩增全长或部分mRNA并检测过氧化物歧化酶特异性扩增产物来完成。
下面给出了用RT-PCR或NASBA扩增SodA mRNA的适合的引物组合。这些引物组合可用于检测所有分枝杆菌属的种，但特别适用于检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。
用于NASBA检测的引物组合包含SEQ ID NO20的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO19的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO26的NASBA P1引物和包含SEQID NO25的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO32的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO31的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO38的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO37的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO61的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO62的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO64的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO65的NASBA P2引物；NASBA P1引物4-86和包含SEQ ID NO61的NASBA P2引物，优选引物4-85；引物4-92和包含SEQ ID NO64的NASBA P2引物，优选引物4-91；引物4-104和包含SEQ ID NO19的NASBA P2引物，优选引物4-103；引物4-122和包含SEQ ID NO31的NASBA P2引物，优选引物4-115；用于RT-PCR检测的引物组合包含SEQ ID NO20的PCR引物和包含SEQ ID NO19的PCR引物；包含SEQ ID NO26的PCR引物和包含SEQ ID NO25的PCR引物；包含SEQ ID NO32的PCR引物和包含SEQ ID NO31的PCR引物；包含SEQ ID NO38的PCR引物和包含SEQ ID NO37的PCR引物；包含SEQ ID NO61的PCR引物和包含SEQ ID NO62的PCR引物；或包含SEQ ID NO64的PCR引物和包含SEQ ID NO65的PCR引物。
在每种情况下，“SEQ ID NOs”指表1中列出的序列，“引物号”指表2列出的引物。
如下所述，本发明还提供使用这些特异性引物组合，适用于进行检测NASBA和RT-PCR反应的产物的探针寡核苷酸。
在进一步的实施方式中，本发明提供一种检测微生物的方法，该方法基于将待测样本暴露于化学诱导物而诱导pncA基因的表达，所述化学诱导物可以是异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷或吡嗪酰胺，然后检测与pncA基因对应的mRNA转录本的存在。本方法也优选用于检测分枝杆菌属。结核分枝杆菌pncA的完整cDNA序列可在GenBank登记号U59967获得(也可参见SEQ ID NO98和99)。其它种类微生物的pncA同系物也可采用本领域技术人员熟知的方法鉴定。
再次，检测与pncA基因对应的mRNA转录本存在的步骤可通过采用RT-PCR或NASBA扩增全长或部分mRNA并检测pncA-特异性扩增产物来完成。
下面给出了特异性用于通过RT-PCR或NASBA扩增结核分枝杆菌pncA mRNA的适合的引物组合。
用于NASBA检测的引物组合包含SEQ ID NO2的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO1的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO8的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO7的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO14的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO13的NASBA P2引物；引物4-2和包含SEQ ID NO1的NASBA P2引物，优选引物4-1；引物4-8和包含SEQ ID NO7的NASBA P2引物，优选引物4-7；或引物4-14和包含SEQ ID NO13的NASBA P2引物，优选引物4-15。
用于RT-PCR检测的引物组合包含SEQ ID NO2的PCR引物和包含SEQ ID NO1的PCR引物；包含SEQ ID NO8的PCR引物和包含SEQ ID NO7的PCR引物；或包含SEQ ID NO14的PCR引物和包含SEQ ID NO13的PCR引物。
本发明进一步提供了通过RT-PCR或NASBA检测分枝杆菌属，特别是检测分枝杆菌属的靶特异性引物和寡核苷酸探针。
特别地，本发明提供了引物和探针寡核苷酸，其包含表1中如SEQ IDNO1到42，61到69和74到97所示的序列。
表1-引物和探针中包含的分枝杆菌特异性序列
关键词X1代表包含启动子的核苷酸序列。适于用作NASBA P1引物的寡核苷酸具有通用的结构“X1-序列(X1-SEQ)”，其中“X1”代表包含启动子的核苷酸序列，“序列(SEQ)”代表所附序列表中指定的靶特异性序列(SEQ ID NO)。如下所述，NASBA P1引物中必须包含启动子序列但PCR引物中并不是必须的。在一个优选实施方式中，X1可以是包含T7启动子的序列，最优选序列AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAGAAGG。
X2和X3代表荧光剂和淬灭剂，当将这两部分保持在近距离时，该淬灭剂能基本上或完全地淬灭来自荧光剂的荧光。
nt-表示在相关cDNA序列上的位置。
本发明进一步提供表2列出的寡核苷酸，这些为加入特定启动子序列的NASBA P1引物和加入结合通用检测探针的序列的NASBA P2引物(见下)，用于采用NASBA检测分枝杆菌属的种系。然而，并不意味着本发明的范围应该限制于这些特异性分子。
表2
本发明提供的寡核苷酸引物和探针可归纳为几个类型。第一种寡核苷酸类型是NASBA P1引物，其一般为大约50个碱基长的寡核苷酸，在3’端含有与靶mRNA一段区域互补的平均大约20个碱基。表1中的“NASBA P1/PCR”表示适合用作NASBA P1引物的寡核苷酸。P1引物寡核苷酸的5’端(在此通常用术语X1代表)包含可被特异性RNA聚合酶识别的启动子序列。因为噬菌体启动子，例如T7、T3和SP6启动子，仅依赖适当的RNA聚合酶的结合即可提供高水平的转录，优选将它们用于本发明的寡核苷酸中。在一个优选实施方式中，P1引物寡核苷酸的5’端序列可包含序列AATTCTAATACGACTCACTATAGGG。该序列包含一个T7启动子，T7启动子包含T7 RNA聚合酶的转录起始位点。在表1中以“NASBA P1/PCR”表示的分枝杆菌特异性序列适合在NASBA P1引物和标准PCR引物中使用。当使用这些序列作为NASBA P1引物的基础时，它们具有通用的结构“X1-SEQ”，其中“X1”代表包含启动子的序列，SEQ代表靶特异性序列。启动子序列X1在NASBA P1引物中是必须的。然而，当使用同样的序列作为标准PCR引物的基础时，并不是必须包含X1。相应地，权利要求中使用的短语“序列号”也这样理解。
为避免疑惑，短语“包含SEQ ID NO1的NASBA P1引物”理解为在SEQ ID NO1列出的分枝杆菌特异性序列的5’端要求存在X1序列，而短语“包含SEQ ID NO1的PCR引物”表示包含分枝杆菌特异性序列的任何合适的PCR引物，X1并不是PCR引物的本质特征。
本发明提供的第二种寡核苷酸类型是NASBA引物2寡核苷酸，其一般包含与靶mRNA一段区域基本上相同的大约20个碱基的序列。在表1中以“NASBA P2/PCR”表示的寡核苷酸序列适合在NASBA P2引物和标准PCR引物中使用。在特殊的但非限定的实施方式中，欲用作NASBA P2引物的寡核苷酸，在5’端进一步包含一段核苷酸序列，该核苷酸序列与靶mRNA无关但能够与一个通用的检测探针杂交。优选用荧光、发光或酶标记物标记该检测探针。在一个实施方式中，可用ECLTM技术检测的标记物标记检测探针，但是应意识到本发明决不是限定于这个特定的检测方法。在一个优选实施方式中，引物2寡核苷酸的5’端可含有序列GATGCAAGGTCGCATATGAG。该序列能够与从OrganonTeknika商购的通用ECLTM探针杂交，该探针具有下列结构Ru(bpy)32+-GAT GCA AGG TCG CAT ATG AG-3’在另一个实施方式中，为了实时监测NASBA反应，可将引物2寡核苷酸与“分子标灯”技术结合，“分子标灯”技术是本领域已知的并由Tyagi和Kramer描述于如WO 95/13399，Nature Biotechnology，14303-308，1996中。
本发明提供的第三种寡核苷酸类型是靶特异性探针寡核苷酸(在表1表示为“探针”)。该探针寡核苷酸一般包含与靶mRNA一段区域基本上相同的大约20-25个碱基的序列。该探针寡核苷酸可作为靶特异性杂交探针用于检测NASBA或PCR反应的产物。就此而论，可将探针寡核苷酸与一个固体支撑物如顺磁珠结合以形成捕获探针(见下)。在一个优选实施方式中探针寡核苷酸的5’端可用生物素标记。生物素标记物的加入可促进探针通过生物素/链霉抗生物素或生物素/抗生物素蛋白的联接结合于固体支撑物上。
本发明提供的第四种寡核苷酸类型(在表1表示为“MB探针”)是结合“分子标灯”技术的靶特异性探针，该技术是本领域已知的并由Tyagi和Kramer描述于如Nature Biotechnology，14303-308，1996和WO95/13399中。采用分子标灯技术可对扩增反应如NASBA或RT-PCR反应进行实时监测。
除靶特异性序列以外，分子标灯探针一般还包含可形成发夹环结构的其它碱基、荧光剂和淬灭剂，其中在本文中荧光剂和淬灭剂用符号X2和X3表示。熟知技术的读者将意识到，选择荧光剂和淬灭剂以使当将这两部分保持在近距离时，例如不存在靶序列时，探针处于发夹“关闭”构象时，淬灭剂能基本上或完全地淬灭来自荧光剂的荧光。表1中显示的分子标灯探针在5’和3’末端加入互补的侧翼序列，该侧翼序列在分枝杆菌特异性序列的侧翼并能够杂交以形成茎双链体。除了要求该侧翼序列在探针不结合靶HPV序列时能形成茎双链体外，其具体的核苷酸序列并不是本发明的实质。因此，熟知技术的读者将意识到在不影响实质范畴内分子标灯探针的功能下，这些序列可以变化。可使用表1中表示为“探针”的任何序列加入合适的互补侧翼序列和荧光剂及淬灭剂作为分子标灯探针的基础。
本领域已知许多适合用于分子标灯探针的淬灭剂/荧光剂组合的例子(参见WO 95/13399，Tyagi和Kramer，ibid)。可使用许多不同颜色的荧光团，包括如5-(2’-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、荧光素、FAM和得克萨斯红(参见Tyagi、Bratu和Kramer，1998，Nature Biotechnology，16，49-53)。使用不同颜色荧光团标记的探针可进行“多重”检测，在单个反应管中检测两个或多个不同的探针。一个优选的淬光剂是苯甲酸4-(4’-二甲基氨苯氮基)苯甲酸(DABCYL)，其为非荧光发色团，用作大范围荧光团的“万用”淬光剂。荧光剂和淬光剂可以采用某种方向共价地结合到探针上，荧光剂在5’端或接近5’端、淬光剂在3’端或接近3’端或者反之亦然。本领域已知用于合成分子标灯探针的方法。Sanjay Tyagi等，(分子遗传学系(Department of Molecular Genetics)，公共健康研究所(Public Health Research Institute)，455第一大街，纽约，NY 10016，美国)在一篇名为“分子标灯用于检测均质溶液中核酸的杂交探针”的文章中提供了合成的具体方法，可通过PHRI网站在线获得(www.phri.nyu.edu或www.molecularbeacons.org)。
可使用适当的引物1和引物2寡核苷酸分子的组合通过NASBA检测靶mRNA。为了驱动NASBA扩增反应，引物1和引物2寡核苷酸必须能从mRNA的靶区域启动双链DNA的合成。为此，引物1和引物2寡核苷酸必须包含分别能与靶mRNA正义和反义链区域互补的靶特异性序列。
在NASBA扩增循环的第一个时期，所谓的“非循环”期，引物1寡核苷酸退火于靶mRNA的互补序列并且它的3’端在依赖RNA的DNA聚合酶(例如反转录酶)作用下延伸以合成第一链cDNA。随后将得到的RNA:DNA杂合体的RNA链消化，如通过RNA酶H的作用，以释放单链DNA。引物2寡核苷酸退火于该单链DNA 3’端的互补序列并且延伸它的3’端(通过反转录酶的作用)，形成双链DNA。然后RNA聚合酶能从该双链DNA中现在具有转录活性的启动子序列转录大量的RNA拷贝。该RNA转录本，与原始靶mRNA反义，能作为NASBA反应进一步循环的模板，引物2可退火于此RNA并启动第一条cDNA链的合成，并且引物1启动第二条cDNA链的合成。本领域熟知NASBA反应的一般原理(参见Compton，J.Nature，35091-92)。
本文所述的靶特异性探针寡核苷酸也可与固体支撑物如磁性微珠结合并用作“捕获探针”来固定NASBA扩增反应的产物(单链RNA)。本文所述的靶特异性“分子标灯”探针可用于实时监测NASBA反应。
参照下列实施例和附图将进一步理解本发明，其中图1阐明利用分子标灯探针的实时NASBA扩增反应，扩增结核分枝杆菌和牛分枝杆菌sodA mRNA的时间进程。X-轴荧光(相对单位)，y-轴时间(秒)。
具体实施例方式
实施例1细菌基因表达的诱导1)用氧处理将含有生长缓慢的分枝杆菌的样本接种到液体培养基中。将细菌暴露于氧气(起泡)10分钟和60分钟。
样本由于收集的细菌数量不定，在转移到裂解缓冲液中之前把样本在培养用的液体培养基中稀释。稀释度1∶1和1∶100。
2)接种于生长培养基中将细菌样本置于最适所检测的细菌生长的培养基中37℃过夜。即使细菌没有繁殖到相当多的程度，但对用于启动NASBA扩增反应的基因的诱导是足够的。
细菌的裂解·在2-8℃贮存裂解缓冲液(0.9ml，低pH值)。使用之前，必须将缓冲液加热到37℃，并保持30分钟以便溶解所有的结晶。
·将100ml细菌培养物加到0.9ml缓冲液中，混合均匀。
·将带有细菌的裂解缓冲液在37℃温育10分钟。
·将裂解的细菌于-70℃贮存或立刻提取核酸。
3)从诱导的细菌样本中提取DNA/RNA下面的步骤根据NuclisensTM，Organon Teknika的手册进行操作·在每个样品中加入50μl硅颗粒并在室温下温育10分钟。每2分钟混合试管。
·将样品中的所有物质转移到NuclisensTM提取仪中使用的柱子中。
·遵循手册中的方法“1ml原生质的提取”。
检测分枝杆菌属的种中过氧化物歧化酶的引物的试验将2×试剂球2×80μl稀释液混合均匀，然后加入28μl依赖核酸序列的扩增用水(NASBA water)32μl氯化钾(所有试剂来自于Organon Teknika提供的NuclisensTM系统)分到8个管中，每管27.5μl。以下列方式加入引物。(引物号与表2列出的引物对应)管号 引物1 1.25μl 4-85(SEQ ID NO70)1.25μl 4-86(SEQ ID NO71)2 1.25μl 4-85(SEQ IDNO70)1.25μl 4-98(SEQ ID NO73)3 1.25μl 4-97(SEQ ID NO72)1.25μl 4-86(SEQ ID NO71)4 1.25μl 4-97(SEQ ID NO72)1.25μl 4-98(SEQ ID NO73)5 1.25μl 4-115(SEQ ID NO53)1.25μl 4-116(SEQ ID NO54)6 1.25μl 4-115(SEQ ID NO53)1.25μl 4-122(SEQ IDNO56)7 1.25μl 4-121(SEQ ID NO55)1.25μl 4-116(SEQ IDNO54)8 1.25μl 4-121(SEQ ID NO55)1.25μl 4-122(SEQ IDNO56)样本结核分枝杆菌和牛分枝杆菌在41℃进行扩增2.5小时。在Agilent生物分析仪上检测产物。
结果如所预料的那样，引物检测到了来自结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的序列。
实施例3从病人样本中扩增结核分枝杆菌样本1)培养物中生长的ATTC菌株(对照)2)病样预混合反应液2试剂球2×80μl试剂球稀释液在一管中混合，加入23μl依赖核酸序列的扩增用水(nasbawater)10μl引物1(4-122；SEQ ID NO56)10μl引物2(4-115；SEQ ID NO53)5μl分子标灯(4-125；SEQ ID NO41)32μl氯化钾样本电泳
结果，信号增加
实施例4用结核分枝杆菌的分子标灯进行NASBA扩增将2×试剂球2×80μl稀释液1)加入
11.5μl水5μl引物4-115(SEQ ID NO53)5μl引物4-122(SEQ ID NO56)16μl氯化钾2)也加入11.5μl水5μl引物4-121(SEQ ID NO55)5μl引物4-116(SEQ ID NO54)16μl氯化钾将这两种引物混合物分为4管(共8管)，每管29.5μl。
加入分子标灯每管0.63μl1a)4-118(SEQ ID NO34)1b)4-119(SEQ ID NO35)1c)4-124(SEQ ID NO40)1d)4-125(SEQ ID NO41)2a)4-118(SEQ ID NO34)2b)4-119(SEQ ID NO35)2c)4-124(SEQ ID NO40)2d)4-125(SEQ ID NO41)将2×酶在2×55μl稀释液中稀释试剂来自NucliSens，Organon Teknika样本样本2和24是结核分枝杆菌样本7是牛分枝杆菌
在41℃扩增并在读数器检测2.5个时间段。结果，信号数倍地增大。认为增加1.5是阳性。
在所有样本中均检测到扩增-最好的检测结果是预混合反应液1d。
采用下列引物和分子标灯的组合检测到最佳结果引物24-115(SEQ ID NO53)引物14-122(SEQ ID NO56)分子标灯4-125(SEQ ID NO41)见图1中扩增的图解形式。
实施例5 结核分枝杆菌sodA引物的特异性样本
预混合反应液2试剂球 2酶球2×80μl试剂球稀释液 2×55μl酶稀释液在一管中混合，然后加入23μl依赖核酸序列的扩增用水10μl引物1(4-122；SEQ ID NO56)10μl引物2(4-115；SEQ ID NO53)5μl分子标灯(4-125；SEQ ID NO41)32μl氯化钾样本电泳
结果信号增大倍数(阳性信号1.5以上)
结论引物是结核分枝杆菌或牛分枝杆菌特异性的，不与其它分枝杆菌或相关细菌如藤黄微球菌反应。
序列表SEQ ID NO57结核分枝杆菌sodA的核苷酸序列SEQ ID NO58结核分枝杆菌sodA的氨基酸序列SEQ ID NO59鸟分枝杆菌副结核亚种sod的核苷酸序列SEQ ID NO60鸟分枝杆菌副结核亚种sod的氨基酸序列SEQ ID NO98结核分枝杆菌pncA的核苷酸序列SEQ ID NO99结核分枝杆菌pncA的氨基酸序列序列表<110>挪其普公司<120>微生物中可诱导型基因的检测<130>P03GB102363<160>99<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1gaagcggcgg actaccatca 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2ctcgattgcc gacgtgtcca20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>3cattgcgtca gcggtactcc20
<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子标灯探针<400>4cccgatcatt gcgtcagcgg tactccatcg gg 32<210>5<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子标灯探针<400>5gcccgatcat tgcgtcagcg gtactccatc gggc 34<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子标灯探针<400>6ccgccgcatt gcgtcagcgg tactcccggc gg 32<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7accaaggact tccacatcga 20
<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8taccgaccac atcgacctca 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>9attgcgtcag cggtactccc 20<210>10<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子标灯探针<400>10cgtcgtattg cgtcagcggt actcccacga cg32<210>11<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子标灯探针<400>11cgtcggattg cgtcagcggt actcccccga cg32<210>12
<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子标灯探针<400>12aggcgtattg cgtcagcggt actcccacgc ct 32<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>13gtgaccactt ctccggcaca20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>14gtgtaggcac cct tgtagaa20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>15gactattcct cgtcgtggcc 20<210>16<211>32
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子标灯探针<400>16cgcatggact attcctcgtc gtggcccatg cg 32<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子标灯探针<400>17ccagcgacta ttcctcgtcg tggccgctgg30<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子标灯探针<400>18tcgcggacta ttcctcgtcg tggcccgcga 30<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>19ctgttttggg cgtcgatcca 20<210>20<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>20cagttggcgg ggacggctaa 20<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>21attcccacta ccacgtccgg 20<210>22<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子标灯探针<400>22cgcatgattc ccactaccac gtccggcatg cg 32<210>23<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子标灯探针<400>23cctgcgattc ccactaccac gtccggcgca gg 32<210>24<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>分子标灯探针<400>24gcgctattcc cactaccacg tccggagcgc30<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>25ggcgtcgatc cactgcggga20<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>26ggtgggcaag aagaagtcga20<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>27gcccgctcca gcacctcctt20<210>28<211>32<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>分子标灯探针<400>28cgcatggccc gctccagcac ctccttcatg cg 32<210>29<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子标灯探针<400>29ccgtcggccc gctccagcac ctccttcgac gg 32<210>30<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子标灯探针<400>30cacgcgcccg ctccagcacc tccttgcgtg 30<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>31ctccagcacc tccttggtca 20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>32ccaggctgat accacgtcta 20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>33acttcttctt gcccacccac 20<210>34<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子标灯探针<400>34cgcatgactt cttcttgccc acccaccatg cg 32<210>35<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子标灯探针<400>35ccgtcgactt cttcttgccc acccaccgac gg 32<210>36<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子标灯探针
<400>36cacgcacttc ttcttgccca cccacgcgtg 30<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>37cctccttggt caattcgtta 20<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>38aagtcaaccc tgctccatga 20<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>39ttgcccaccc accccataga 20<210>40<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子标灯探针
<400>40cgcatgttgc ccacccaccc catagacatg cg32<210>41<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子标灯探针<400>41cgctgttgcc cacccacccc atagacagcg 30<210>42<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子标灯探针<400>42cgcatttgcc cacccacccc atagaatgcg 30<210>43<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>43gatgcaaggt cgcatatgag gaagcggcgg actaccatca40<210>44<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>44
aattctaata cgactcacta tagggagaag gctcgattgc cgacgtgtcc a51<210>45<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>45gatgcaaggt cgcatatgag accaaggact tccacatcga 40<210>46<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>46aattctaata cgactcacta tagggagaag gtaccgacca catcgacctc a 51<210>47<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>47gatgcaaggt cgcatatgag gtgaccactt ctccggcaca 40<210>48<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>48aattctaata cgactcacta tagggagaag ggtgtaggca cccttgtaga a 51
<210>49<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>49gatgcaaggt cgcatatgag ctgttttggg cgtcgatcca 40<210>50<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>50aattctaata cgactcacta tagggagaag gcagttggcg gggacggcta a 51<210>51<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>51gatgcaaggt cgcatatgag ggcgtcgatc cactgcggga 40<210>52<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>52aattctaata cgactcacta tagggagaag gggtgggcaa gaagaagtcg a 51
<210>53<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>53gatgcaaggt cgcatatgag ctccagcacc tccttggtca 40<210>54<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>54aattctaata cgactcacta tagggagaag gccaggctga taccacgtct a 51<210>55<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>55gatgcaaggt cgcatatgag cctccttggt caattcgtta 40<210>56<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>56aattctaata cgactcacta tagggagaag gaagtcaacc ctgctccatg a 51
<210>57<211>1321<212>DNA<213>结核分枝杆菌<220>
<221>CDS<222>(542)..(1165)<223>
<400>57gcttagt tggtgagattgcg aaagccgagg gtcgatcccc ggaggtgctc gacgcggccg60ctgatcgctt cggtcggcgg gttgaccgtg gtcactgttt tgggcgtcga tccactgcgg120gaattcccac taccacgtcc ggccggatca ccggcgactc gcggtgcacg gcccgctcca180gcacctcctt ggtcaattcg ttagccgtcc ccgccaactg cccagccgtc gacttcttct240tgcccaccca ccccatagac cttcgccaca cagcgccttc cgtccaccca acagcggtcc300gatgacggac ccccgacggg gacttcagcg accaggaacg cgcccataga cgtggtatca360gcctgggggc gtcctggtag cctatgccgt ccgccctggg gcatcgaccc caaggtcgtt420gttgcgacgc gagcggtcat ggagcagggt tgacttgtca agctagagcc agcccatcgc480gtgggaggca cccgcgcgaa aagaaacatc ggacgatcat ttcatcgaag gaaggaatgc540c gtg gcc gaa tac acc ttg cca gac ctg gac tgg gac tac gga gca ctg589Val Ala Glu Tyr Thr Leu Pro Asp Leu Asp Trp Asp Tyr Gly Ala Leu1 5 10 15gaa ccg cac atc tcg ggt cag atc aac gag ctt cac cac agc aag cac 637Glu Pro His Ile Ser Gly Gln Ile Asn Glu Leu His His Ser Lys His20 25 30cac gcc acc tac gta aag ggc gcc aat gac gcc gtc gcc aaa ctc gaa 685His Ala Thr Tyr Val Lys Gly Ala Asn Asp Ala Val Ala Lys Leu Glu35 40 45gag gcg cgc gcc aag gaa gat cac tca gcg atc ttg ctg aac gaa aag 733Glu Ala Arg Ala Lys Glu Asp His Ser Ala Ile Leu Leu Asn Glu Lys50 55 60aat cta gct ttc aac ctc gcc ggc cac gtc aat cac acc atc tgg tgg 781Asn Leu Ala Phe Asn Leu Ala Gly His Val Asn His Thr Ile Trp Trp65 70 75 80
aag aac ctg tcg cct aac ggt ggt gac aag ccc acc ggc gaa ctc gcc829Lys Asn Leu Ser Pro Asn Gly Gly Asp Lys Pro Thr Gly Glu Leu Ala85 90 95gca gcc atc gcc gac gcg ttc ggt tcg ttc gac aag ttc cgt gcg cag877Ala Ala Ile Ala Asp Ala Phe Gly Ser Phe Asp Lys Phe Arg Ala Gln100 105 110ttc cac gcg gcc gct acc acc gtg cag ggg tcg ggc tgg gcg gca ctg925Phe His Ala Ala Ala Thr Thr Val Gln Gly Ser Gly Trp Ala Ala Leu115 120 125ggc tgg gac aca ctc ggc aac aag ctg ctg ata ttc cag gtt tac gac973Gly Trp Asp Thr Leu Gly Asn Lys Leu Leu Ile Phe Gln Val Tyr Asp130 135 140cac cag acg aac ttc ccg cta ggc att gtt ccg ctg ctg ctg ctc gac1021His Gln Thr Asn Phe Pro Leu Gly Ile Val Pro Leu Leu Leu Leu Asp145 150 155 160atg tgg gaa cac gcc ttc tac ctg cag tac aag aac gtc aaa gtc gac1069Met Trp Glu His Ala Phe Tyr Leu Gln Tyr Lys Asn Val Lys Val Asp165 170 175ttt gcc aag gcg ttt tgg aac gtc gtg aac tgg gcc gat gtg cag tca1117Phe Ala Lys Ala Phe Trp Asn Val Val Asn Trp Ala Asp Val Gln Ser180 185 190cgg tat gcg gcc gcg acc tcg cag acc aag ggg ttg ata ttc ggc tga1165Arg Tyr Ala Ala Ala Thr Ser Gln Thr Lys Gly Leu Ile Phe Gly195 200 205ccccgctgcc gcaagcgtcg ggctcagtat tccggagtcg cgcatcacca tcgcccttat 1225cctggcctta tattgcagct ttgtgaacac ggccgcggtg gccgtgtcga gttgcagggc 1285gcgtaaacca cgcgcatgct tggttactcg agctac1321<210>58<211>207<212>PRT<213>结核分枝杆菌<400>58Val Ala Glu Tyr Thr Leu Pro Asp Leu Asp Trp Asp Tyr Gly Ala Leu1 5 10 15
Glu Pro His Ile Ser Gly Gln Ile Asn Glu Leu His His Ser Lys His20 25 30His Ala Thr Tyr Val Lys Gly Ala Asn Asp Ala Val Ala Lys Leu Glu35 40 45Glu Ala Arg Ala Lys Glu Asp His Ser Ala Ile Leu Leu Asn Glu Lys50 55 60Asn Leu Ala Phe Asn Leu Ala Gly His Val Asn His Thr Ile Trp Trp65 70 75 80Lys Asn Leu Ser Pro Asn Gly Gly Asp Lys Pro Thr Gly Glu Leu Ala85 90 95Ala Ala Ile Ala Asp Ala Phe Gly Ser Phe Asp Lys Phe Arg Ala Gln100 105 110Phe His Ala Ala Ala Thr Thr Val Gln Gly Ser Gly Trp Ala Ala Leu115 120 125Gly Trp Asp Thr Leu Gly Asn Lys Leu Leu Ile Phe Gln Val Tyr Asp130 135 140His Gln Thr Asn Phe Pro Leu Gly Ile Val Pro Leu Leu Leu Leu Asp145 150 155 160Met Trp Glu His Ala Phe Tyr Leu Gln Tyr Lys Asn Val Lys Val Asp165 170 175Phe Ala Lys Ala Phe Trp Asn Val Val Asn Trp Ala Asp Val Gln Ser180 185 190Arg Tyr Ala Ala Ala Thr Ser Gln Thr Lys Gly Leu Ile Phe Gly195 200 205
<210>59<211>900<212>DNA<213>鸟分枝杆菌副结核亚种<220>
<221>CDS<222>(260)..(883)<223>
<400>59tcgcccgcgt ggaaccacag ctacagcgtc gcggcactgc gcgccggatt gatcgcactg60gcgctgctgg cggtattggc cctcatcgtc ttgtcttgaa gtcctgtctt gaaacaccgc120tgagcgggta tccgccttcc ggctcagcgg ggtcgttctt gcggtgcgcg cggtcatgga180gcagggttga taacgcccgg ccgccgcgag gtggcccgcg cgactgagcg tcaagacgac240aatcgaagaa aggaatgcc gtg gct gaa tac acc ctg ccc gac ctg gac tgg 292Val Ala Glu Tyr Thr Leu Pro Asp Leu Asp Trp1 5 10gac tat gca gcg ttg gaa ccg cac atc tcg ggg cag atc aac gag atc 340Asp Tyr Ala Ala Leu Glu Pro His Ile Ser Gly Gln Ile Asn Glu Ile15 20 25cac cac acc aag cac cac gcc acc tac gtc aaa ggc gtg aac gac gct 388His His Thr Lys His His Ala Thr Tyr Val Lys Gly Val Asn Asp Ala30 35 40ctt gcc aag ctc gaa gag gcc cgc gcc aac gag gac cac gct gcg atc 436Leu Ala Lys Leu Glu Glu Ala Arg Ala Asn Glu Asp His Ala Ala Ile45 50 55ttc ctg aac gaa aag aac ctc gcc ttc cac ctg ggc ggc cac gtc aac 484Phe Leu Asn Glu Lys Asn Leu Ala Phe His Leu Gly Gly His Val Asn60 65 70 75cac tcg atc tgg tgg aag aac ctg tcg ccg gac ggc ggt gac aag ccc 532His Ser Ile Trp Trp Lys Asn Leu Ser Pro Asp Gly Gly Asp Lys Pro80 85 90acc ggc gag ctg gcc gcc gcg atc gac gac gcg ttc ggc tcc ttc gac 580Thr Gly Glu Leu Ala Ala Ala Ile Asp Asp Ala Phe Gly Ser Phe Asp95 100 105aag ttc cgg gcg caa ttc agc gcc gcc gcc aac ggc ctg cag ggc tcc 628Lys Phe Arg Ala Gln Phe Ser Ala Ala Ala Asn Gly Leu Gln Gly Ser
110 115 120ggc tgg gcg gtg ctg ggt tat gac acc gtg ggc agc cgg ttg ctg acc676Gly Trp Ala Val Leu Gly Tyr Asp Thr Val Gly Ser Arg Leu Leu Thr125 130 135ttc cag ctc tac gac cag cag gcc aac gtc ccg ctg ggc atc atc ccg724Phe Gln Leu Tyr Asp Gln Gln Ala Asn Val Pro Leu Gly Ile Ile Pro140 145 150 155ctg ctg cag gtc gac atg tgg gag cac gcg ttc tac ctg cag tac aag772Leu Leu Gln Val Asp Met Trp Glu His Ala Phe Tyr Leu Gln Tyr Lys160 165 170aac gtc aag gcg gat tac gtc aag gcg ttc tgg aac gtg gtc aac tgg820Asn Val Lys Ala Asp Tyr Val Lys Ala Phe Trp Asn Val Val Asn Trp175 180 185gcg gac gtg cag aag cgg tac gcc gcc gcc act tcc aag gcc caa ggc868Ala Asp Val Gln Lys Arg Tyr Ala Ala Ala Thr Ser Lys Ala Gln Gly190 195 200ctg atc ttc ggc tga ctttcctctc gatcggc 900Leu Ile Phe Gly205<210>60<211>207<212>PRT<213>鸟分枝杆菌副结核亚种<400>60Val Ala Glu Tyr Thr Leu Pro Asp Leu Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Leu1 5 10 15Glu Pro His Ile Ser Gly Gln Ile Asn Glu Ile His His Thr Lys His20 25 30His Ala Thr Tyr Val Lys Gly Val Asn Asp Ala Leu Ala Lys Leu Glu35 40 45Glu Ala Arg Ala Asn Glu Asp His Ala Ala Ile Phe Leu Asn Glu Lys50 55 60
Asn Leu Ala Phe His Leu Gly Gly His Val Asn His Ser Ile Trp Trp65 70 75 80Lys Asn Leu Ser Pro Asp Gly Gly Asp Lys Pro Thr Gly Glu Leu Ala85 90 95Ala Ala Ile Asp Asp Ala Phe Gly Ser Phe Asp Lys Phe Arg Ala Gln100 105 110Phe Ser Ala Ala Ala Asn Gly Leu Gln Gly Ser Gly Trp Ala Val Leu115 120 125Gly Tyr Asp Thr Val Gly Ser Arg Leu Leu Thr Phe Gln Leu Tyr Asp130 135 140Gln Gln Ala Asn Val Pro Leu Gly Ile Ile Pro Leu Leu Gln Val Asp145 150 155 160Met Trp Glu His Ala Phe Tyr Leu Gln Tyr Lys Asn Val Lys Ala Asp165 170 175Tyr Val Lys Ala Phe Trp Asn Val Val Asn Trp Ala Asp Val Gln Lys180 185 190Arg Tyr Ala Ala Ala Thr Ser Lys Ala Gln Gly Leu Ile Phe Gly195 200 205<210>61<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>61gccgaataca ccttgccaga 20
<210>62<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>62cgtggtgctt gctgtggtga 20<210>63<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>63caattcagcg ccgccgccaa20<210>64<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>64acctggactg ggactacgga20<210>65<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>65tcattggcgc cctttacgta20<210>66
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>66aattcagcgc cgccgccaac 20<210>67<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>67tggactggga ctacggagca 20<210>68<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>68cgagtttggc gacggcgtca 20<210>69<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>69aagttccggg cgcaattcag 20<210>70<211>40
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>70gatgcaaggt cgcatatgag gccgaataca ccttgccaga40<210>71<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>71aattctaata cgactcacta tagggagaag gcgtggtgct tgctgtggtg a51<210>72<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>72gatgcaaggt cgcatatgag tggactggga ctacggagca 40<210>73<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>73aattctaata cgactcacta tagggagaag gcgagtttgg cgacggcgtc a51<210>74<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>74gcgccaagga agatcactca 20<210>75<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>75ggcgacaggt tcttccacca20<210>76<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>76gaatctagct ttcaacctcg20<210>77<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>77caaggaagat cactcagcga20<210>78<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>78gtcaccaccg ttaggcgaca 20<210>79<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>79atctagcttt caacctcgcc 20<210>80<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>80agcgatcttg ctgaacgaaa 20<210>81<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>81tgggcttgtc accaccgtta 20<210>82<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>探针<400>82ggccacgtca atcacaccat 20<210>83<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>83ttccagctct acgaccagca 20<210>84<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>84ttggaagtgg cggcggcgta 20<210>85<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>85aaggcggatt acgtcaaggc 20<210>86<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>86ctctacgacc agcaggccaa 20<210>87<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>87ctgcacgtcc gcccagttga 20<210>88<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>88aagaacgtca aggcggatta 20<210>89<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>89tacgaccagc aggccaacgt 20<210>90<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针
<400>90cacgtccgcc cagttgacca 20<210>91<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>91gtacaagaac gtcaaggcgg 20<210>92<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>92tcgagctgcc agtgtggtca 20<210>93<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>93acgagaatgg aagggggaca 20<210>94<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针
<400>94aacagggtcg gatcggccta 20<210>95<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>95ccagtgtggt catttccata 20<210>96<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>96agggcaccac gagaatggaa 20<210>97<211> 20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>97gcgcggaggt cgaaatggaa 20<210>98<211>561<212>DNA<213>结核分枝杆菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(561)
<223>
<400>98atg cgg gcg ttg atc atc gtc gac gtg cag aac gac ttc tgc gag ggt 48Met Arg Ala Leu Ile Ile Val Asp Val Gln Asn Asp Phe Cys Glu Gly1 5 10 15ggc tcg ctg gcg gta acc ggt ggc gcc gcg ctg gcc cgc gcc atc agc 96Gly Ser Leu Ala Val Thr Gly Gly Ala Ala Leu Ala Arg Ala Ile Ser20 25 30gac tac ctg gcc gaa gcg gcg gac tac cat cac gtc gtg gca acc aag 144Asp Tyr Leu Ala Glu Ala Ala Asp Tyr His His Val Val Ala Thr Lys35 40 45gac ttc cac atc gac ccg ggt gac cac ttc tcc ggc aca ccg gac tat 192Asp Phe His Ile Asp Pro Gly Asp His Phe Ser Gly Thr Pro Asp Tyr50 55 60tcc tcg tcg tgg cca ccg cat tgc gtc agc ggt act ccc ggc gcg gac 240Ser Ser Ser Trp Pro Pro His Cys Val Ser Gly Thr Pro Gly Ala Asp65 70 75 80ttc cat ccc agt ctg gac acg tcg gca atc gag gcg gtg ttc tac aag 288Phe His Pro Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ile Glu Ala Val Phe Tyr Lys85 90 95ggt gcc tac acc gga gcg tac agc ggc ttc gaa gga gtc gac gag aac 336Gly Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Ser Gly Phe Glu Gly Val Asp Glu Asn100 105 110ggc acg cca ctg ctg aat tgg ctg cgg caa cgc ggc gtc gat gag gtc 384Gly Thr Pro Leu Leu Asn Trp Leu Arg Gln Arg Gly Val Asp Glu Val115 120 125gat gtg gtc ggt att gcc acc gat cat tgt gtg cgc cag acg gcc gag 432Asp Val Val Gly Ile Ala Thr Asp His Cys Val Arg Gln Thr Ala Glu130 135 140gac gcg gta cgc aat ggc ttg gcc acc agg gtg ctg gtg gac ctg aca 480Asp Ala Val Arg Asn Gly Leu Ala Thr Arg Val Leu Val Asp Leu Thr145 150 155 160gcg ggt gtg tcg gcc gat acc acc gtc gcc gcg ctg gag gag atg cgc 528Ala Gly Val Ser Ala Asp Thr Thr Val Ala Ala Leu Glu Glu Met Arg165 170 175acc gcc agc gtc gag ttg gtt tgc agc tcc tga 561Thr Ala Ser Val Glu Leu Val Cys Ser Ser
180 185<210>99<211>186<212>PRT<213>结核分枝杆菌<400>99Met Arg Ala Leu Ile Ile Val Asp Val Gln Asn Asp Phe Cys Glu Gly1 5 10 15Gly Ser Leu Ala Val Thr Gly Gly Ala Ala Leu Ala Arg Ala Ile Ser20 25 30Asp Tyr Leu Ala Glu Ala Ala Asp Tyr His His Val Val Ala Thr Lys35 40 45Asp Phe His Ile Asp Pro Gly Asp His Phe Ser Gly Thr Pro Asp Tyr50 55 60Ser Ser Ser Trp Pro Pro His Cys Val Ser Gly Thr Pro Gly Ala Asp65 70 75 80Phe His Pro Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ile Glu Ala Val Phe Tyr Lys85 90 95Gly Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Ser Gly Phe Glu Gly Val Asp Glu Asn100 105 110Gly Thr Pro Leu Leu Asn Trp Leu Arg Gln Arg Gly Val Asp Glu Val115 120 125Asp Val Val Gly Ile Ala Thr Asp Hi s Cys Val Arg Gln Thr Ala Glu130 135 140Asp Ala Val Arg Asn Gly Leu Ala Thr Arg Val Leu Val Asp Leu Thr145 150 155 160
Ala Gly Val Ser Ala Asp Thr Thr Val Ala Ala Leu Glu Glu Met Arg165 170 175Thr Ala Ser Val Glu Leu Val Cys Ser Ser180 18权利要求
1.一种检测待测样本中微生物存在的方法，该方法包括将待测样本暴露于能诱导所述微生物中至少一个基因表达的诱导物下并检测从暴露于所述诱导物而被诱导的基因转录的mRNA的存在。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的微生物是生长缓慢的细菌。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述生长缓慢的细菌选自疏螺旋体属片球菌属、枝原体属或分枝杆菌属。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其中检测从暴露于所述诱导物而被诱导的基因转录的mRNA存在的步骤包括进行扩增反应以扩增全长或部分mRNA并检测扩增反应的特异性产物。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述的扩增反应是RT-PCR或依赖核酸序列的扩增。
6.如权利要求3至5任一项所述的方法，其中所述的诱导物是氧或过氧化氢，并且由于暴露于所述诱导物而被诱导的基因是编码过氧化物歧化酶的基因。
7.如权利要求6所述的方法，其中检测从编码过氧化物歧化酶的基因转录的mRNA存在的步骤包括(a)组装反应混合物，该混合物包含适用于通过NASBA扩增所述mRNA一段区域的NASBA P1和NASBA P2引物对、RNA指导的DNA聚合酶、水解RNA-DNA杂合体的RNA链而不水解单链或双链RNA或DNA的核糖核酸酶、识别NASBA P1引物中存在的启动子序列的RNA聚合酶以及核糖核苷三磷酸和脱氧核糖核苷三磷酸；(b)在允许NASBA扩增反应的反应条件下将所述反应介质与从怀疑含有微生物的待测样本中分离的核酸制备物一起温育；并且(c)检测和/或定量测定NASBA扩增反应的任何特异性产物。
8.如权利要求7所述的方法，该方法用于检测分枝杆菌属，其中所述NASBA P1和NASBA P2引物对是下列中的一种包含SEQ ID NO20的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO19的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO26的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO25的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO32的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO31的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO38的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO37的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO61的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO62的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO64的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO65的NASBA P2引物；NASBA P1引物4-86和包含SEQ ID NO61的NASBA P2引物，优选引物4-85；引物4-92和包含SEQ ID NO64的NASBA P2引物，优选引物4-91；引物4-104和包含SEQ ID NO19的NASBA P2引物，优选引物4-103；或引物4-122和包含SEQ ID NO31的NASBA P2引物，优选引物4-115。
9.如权利要求6所述的方法，其中检测从编码过氧化物歧化酶的基因转录的mRNA存在的步骤包括通过RT-PCR扩增部分mRNA。
10.如权利要求9所述的方法，该方法用于检测分枝杆菌属，其中使用一种下列引物对实施，通过RT-PCR扩增部分mRNA包含SEQ ID NO20的PCR引物和包含SEQ ID NO19的PCR引物；包含SEQ ID NO26的PCR引物和包含SEQ ID NO25的PCR引物；包含SEQ ID NO32的PCR引物和包含SEQ ID NO31的PCR引物包含SEQ ID NO38的PCR引物和包含SEQ ID NO37的PCR引物；包含SEQ ID NO61的PCR引物和包含SEQ ID NO62的PCR引物；或包含SEQ ID NO64的PCR引物和包含SEQ ID NO65的PCR引物。
11.如权利要求3至5任一项所述的方法，其中所述的诱导物是异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷或吡嗪酰胺，并且由于暴露于所述诱导物而被诱导的基因是pncA基因。
12.如权利要求11所述的方法，其中检测从pncA基因转录的mRNA存在的步骤包括(a)组装反应混合物，该混合物包含适用于通过NASBA扩增所述mRNA一段区域的NASBA P1和NASBA P2引物对、RNA指导的DNA聚合酶、水解RNA-DNA杂合体的RNA链而不水解单链或双链RNA或DNA的核糖核酸酶、识别NASBA P1引物中存在的启动子序列的RNA聚合酶以及核糖核苷三磷酸和脱氧核糖核苷三磷酸；(b)在允许NASBA扩增反应的反应条件下将所述反应介质与从怀疑含有微生物的待测样本中分离的核酸制备物一起温育；并且(c)检测和/或定量测定NASBA扩增反应的任何特异性产物。
13.如权利要求12所述的方法，该方法用于检测结核分枝杆菌，其中所述NASBA P1和NASBAP2引物对是下列中的一种包含SEQ ID NO2的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO1的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO8的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO7的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO14的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO13的NASBA P2引物；引物4-2和包含SEQ ID NO1的NASBA P2引物，优选引物4-1；引物4-8和包含SEQ ID NO7的NASBA P2引物，优选引物4-7；或引物4-14和包含SEQ ID NO13的NASBA P2引物，优选引物4-15。
14.如权利要求11所述的方法，其中检测从pncA基因转录的mRNA存在的步骤包括通过RT-PCR扩增部分mRNA。
15.如权利要求14所述的方法，该方法用于检测结核分枝杆菌，其中使用一种下列引物对实施，通过RT-PCR扩增部分mRNA包含SEQ ID NO2的PCR引物和包含SEQ ID NO1的PCR引物；包含SEQ ID NO8的PCR引物和包含SEQ ID NO7的PCR引物；或包含SEQ ID NO14的PCR引物和包含SEQ ID NO13的PCR引物。
16.一种用于检测在分枝杆菌属的种中表达的mRNA的寡核苷酸引物，其中从可诱导型基因转录mRNA，所述寡核苷酸引物选自(i)包含SEQ ID NOs2、8、14、20、26、32、38、62、65、68、75、78、81、84、87、90、93或96中一条的NASBA P1引物；(ii)引物号为4-2、4-8、4-14、4-86、4-98、4-104、4-110、4-116或4-122的NASBA P1引物；(iii)包含SEQ ID NOs1、7、13、19、25、31、37、61、64、67、74、77、80、83、86、89、92或95中一条的NASBA P2引物；(iv)引物号为4-1、4-7、4-13、4-85、4-97、4-103、4-109、4-115或4-121的NASBA P2引物；(v)包含SEQ ID NOs1、2、7、8、13、14、19、20、25、26、31、32、37、38、61、62、64、65、67、68、74、75、77、78、80、81、83、84、87、88、89、90、92、93、95或96中一条的PCR引物。
17.一种用于检测在分枝杆菌属的种中表达的mRNA的寡核苷酸探针，其中从可诱导型基因转录mRNA，所述寡核苷酸分子选自(i)包含SEQ ID NOs3、9、15、21、27、33、39、63、66、69、76、79、82、85、88、91、94或97中一条的探针寡核苷酸；(ii)SEQ ID NO4、5、6、10、11、12、16、17、18、22、23、24、28、29、30、34、35、36、40、41或42的分子标灯探针寡核苷酸。
18.一种用于通过NASBA检测在分枝杆菌属的种中表达的mRNA的引物/探针组合，其中从可诱导型基因转录mRNA，所述引物/探针组合选自包含SEQ ID NO2的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO1的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO3的探针或者选自SEQ ID NOs4、5或6的至少一个分子标灯探针；包含SEQ ID NO8的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO7的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO9的探针或者选自SEQ ID NOs10、11或12的至少一个分子标灯探针；包含SEQ ID NO14的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO13的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO15的探针或者选自SEQ IDNOs16、17或18的至少一个分子标灯探针；引物4-2，包含SEQ ID NO1的NASBA P2引物，优选引物4-1，和或者包含SEQ ID NO3的探针或者选自SEQ ID NOs4、5或6的至少一个分子标灯探针；引物4-8，包含SEQ ID NO7的NASBA P2引物，优选引物4-7，和或者包含SEQ ID NO9的探针或者选自SEQ ID NOs10、11或12的至少一个分子标灯探针；引物4-14，包含SEQ ID NO13的NASBA P2引物，优选引物4-15，和或者包含SEQ ID NO15的探针或者选自SEQ ID NOs16、17或18的至少一个分子标灯探针；包含SEQ ID NO20的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO19的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO21的探针或者选自SEQ IDNOs22、23或24的至少一个分子标灯探针；包含SEQ ID NO26的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO25的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO27的探针或者选自SEQ IDNOs28、29或30的至少一个分子标灯探针；包含SEQ ID NO32的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO31的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO33的探针或者选自SEQ IDNOs34、35或36的至少一个分子标灯探针；包含SEQ ID NO38的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO37的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO39的探针或者选自SEQ IDNOs40、41或42的至少一个分子标灯探针；NASBA P1引物4-86和包含SEQ ID NO61的NASBA P2引物，优选引物4-85；引物4-104和包含SEQ ID NO19的NASBA P2引物，优选引物4-103。
19.一种用于通过RT-PCR检测在分枝杆菌属的种中表达的mRNA的引物组合，其中从可诱导型基因转录mRNA，所述引物组合选自包含SEQ ID NO2的PCR引物和包含SEQ ID NO1的PCR引物；包含SEQ ID NO8的PCR引物和包含SEQ ID NO7的PCR引物；包含SEQ ID NO14的PCR引物和包含SEQ ID NO13的PCR引物；包含SEQ ID NO20的PCR引物和包含SEQ ID NO19的PCR引物；包含SEQ ID NO26的PCR引物和包含SEQ ID NO25的PCR引物；包含SEQ ID NO32的PCR引物和包含SEQ ID NO31的PCR引物；包含SEQ ID NO38的PCR引物和包含SEQ ID NO37的PCR引物。
20.一种用于通过RT-PCR检测在分枝杆菌属的种中表达的mRNA的引物/探针组合，其中从可诱导型基因转录mRNA，所述引物/探针组合选自包含SEQ ID NO2的PCR引物、包含SEQ ID NO1的PCR引物和包含SEQ ID NO3的探针；包含SEQ ID NO8的PCR引物、包含SEQ ID NO7的PCR引物和包含SEQ ID NO9的探针；包含SEQ ID NO14的PCR引物、包含SEQ ID NO13的PCR引物和包含SEQ ID NO15的探针；包含SEQ ID NO20的PCR引物、包含SEQ ID NO19的PCR引物和包含SEQ ID NO21的探针；包含SEQ ID NO26的PCR引物、包含SEQ ID NO25的PCR引物和包含SEQ ID NO27的探针；包含SEQ ID NO32的PCR引物、包含SEQ ID NO31的PCR引物和包含SEQ ID NO33的探针；或包含SEQ ID NO38的PCR引物、包含SEQ ID NO37的PCR引物和包含SEQ ID NO39的探针。
全文摘要
本发明提供了通过诱导mRNA表达并检测诱导的mRNA，来检测微生物，特别是生长缓慢的细菌如分枝杆菌属(Mycobacterium)细菌存在的方法。本发明还提供了用于检测分枝杆菌属的寡核苷酸引物和探针。
文档编号C12Q1/68GK1514882SQ02809940
公开日2004年7月21日 申请日期2002年3月20日 优先权日2001年3月20日
发明者弗兰克·卡尔森, 弗兰克 卡尔森 申请人:挪其普公司