专利名称：一种微拟球藻突变株及其重离子诱变选育方法
技术领域：
本发明涉及微生物工程领域，具体的说是一种微拟球藻突变株及其重离子诱变选育方法。
背景技术：
能源是人类社会赖以生存和发展的物质基础，高效、清洁的能源利用是实现经济可持续发展的重要保证。随着常规不可再生化石资源的不断减少、日益显著的全球气候变暖，使得能源、资源与环境成为人类社会可持续发展所面临的重要问题。生物质能源，包括生物柴油、生物乙醇等，由于其具有可再生性和环境友好等特点，被认为是解决能源危机的最有潜力的途径之一。
微藻由于具有生物质积累速度快、环境适应性强、含油量高、具有综合利用价值等特性，被认为是最有潜力的生物质能源原料。以微藻生产生物柴油为例，专家做了一个保守的估计，与每公顷高产油植物(如油棕榈、麻疯树)每年可以产生1800-6000升油脂相比，每公顷微藻每年可以产生5万-13万升油脂。微藻用于生产生物燃料的优势明显，但目前进行产业化生产还面临着巨大挑战，微藻生物燃料生产成本依然较高。降低微藻生物燃料生产成本主要集中在两个方面一是降低生产工艺成本；二是降低生产原料成本。而微藻生物燃料生产成本中的75%是原料成本。从降低生物原料成本入手成为降低微藻生物燃料生产成本的重中之重。提高微藻的油脂产率，培育生物量积累速率快、油脂产率高的藻种，提供优质生物燃料原料，是降低微藻生物燃料生产成本的有效手段。
微拟球藻(Nannochloropsis sp. 0Z-1)是直径为2-3 μ m的真核单细胞绿色微藻， 归属于褐藻门，大眼藻纲，单珠藻科，其细胞内油脂含量可达干重的68%，是公认的最有希望用于工业化的高产油海水藻之一。近年来已有多例以微拟球藻为材料在实验室内进行生物柴油制备的报道，该藻的产业化前景非常广阔。
近年来，重离子束特别是低能碳离子束作为一种新兴的辐射源，由于其对微生物与植物种子有很强的致突变作用，已经在微生物及植物诱变育种研究中取得了巨大的经济与社会效益，为育种提供了新的途径。与传统的诱变源相比，重离子束具有以下重要特点(I)传能线密度大，能在生物介质中产生高密度的电离、激发、能量和质量沉积，造成生物介质的损伤，易于突变体的形成；(2)能量沉积过程中，在其射程末端存在一个尖锐的能量损失峰，使得生物样品的局部受损，这种局部受损的位置可随离子能量的高低而变化，是选择可控的，有利于宏观定点、定位诱变，实现定向育种；(3)损伤后修复效应小，可产生大量的突变且突变体稳定；(4)相对生物学效应高，因此突变体的产生效率高且突变谱广。而目前为止，这种高效的诱变方式尚未应用于产油微藻的育种。
微拟球藻油脂含量高，是非常有潜力的生物柴油制备原料，但微藻大规模养殖成本高，生物量累积比较缓慢。采用生物技术手段诱变藻株，针对生长速率筛选微拟球藻突变株具有重要价值。而目前用于藻类育种的诱变技术筛选时间较短，通常只经过一次筛选， 得到的突变株遗传稳定性较差，容易出现回复突变。发明内容
本发明目的在于提供一种微拟球藻突变株及其重离子诱变选育方法。
为实现上述目的本发明采用技术方案为一种微拟球藻突变株，其特征在于微拟球藻分类学命名Nannochloropsis sp. OZ-I ΗΡ-l,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号；保藏日期:2012年5月14日，保藏号为=CGMCC No. 6140。
所述微拟球藻的诱变选育方法，其特征在于以野生型微拟球藻 (Nannochloropsis sp. OZ-I)作为出发藻株经光照培养至对数生长期，利用重离子加速器对处于对数生长期的藻株进行诱变，获得微拟球藻突变株Nannochloropsis sp. 0Z-1HP-1。
所述微拟球藻的诱变选育方法，其特征在于利用重离子加速器对生长至对数生长期的球藻进行不同剂量的碳重离子的辐射，将致死率达到50%的辐射剂量的藻株分别进行活化，再逐级传代培养，选取在逐级传代培养中Fv/Fm和0D750值稳定提高的生长迅速突变藻株，而后转接于鼓泡柱式光反应器中传代培养进一步筛选，获得微拟球藻突变株 Nannochloropsis sp. 0Z-1HP-1。
所述的微拟球藻的应用，其特征在于所述微拟球藻Nannochloropsis sp. 0Z-1 HP-I用于油脂、生物柴油、脂肪酸、叶绿素a、类胡萝卜素和或生物质成分。
本发明所具有的优点
本发明通过重离子诱变微拟球藻，采用叶绿素荧光成像系统Imaging PAM和酶标仪，以Fv/Fm和OD75tl作为考察指标，对突变体库进行高通量筛选，具有快速便捷的特点，保证了一定数量的筛选量。而通过多步逐级筛选的方法，进一步保证了微藻优良性状的稳定性，最终获得的优良藻株在不同规模的培养体积中都具有较高的生长速率。
本发明对单细胞产油微藻Nannochloropsis sp. 0Z-1进行重离子诱变,获得一株生长速率更快的突变株HP-I。该突变藻株生物量积累在培养末期较野生株提高19%，叶绿素a含量在培养第四天较野生株提高45%，类胡罗卜素含量较野生株提高47 %。该突变株油脂积累末期生物量较野生株提高33 %，含油量与野生株相比未显著性提高，油脂产率提高28%，由O. Zlgr1CT1提高为O. 27gr1d-10油脂特性分析显示突变株脂肪酸组成与野生型藻株相比未发生显著性差异，突变株油脂成分中TAG含量较野生型藻株提高14%。
图I为本发明实施例提供的微拟球藻重离子诱变不同辐照剂量致死率效果图。
图2为本发明实施例提供的微拟球藻野生型藻株WT和突变株HP-I生长曲线图。
图3A为本发明实施例提供的微拟球藻野生型藻株WT和突变株HP-I叶绿素a含量对比图。
图3B为本发明实施例提供的微拟球藻野生型藻株WT和突变株HP-I类胡萝卜含量对比图。
图4A为本发明实施例提供的微拟球藻野生型藻株WT和突变株HP-I产油期生长曲线图。
图4B为本发明实施例提供的微拟球藻野生型藻株WT和突变株HP-I光系统II最大光化学效率(Fv/Fm)图。
图5A为本发明实施例提供的微拟球藻野生型藻株WT和突变株HP-I油脂含量图。
图5B为本发明实施例提供的微拟球藻野生型藻株WT和突变株HP-I油脂产率图。
图6为本发明实施例提供的气相色谱分析野生株WT油脂脂肪酸组成图。
图7为本发明实施例提供的气相色谱分析突变株HP-I油脂脂肪酸组成图。
图8为本发明实施例提供的薄层层析分析野生株WT油脂组成图。
图9为本发明实施例提供的薄层层析分析突变株HP-I油脂组成图。
具体实施方式
根据下列实施例及附图，可以更好的理解本发明。
实施例I:微拟球藻重离子诱变突变体库的创制及高生长速率突变株筛选
I)取微拟球藻野生藻株(Nannochloropsis sp. 0Z-1)作为出发藻株；将所述藻株从平板上接种至含IOOmL Blue-Green Medium (简称BGl I)培养液的250mL锥形瓶中，置于光照培养箱中25°C，100ymol/m2 · s，连续光照培养至对数生长期。
BGll培养液的组成和配制参见表1，在配置培养液时，将以下成分以固体形式加入蒸馏水中配成100-1000倍的母液，使用时再按需稀释配置成培养液。而后将BGll培养基分装封口，灭菌处理。取出灭过菌的培养基，冷却至室温后，待用。
表I BGll培养基的组成及其含量
成分储液浓度使用时终浓度NaNO3150g/LI. 5g/LMgSO4. 7H2075.Og/L0. 075g/LCaCl2. 2H2036. Og/L0.036g/L柠檬酸6.Og/L0.006g/LNa2EDTAI. 0g/L0.OOlg/L丰宁檬酸铁铵6. Og/L0.006g/LNa2TO320.Og/L0.002g/LK2HPO440.Og/L0.004g/LH3BO32.86g/L0.000286g/LMnCl2. 4H20I. 47g/L0.000147g/LZnSO4. 7H200.222g/L0.0000222g/LNa2MoO4. 2H200.39g/L0.000039g/LCuSO4. 5H200.079g/L0.0000039g/LCo(NO3)2. 6H200.494g/L0.0000222g/L
2)取处于对数生长期的微拟球藻野生株，利用重离子加速器提供的碳重离子对藻株进行诱变创制突变体库；
取处于对数生长期的微拟球藻，使用血球计数板测定细胞数目后，稀释至 O. 5-1 X 107，分别取藻液I. 5mL，置于无菌平皿中。然后在重离子加速器垂直辐照终端装置下，进行诱变，诱变能量重离子束流为12C6+,能量为80MeV/u。将剂量范围设定为20Gy、40Gy、 60Gy、80Gy、lOOGy、120Gy、140Gy和160Gy。使用血球计数板对各辐照后样品进行细胞计数， 并稀释到1500个/mL，分别取200uL稀释液涂布平板，使每个平板数目在300个左右，将上述各不同剂量辐照的稀释后藻液涂布海水BGll固体平板后的存活藻的数目与野生株进行比较，计算致死率(参见图1)，选取致死在率50%以上的藻株进行重点筛选，得到含约2000 株诱变藻株的突变体库。
3)高生长速率突变藻株的初筛；
利用24孔细胞培养板可以实现藻株的大规模筛选，同时经过多步逐级筛选可以确保优良性状的稳定。上述经分离后平板保存的2000株诱变藻株转接于BGll固体培养基平板进行活化，而后从平板上将活化后的藻株接种于24孔细胞培养板中，每孔添加2mL BGll液体培养基，在温度为25±1°C、光强为lOOymol/m2 · s条件下连续光照培养8天后， 采用叶绿素荧光成像系统Imaging-PAM(德国WALZ公司)和酶标仪(Bio-Tech)对突变体库进行大规模筛选，考察指标为Fv/Fm值和OD75tl值，调整同样OD75tl值传代接种至新的24孔板中，生长8天后，测量OD75tl值和Fv/Fm值，挑选两次24孔板筛选OD75tl和Fv/Fm值提高10 % 突变株，调整相同OD75tl值传代接种入50mL锥形瓶中，在温度为25± 1°C、光强为100 μ mol/ m2 · s连续光照条件下培养10天后，测量OD75tl值和Fv/Fm，选择OD75tl值和Fv/Fm值提高10% 突变株接种于200mL锥形瓶中。在上述条件下培养10天后，测量OD75tl值和Fv/Fm值，最终得到生长迅速的15株诱变藻株保存于固体BGll培养基平板。
4)高生长速率的藻株的复筛；
经过初筛得到的生长迅速的15株诱变藻株经过复筛进一步筛选，并经过多步筛选步骤确定其优良性状的稳定。上述经分离后平板保存的15株诱变藻株转接于BGll固体培养基平板进行活化，而后从平板上将活化后的藻株分别接种于添加IOOmL BGll液体培养基的锥形瓶中在温度为25±1°C，光强为lOOymol/m2 · S，连续光照培养条件下培养至对数生长期，测定干重。以干重O. 3g/L接种于含400mL BGll液体培养基的鼓泡柱式光反应器中，每株设三个平行样，温度为25±1°C，光强为lOOymol/m2 · s，连续光照培养。并在反应器底部持续鼓泡通气，通气量为O. 25vvm，通入气体为纯CO2和自然空气混合，使培养液中 CO2的浓度为2% (体积比)，并使用0.22 μ m滤膜过滤除菌，培养10天后，测量干重。以干重O. 3g/L的突变藻株接种于含400mL BGll液体培养基的鼓泡柱式光反应器中，每株设三个平行样，上述条件下培养10天后，测量干重，以干重O. 3g/L的突变藻株接种于含400mL BGll液体培养基的鼓泡柱式光反应器中，每株设三个平行样，上述条件下培养10天。经过上述连续三次传代培养的筛选，获得高生长速率的微拟球藻Nannochloropsis sp. 0Z-1 HP-I突变株。
所述突变藻株HP-I于2012年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京朝阳区北辰西路I号院3号中科院微生物研究所，100101)， 保藏号为CGMCC No. 6140。
上述诱变方法也适用于诱变其他单细胞生物，筛选方法经过初筛和复筛的多步筛选步骤可从大量诱变株系中筛选出具有高生长速率性状稳定的单细胞藻类。
实施例2 :微拟球藻突变株HP-I和野生型藻株生物曲线绘制
将上述所得高生长速率突变株HP-I和野生株分别于含400mLBGll液体培养基的鼓泡柱式光反应器(外径4. Ocm,内径3. 8cm，柱高60cm)中培养至对数生长期，其培养条件为25土1°C，光强为lOOymol/m2 · S，连续光照培养。并在反应器底部持续鼓泡通气，通气量为0. 25vvm,通入气体为纯CO2和自然空气混合，使培养液中CO2的浓度为2% (体积比)， 使用0. 22 μ m滤膜过滤除菌；将上述培养至对数生长期的突变株和野生株做为种子液分别接种于含400mL BGll液体培养基的鼓泡柱式光反应器中，初始接种量O. 8g/L，突变株和野生株分别设三个平行。在上述培养条件下培养，分别取出培养第O天、第2天、第4天、第6 天、第8天、第10天、第12天、第16天和第18天藻液10mL，使用清洗好的醋酸纤维素膜( L 径O. 45 μ m)抽滤，105°C烘至恒重后称重，测定干重即得生物量，绘制生长曲线(参见图2)。
由图2显示突变株HP-I生物量显著高于野生型藻株，在培养的第18天可以提高 19%。
实施例3 :微拟球藻突变株和和野生型藻株色素含量的测定分别取2mL上述实施例中分别培养第O天、第2天、第4天、第6天、第8天、第10天、第12天、第16天和第18天的突变体藻液及野生型藻液，分别以5000rpm离心IOmin后，加入2mL甲醇， 60 °C水浴Ih后，再以5000rpm离心IOmin,最后利用分光光度计在665、666、470nm下分别测定其吸光度，根据计算公式C叶绿素a μ g/mg= [13. 43A665v/ (IV) ] /D和C类_萝卜素μ g/ mg=[(1000A470-44. 76A666/221) v/(IV) ]/D分别测定其叶绿素a和类胡萝卜素含量，公式中A665、A470、A666分别为665、666和470nm下的吸光度值，ν为甲醇体积，I比色杯光程， V为样品体积。
由图3显示突变株HP-I较野生型藻株叶绿素a含量在培养第四天提高45 %，类胡罗卜素含量提高47%。
实施例4 :微拟球藻突变株和野生型藻株产油期生长曲线、油脂含量和油脂产率测定
采用两步法诱导产油，将处于对数生长末期野生型和突变体藻液，分别低速离心后(3000rpm，10min)，沉淀接种于无氮海水的BGll培养基中(BG11培养基无NaNO3)在 25±1°C，光强300ymol/m2 *s，连续光照培养，通气量为O. 25vvm，通入气体为纯CO2和自然空气混合，使培养液中CO2的浓度为2% (体积比)，并使用O. 22 μ m滤膜过滤除菌。在上述培养条件下高光缺氮诱导产油，在培养的第O天，第3天，第5天，第7天，第9天，第11 天分别取5mL藻液，使用清洗好的醋酸纤维素膜(孔径O. 45 μ m)抽滤，105°C烘至恒重后称重，测定产油期生物量(参见图4)。
采用重量法测定油脂含量，以氯仿-甲醇(甲醇氯仿=2 l(v/v))共溶剂提取。分别取上述高光缺氮诱导产油中的第O天，第3天，第5天，第7天，第9天，第11天的野生型藻株和突变藻株各50mg的藻粉，藻粉通过高速离心(8000rpm，lOmin)获得藻体后经冷冻真空干燥器冻干24h后得到。分别向突变株和野生株冻干藻粉中加入7. 5mL甲醇/氯仿甲醇 氯仿=2 1 (v/v)混合溶液,于37°C下振荡提取24h后，6000rpm离心IOmin后分别收集上层有机相。两藻株残渣再用7. 5mL甲醇/氯仿混合溶剂重复提取一次。合并两次提取的有机相，分别加入5mL I % NaCl和氯仿(I % NaCl和氯仿按体积比I: I混合)，混匀后分别离心收集下层氯仿相，氮吹仪下吹干，真空干燥器烘干后分别测定其油脂重量，与干重相比计算野生株和突变株总脂含量。利用生物量和总脂含量相乘除以培养天数计算油脂产率。
由图4和5结果显示该突变株HP-I油脂积累末期生物量较野生株提高33 %，含油量与野生株相比未显著性提高，由于其生物量大，导致油脂产率提高28%，由O. Zlgr1CT1提高为 O.
实施例5 :微拟球藻突变株和野生型藻株油脂脂肪酸组成测定
分别取上述约10 μ g溶于氯仿的高光缺氮诱导第五天的野生型藻株和突变藻株总脂，将两种藻株的总脂分别经过甲醇甲酯化(甲醇甲酯化条件2%硫酸，85°C，2. 5h)和正己烷萃取后，分别利用Agilent气相色谱-四级杆质谱联用仪对其脂肪酸组成进行分析。 GC条件HP-5MS石英毛细管柱(30. OOmmXO. 25mmXO. 25 μ m);柱温120 240°C，程序升温10°C /min ;柱流量I. OmL/min ;进样口温度250°C ;柱前压IOOkPa ;进样量I μ L ;分流比 10 I;载气为高纯氮气。MS条件电离方式EI ;电子能量70eV;传输线温度250°C ;离子源温度230°C ;四极杆温度150°C ;质量范围35 450m/z ;采用wiley7n. I标准谱库，计算机检索定性(参见表I及图6、7)。
实施例6 :微拟球藻突变株和野生型藻株油脂成分分析
分别取上述约10 μ g溶于氯仿的高光缺氮诱导第五天的野生型藻株和突变藻株总脂，利用棒状薄层层析对其油脂成分进行分析，展开剂I体系为苯氯仿无水乙酸的体积比为150 60 :2，展开至7cm,展开剂2体系为苯己烧的体积比为I :1，展开至IOcm0 完毕后取出点样板，待溶剂挥发后，置于氢火焰检测器，氢气流量为O. 16L/min，空气流量为 0.2L/min。使用外标法分别对两种藻株的油脂成分进行定量，标准样品为甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、固醇酯、固醇和脂肪酸甲酯(参见表2和图8、9)。
表2突变株(HP-I)和野生型(WT)微拟球藻油脂脂肪酸组成和油脂成分分析
权利要求
1.一种微拟球藻突变株，其特征在于微拟球藻突变株分类学命名Nannochloropsissp. OZ-I HP-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期2012年5月14日，保藏号为=CGMCC No. 6140。
2.按权利要求I所述微拟球藻突变株的诱变选育方法，其特征在于以野生型微拟球藻(Nannochloropsis sp. OZ-I)作为出发藻株经光照培养至对数生长期,再利用重离子加速器对处于对数生长期的藻株进行诱变，获得微拟球藻Nannochloropsis sp. OZ-I HP-I突变株。
3.按权利要求I所述微拟球藻突变株诱变选育方法，其特征在于利用重离子加速器对生长至对数生长期的微拟球藻进行不同剂量的碳重离子的辐射，将致死率在50%以上的辐射剂量下的藻株分别进行活化，再逐级传代培养，选取在逐级传代培养中Fv/Fm和OD75tl值稳定提高的生长迅速突变藻株，而后转接于鼓泡柱式光反应器中传代培养筛选得到微拟球藻突变株 Nannochloropsis sp. OZ-I HP-1。
4.按权利要求I所述的微拟球藻的应用，其特征在于所述微拟球藻Nannochloropsissp. OZ-I HP-I用于油脂、生物柴油、脂肪酸、叶绿素a、类胡萝卜素和或生物质生产。
全文摘要
本发明涉及微生物工程领域，具体的说是一种微拟球藻突变株及其重离子诱变选育方法。微拟球藻突变株分类学命名Nannochloropsis sp.OZ-1HP-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期2012年5月14日，保藏号为CGMCC No.6140。本发明突变藻株生物量积累在培养末期较野生株提高19％，叶绿素a含量在培养第四天较野生株提高45％，类胡罗卜素含量较野生株提高47％。该突变株油脂积累末期生物量较野生株提高33％，油脂产率提高28％，突变株脂肪酸组成与野生型藻株相比未发生显著性变化，突变株油脂成分分析显示TAG含量比野生型提高14％。该突变株生长速度快、油脂产率高、TAG含量高，可以为微拟球藻生物燃料产业化生产提供优质藻种。
文档编号C12P17/18GK102978115SQ20121035623
公开日2013年3月20日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者马玉彬, 张东远, 周功克, 王芝瑶, 周翠燕 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所, 波音(中国)投资有限公司