专利名称：一种水稻光敏核不育系的分子检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及利用2对光敏基因引物和2种核酸内切酶检测光敏核不育系的方法及试剂盒。
背景技术：
杂交水稻的推广应用已经极大地促进了全球稻米产量的増加。光敏核不育系(PGMS)是两系农作物杂交种的核心部分。利用光敏核不育系进行的杂交水稻制种已获得了非常成功的发展并得到广泛应用。因而在杂交水稻育种中不育系的鉴定是非常重要的一环。光温条件控制水稻育性转换的分子机制的研究目前已经取得了 很大的进展。大部分真核生物的基因组序列转录成了长的非编码RNA (lncRNAs)。其中长日特定雄性育性相关RNA (LDMAR)调节水稻的PSMS。在长日条件下植物正常花粉的发育需要足够数量的LDMAR的转录。野生型和突变体之间的单核苷酸多态性(SNP)改变了 LDMAR的ニ级结构。在长日条件下，导致了发育中的花粉过早的细胞程序化死亡(PCD)，从而导致PSMS。有研究表明“农垦58S”光敏不育性主要受第12染色体的一个主效基因座pmsl2-l控制。在正常水稻中，野生型PMS12-1的表达抑制了光敏不育的发生。PMS12-1编码了ー个独特的非编码RNA，产生ー个名为osa-smR5864w的21个核苷酸的小分子RNA。与正常水稻品种相比，光敏不育水稻中pmsl2-l发生了 C-G的一个替换，该突变影响了小RNA的表达水平及其可能与靶基因的互作能力而产生雄性不育，是构成粳稻光敏核不育系的原因。目前进行光敏核不育系鉴定的主要方法是花粉镜检法和自交结实法。其中花粉镜检法因为直观、操作简便和成本低可用于大群体鉴定而成为目前进行不育系鉴定的主要方法。但这一方法存在如下一些缺点水稻生育期太长而受时间限制、育性划分模糊和较难判断。光敏核不育系是因为pmsl2-l的点突变所致，与正常水稻相比，突变体发生了 C-G的一个替换，这为依据pmsl2-l的基因序列来鉴定光敏核不育系提供了依据。而对单碱基多态性位点的检测有赖于操作简便、结果明了的检测方法。较常见的单碱基多态性位点的检测方法包括测序、SSCP、RFLP等方法。这些方法虽各有优点，但也各有其不足之处。测序可以直接测出DNA序列中的所有突变位点的碱基替代情况，但该方法需要昂贵的仪器和较长的步骤，成本较高；SSCP方法较为成熟，但操作繁琐，耗时长，结果易造成误判；PCR-RFLP方法要求待测多态性位点和某一酶切位点相关。
发明内容
本发明的目的是为了快速准确的检测出水稻材料是否为光敏核不育系，从而提供ー种光敏核不育系的分子检测方法及检测试剂盒，本发明方法可根据特异引物和核酸内切酶来鉴定光敏核不育系。本发明的目的是通过以下方式实现的—种水稻光敏核不育系的分子检测方法，包括如下步骤
a.抽提水稻叶片中基因组总DNA ;b.任选以下一对引物对提取的基因组总DNA进行PCR扩增；GC-Dl 正向引物GCATGCTTCACCAGCACGTCCA，反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG；GC-D2 正向引物CCCATATATCTTGTCCAGTGCT，反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG；c.将扩增产物用核酸内切酶进行酶切；如用引物GC-Dl扩增得到的PCR产物用核酸内切酶RsaI进行酶切；如用引物GC-D2扩增得到的PCR产物用核酸内切酶AccI进行酶切；d.由酶切产物的带谱推出该基因的SNP如果是G，则该材料为光敏核不育系；SNP如果是C，则不是光敏核不育系。所述的步骤d中用RsaI酶切，如果SNP是G，得到381bp、224bp和108bp3个条带；如果SNP是C，得到605bp和108bp2个条带；用AccI酶切，如果SNP是G，无酶切产物；如果SNP是C，得到443bp和334bp2个条带。一种水稻光敏核不育系的分子检测试剂盒，包括引物GC-D I:正向引物GCATGCTTCACCAGCACGTCCA，反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG，和核酸内切酶RsaI;
或者引物GC-D2:正向引物CCCATATATCTTGTCCAGTGCT，反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG，和核酸内切酶AccI;或者以上两对引物和两种核酸内切酶。本发明的试剂盒还包括用于PCR扩增和酶切的常规试剂。本发明的技术效果在于1)本发明从分子水平建立了一个检测光敏核不育系的方法及检测工具，传统的鉴定水稻育性的方法主要是根据花粉育性观察来判断的，但是水稻生育期长，因而从花粉育性来判别的话耗时长，也不利于材料的合理利用。本发明利用光敏核不育材料的野生型和突变体之间光敏基因的单核苷酸多肽性(SNP)来判断其是否为光敏核不育系。这就可以直接在苗期来对光敏水稻材料的育性进行检測。随着育种的推迸，很多不育系的来源属于光敏还是温敏已变得模糊，通过本方法可准确地检测出不育材料是否为光敏不育系或光敏不育来源，从而更好地引导育种。2)本发明中根据农垦58Spmsl2-l设计的2对引物和核酸内切酶可以准确地检测出单碱基多态性位点。只需根据酶切产物就可检测出该光敏基因的SNP是C还是G，从而鉴定该材料的育性，为光敏核不育系的鉴定提供了有力的鉴定依据。相对于其它单碱基多态性位点检测方法，PCR-RFLP耗时短、操作简単、不需测序，这样就可以节约成本。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进ー步的说明，而不会造成对本发明的限制。
图I为GC-D1、GC-D2引物对不同不育系及可育系对照组的PCR扩增結果。I:农垦 58; 2:农垦 58S;3:安农 N ;4 :安农 S-I ；5 :培矮 64S ；6 :双 88S ；7 Y58S ；8 :株 1S。图2为用RsaI和AccI两种核酸内切酶对不同不育系及可育系对照组PCR产物的酶切結果。I:农垦58; 2:农垦58S;3:安农N;4 :安农S-I ；5 :培矮64S ；6 :双88S ；7 Y58S ；8 :株 1S。
具体实施例方式实施例I : 选用的水稻材料为农垦58、农垦58S、安农N、安农S_l、培矮64S、双88S、Y58S、株IS和农垦58SX农垦58的Fl种子(以上均是常见和公知的水稻品种，本领域技术人员均知晓这些品种是否属于光敏不育植株)，按照常规DNA抽提方法从幼苗叶片中抽提出符合质量要求的基因组总DNA。选用GC-D1、GC-D2共2个引物进行PCR扩增和检测，并分别用内切酶对PCR产物进行酶切和检测。获得的图片结果与实验预期完全一致，再根据野生型和突变型之间光敏基因的单碱基核苷酸差异，由酶切产物的带谱推导出该基因的SNP是C还是G，最终从分子水平上检测出水稻样本是否为光敏不育植株。(I)水稻叶片DNA的抽提选用的水稻材料为农垦58、农垦58S、安农N、安农S_l、培矮64S、双88S、Y58S、株IS和农垦58SX农垦58的Fl种子，8个材料叶片DNA的抽提均按照Murry等CTAB的方法。取O. 5g幼苗叶片放入研钵中，用液氮研磨至粉末状，然后迅速转移至I. 5ml离心管；加入 65°C预热的 700 μ I 提取液(IOOmMTris-Hcl (ΡΗ8. O), 20mM EDTA (PH8. O)，I. 4M Nacl，2%CTAB，调至PH8. 0，加入2ml疏基こ醇，用超纯水定容至1L)，轻轻混匀，在65°C水浴30 40min，冷却至室温；加入等体积的氯仿/异戊醇(24 :1)，温和上下颠倒离心管数次；4°C、12000rpm离心IOmin ;取上清液，转入新的离心管，并加等体积的氯仿/异戊醇，离心取上清，加入450 μ I预冷的异丙醇；-20°C放置I. 5h ;4°C、12000rpm离心IOmin ;用70%こ醇漂洗DNA沉淀2 3次，在超净工作台上风干，加入50 μ I TE溶解，_20°C保存备用。按照常规DNA抽提方法，可以从水稻叶片中抽提出符合质量要求的基因组总DNA。
(2) PCR扩增及检测分析以不同材料的基因组DNA为模板，选用GC-Dl和GC-D2这2对引物。PCR扩增反应系统成分为2 X Buffer :10 μ I ；dNTP(2mM) :4 μ I ;引物(IOmM) 1. 2μ I ； Taq SI (lu/μ I)
O.4μ I ;模板DNA :1 μ I ；ddH20 :3. 4 μ 1，总体积20 μ I。扩增程序为94°C变性2分钟，然后980C 10秒，520C 30秒，68°C I分钟进行35个循环，降温到4°C，完成PCR扩增程序。GC-Dl Forward primer GCATGCTTCACCAGCACGTCCAReverse primer TAGCTTGCTTCATCTTGGTATGProduct length 713bp。
GC-D2 Forward primer CCCATATATCTTGTCCAGTGCTReverse primer TAGCTTGCTTCATCTTGGTATGProduct length 777bp。琼脂糖凝胶电泳1%的琼 脂糖，120V电压电泳30分钟后，用凝胶成像仪拍照(图I)。(3) PCR产物的酶切及分析用GC-Dl扩增得到的PCR产物用核酸内切酶RsaI (GT/AC)进行酶切；用GC-D2扩增得到的PCR产物用核酸内切酶AccI(GT/MKAC)进行酶切。酶切反应体系为=IOXBuffer 2μ I ;PCR 产物5μ I ;内切酶(均为 IOu/μ I) 0. 5μ I ；ddH20 :12. 5 μ 1，总体积 20 μ I。反应程序为37°C，4小吋。酶切后进行琼脂糖凝胶电泳(图2)，获得的结果与预期一致用RsaI (GT/AC)酶切，如果SNP是G，得到381bp、224bp和108bp这3个条带；如果SNP是C，得到605bp和108bp2个条带。用AccI (GT/MKAC)酶切，如果SNP是G，无酶切产物；如果SNP是C，得到443bp和334bp这2个条带。实施例结果显示，根据农垦58Spmsl2_l基因序列设计的2对引物和2个核酸内切酶通过PCR-RFLP方法能够准确地推导出水稻材料中的SNP，从而用于检测水稻光敏核不育
系O
权利要求
1.一种水稻光敏核不育系的分子检测方法，其特征在于，包括如下步骤 a.抽提水稻叶片中基因组总DNA； b.任选以下一对引物对提取的基因组总DNA进行PCR扩增；GC-Dl 正向引物GCATGCTTCACCAGCACGTCCA, 反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG ；GC-D2 正向引物CCCATATATCTTGTCCAGTGCT， 反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG ； c.将扩增产物用核酸内切酶进行酶切； 如用弓I物GC-Dl扩增得到的PCR产物用核酸内切酶RsaI进行酶切；如用引物GC-D2扩增得到的PCR产物用核酸内切酶AccI进行酶切； d.由酶切产物的带谱推出该基因的SNP如果是G，则该材料为光敏核不育系；SNP如果是C,则不是光敏核不育系。
2.根据权利要求I所述的水稻光敏核不育系的分子检测方法，其特征在于， 所述的步骤d中用RsaI酶切，如果SNP是G，得到381bp、224bp和108bp3个条带；如果SNP是C，得到605bp和108bp2个条带； 用AccI酶切，如果SNP是G，无酶切产物；如果SNP是C，得到443bp和334bp2个条带。
3.—种水稻光敏核不育系的分子检测试剂盒，其特征在于，包括 引物GC-Dl 正向引物GCATGCTTCACCAGCACGTCCA, 反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG， 和核酸内切酶RsaI ； 或者引物GC-D2 正向引物CCCATATATCTTGTCCAGTGCT， 反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG， 和核酸内切酶AccI ； 或者以上两对引物和两种核酸内切酶。
全文摘要
本发明公开了一种鉴别水稻光敏核不育基因pms12-1的分子标记方法和试剂盒，包括基因组DNA的提取、PCR扩增、扩增产物的酶切分析。根据pms12-1的序列设计了2对引物和2种核酸内切酶，以此引物通过PCR反应，再对扩增产物进行酶切分析，确定光敏基因的SNP类型，从而鉴定是否含有光敏核不育基因或者可育基因，并能进一步区别pms12-1基因的纯合体和杂合体，达到快速简便鉴定水稻光敏核不育系的目的，从而指导田间选育，加速育种进程。
文档编号C12Q1/68GK102864227SQ20121035587
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月24日 优先权日2012年9月24日
发明者曹孟良, 李丁, 赵迎曦, 夏玉梅, 袁隆平, 高婧, 沈春修, 方真 申请人:湖南杂交水稻研究中心, 湖南隆平高科基因科技有限公司