Cry2Ab杀虫蛋白质的氨基酸序列（634个氨基酸），如序列表中SEQ ID No: 3 所示；编码相应于所述Cry2Ab杀虫蛋白质的氨基酸序列的Cry2Ab核苷酸序列（1905个核 苷酸），如序列表中SEQ ID NO: 4所示。
[0086] 2、合成上述核苷酸序列
[0087] 所述CrylA. 105核苷酸序列（如序列表中SEQ ID NO: 2所示）和所述Cry2Ab核苷 酸序列（如序列表中SEQ ID N0:4所示）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的所 述CrylA. 105核苷酸序列（SEQ ID N0:2)的5'端还连接有NcoI酶切位点，所述CrylA. 105 核苷酸序列（SEQ ID NO: 2)的3'端还连接有HindIII酶切位点；合成的所述Cry2Ab核苷 酸序列（SEQ ID N0:4)的5'端还连接有NcoI酶切位点，所述Cry2Ab核苷酸序列（SEQ ID NO:4)的3'端还连接有SpeI酶切位点。
[0088] 第二实施例、重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌
[0089] 1、构建含有CrylA. 105基因的重组克隆载体
[0090] 将合成的CrylA. 105核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T(Promega，Madison，USA， CAT :A3600)上，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T载体说明书进行，得到重组克隆载体 DBN01-T，其构建流程如图1所示（其中，Amp表示氨苄青霉素抗性基因；Π 表示噬菌体Π 的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；T7为T7RNA聚合酶启 动子；CrylA. 105为CrylA. 105核苷酸序列（SEQ ID NO:2) ;MCS为多克隆位点）。
[0091] 然后将重组克隆载体DBNOl-T用热激方法转化大肠杆菌Tl感受态细胞 (Transgen，Bei jing，China，CAT :CD501)，其热激条件为：50 μ 1 大肠杆菌 Tl 感受态 细胞、10μ1质粒DNA(重组克隆载体DBN01-T)，42°C水浴30秒；37。。振荡培养1小 时（IOOrpm转速下摇床摇动），在表面涂有IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）和 X-gal (5-溴-4-氯-3- Π 引噪-β -D-半乳糖苷）的氨节青霉素（100晕克/升）的LB平板 (胰蛋白胨l〇g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7. 5)上生长 过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨 苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7. 5)中于温度37°C条件下培养过夜。碱法提取其质粒： 将菌液在12000rpm转速下离心lmin，去上清液，沉淀菌体用100 μ 1冰预冷的溶液I (25mM Tris-HCl，10mM EDTA(乙二胺四乙酸），50mM葡萄糖，pH8. 0)悬浮；加入200 μ1新配制的溶 液II (0. 2Μ NaOH，1 % SDS (十二烷基硫酸钠）），将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min ;加 入150 μ 1冰冷的溶液III (3M醋酸钾，5M醋酸），立即充分混勾，冰上放置5-10min ;于温度 4°C、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置 5111；[11;于温度4<€、转速12000印1]1条件下离心5111；[11，弃上清液，沉淀用浓度（￥/'\0为70%的 乙醇洗涤后晾干；加入 30 μ 1 含 RNase (20 μ g/ml)的 TE(10mM Tris-HCl，ImM EDTA，pH8. 0) 溶解沉淀；于温度37°C下水浴30min，消化RNA ;于温度-20°C保存备用。
[0092] 提取的质粒经AhdI和XhoI酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组 克隆载体DBN01-T中插入的所述CrylA. 105核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO: 2所示的核 苷酸序列，即CrylA. 105核苷酸序列正确插入。
[0093] 按照上述构建重组克隆载体DBN01-T的方法，将合成的所述Cry2Ab核苷酸序列 连入克隆载体pGEM-Τ上，得到重组克隆载体DBN02-T，其中，Cry2Ab为Cry2Ab核苷酸序列 (SEQ ID N0:4)。酶切和测序验证重组克隆载体DBN02-T中所述Cry2Ab核苷酸序列正确插 入。
[0094] 2、构建含有CrylA. 105基因的重组表达载体
[0095] 用限制性内切酶NcoI和HindIII分别酶切重组克隆载体DBN01-T和表达载体 DBNBC-01 (载体骨架：pCAMBIA2301 (CAMBIA机构可以提供）），将切下的CrylA. 105核苷酸 序列片段插到表达载体DBNBC-01的NcoI和HindIII位点之间，利用常规的酶切方法构建 载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBN100745,其构建流程如图2所示 (Kan :卡那霉素基因 ；RB :右边界；Ubi :玉米Ubiquitin(泛素）基因启动子（SEQ ID NO:5); CrylA. 105 :CrylA. 105核苷酸序列（SEQ ID N0:2) ;Nos :胭脂碱合成酶基因的终止子（SEQ ID N0:6) ;Hpt :潮霉素抗性基因 （SEQ ID N0:7) ;LB :左边界）。
[0096] 将重组表达载体DBN100745用热激方法转化大肠杆菌Tl感受态细胞，其热激条 件为：5(^1大肠杆菌11感受态细胞、1(^1质粒0嫩（重组表达载体08附00745)，42°〇 水浴30秒；37°C振荡培养1小时（IOOrpm转速下摇床摇动）；然后在含50mg/L卡那霉素 (Kanamycin)的LB固体平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L， 用NaOH调pH至7. 5)上于温度37°C条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基 (胰蛋白胨l〇g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7. 5) 中于温度37°C条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶NcoI 和HindIII酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN100745 在NcoI和HindIII位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0:2所示核苷酸序列，即 CrylA. 105核苷酸序列。
[0097] 按照上述构建重组表达载体DBN100745的方法，将NcoI和SpeI酶切重组克隆 载体DBN02-T切下的所述Cry2Ab核苷酸序列插入表达载体DBNBC-Ol，得到重组表达载体 DBN100744。酶切和测序验证重组表达载体DBN100744中的核苷酸序列含有为序列表中SEQ ID NO: 4所示核苷酸序列，即Cry2Ab核苷酸序列，所述Cry2Ab核苷酸序列可以连接所述Ubi 启动子和Nos终止子。
[0098] 按照上述构建重组表达载体DBN100745的方法，将NcoI和HindIII、NcoI和SpeI 分别酶切重组克隆载体DBNOl-T和DBN02-T切下的所述CrylA. 105核苷酸序列和Cry2Ab 核苷酸序列插入表达载体DBNBC-01，得到重组表达载体DBN100029。酶切和测序验证重组 表达载体DBN100029中的核苷酸序列含有为序列表中SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 4所示核 苷酸序列，即CrylA. 105核苷酸序列和Cry2Ab核苷酸序列，所述CrylA. 105核苷酸序列和 所述Cry2Ab核苷酸序列可以连接所述Ubi启动子和Nos终止子。
[0099] 3、重组表达载体转化农杆菌
[0100] 对己经构建正确的重组表达载体DBN100745、DBN100744和DBN100029用液氮法转 化到农杆菌 LBA4404(Invitrgen，Chicago, USA，CAT :18313-015)中，其转化条件为：100 μ L 农杆菌LBA4404、3yL质粒DNA(重组表达载体）；置于液氮中10分钟，37°C温水浴10分钟； 将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28°C、转速为200rpm条件下培养2小 时，涂于含50mg/L的利福平（Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素（Kanamycin)的LB平板 上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶AhdI和XhoI对重 组表达载体DBN100745、DBN100744和DBN100029酶切后进行酶切验证，结果表明重组表达 载体 DBN100745、DBN100744 和 DBN100029 结构完全正确。
[0101] 第三实施例、转基因植株的获得
[0102] 1、获得转基因玉米植株
[0103] 按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的玉米品种综31 (Z31)的幼胚与第二 实施例中3所述的农杆菌共培养，以将第二实施例中2构建的重组表达载体DBN100745、 DBN100744和DBN100029中的T-DNA (包括玉米Ubiquitin基因的启动子序列、CrylA. 105 核苷酸序列、Cry2Ab核苷酸序列、Hpt基因和Nos终止子序列）转入到玉米染色体组中，获 得了转入CrylA. 105核苷酸序列的玉米植株、转入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和转入 CrylA. 105-Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株；同时以野生型玉米植株作为对照。
[0104] 对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离未成熟的幼胚，用农杆 菌悬浮液接触幼胚，其中农杆菌能够将CrylA. 105核苷酸序列、Cry2Ab核苷酸序列和 CrylA. 105-Cry2Ab核苷酸序列传递至幼胚之一的至少一个细胞（步骤I :侵染步骤），在此 步骤中，幼胚优选地浸入农杆菌悬浮液（OD66tl= 0. 4-0. 6,侵染培养基（MS盐4. 3g/L、MS维 他命、干酪素300mg/L、鹿糖68. 5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮（AS)40mg/L、2, 4-二氯苯 氧乙酸（2,4-D)lmg/L，ρΗ5·3))中以启动接种。幼胚与农杆菌共培养一段时期（3天）（步 骤2 :共培养步骤）。优选地，幼胚在侵染步骤后在固体培养基（MS盐4. 3g/L、MS维他命、 干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮（AS) 100mg/L、2, 4-二氯苯氧乙酸 (2, 4-D) lmg/L、琼脂8g/L，pH5. 8)上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的"恢复" 步骤。在"恢复"步骤中，恢复培养基（MS盐4. 3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/ L、2, 4-二氯苯氧乙酸（2, 4-D) lmg/L、植物凝胶3g/L，pH5. 8)中至少存在一种己知抑制农杆 菌生长的抗生素（头孢霉素），不添加植物转化体的选择剂（步骤3 :恢复步骤）。优选地， 幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复 期。接着，接种的幼胚在含选择剂（潮霉素）的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织 (步骤4 :选择步骤）。优选地，幼胚在有选择剂的筛选固体培养基（MS盐4. 3g/L、MS维他命、 干酪素300mg/L、鹿糖5g/L、潮霉素50mg/L、鹿糖30g/L、2, 4-二氯苯氧乙酸（2, 4-D) lmg/L、 植物凝胶3g/L，pH5. 8)上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组