专利名称：一株耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物及其筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种用于环境污染修复的微生物，尤其涉及一株耐盐耐碱的Cr(VI) 还原菌株及其筛选方法。
背景技术：
据初步调查，目前我国铬渣总堆存量超过600万吨，分散于20多个省市的80余处。经过几十年的雨水冲淋、渗透，铬渣堆存场地已被严重污染，据有关专家估算，已被铬渣严重污染、必须治理的土壤数量估计在400万吨至1000万吨之间，由此导致的水体污染亦不容忽视。《中华人民共和国国民经济和社会发展第十一个五年规划纲要》已将铬渣污染治理列为环境治理重点工程，明确要求对堆存铬渣及受污染土壤进行综合治理，实现所有堆存铬渣无害化处置。因此，开展铬污染水体与土壤的修复治理工作已刻不容缓。
铬在环境中主要以Cr(VI)和Cr(III)的形式存在。与Cr(III)相比，Cr(VI)具有致畸、致癌、致突变等高毒性。而Cr(III)则易与环境中的有机、无机化合物相结合，形成复杂稳定的难溶化合物，因而迁移性小，生物有效性低，其毒性仅为Cr (VI)的千分之一。因此，将高毒性的Cr(VI)还原为低毒性的Cr(III)是Cr (VI)污染物修复的基本思路。
与物理隔离法、化学还原沉淀法、离子交换法、反渗透法等传统的物理化学方法相比，生物修复因其具有低成本、操作简单、无二次污染等优势而受到广泛的关注与重视。近年来，已有不同种属的铬还原微生物得以分离和报道，如无色杆菌Achromobacter sp. Ch_l、微杆菌· Microbacterium sp. MP30、苍白杆菌 Ochrobactrum sp.、金黄节杆菌 Arthrobater aurescens sp.、芽孢杆菌Bacillus sp.等。但迄今尚未有关于解糖假苍白杆菌Pseudochrobactrum saccharolyticum还原Cr (VI)的报道。同时，已报道的微生物中，大多数菌株的Cr(VI)还原过程在厌氧条件下进行，且耐盐能力低、耐碱能力有限，因而难以满足实际污染土壤和水体中高盐分含量、碱性环境的实际修复要求。
因此，本领域迫切需要筛选获得新的、能够满足实际污染水体与土壤修复要求的微生物资源，从而为铬污染生物修复的实施提供技术支撑。发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一株耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物及其筛选方法。该菌株对铬污染物具有高耐受能力，且能够在高盐度的碱性环境中将高毒性的Cr (VI)还原为低毒性的Cr (III)。本发明为铬污染的生物修复提供了新的微生物资源。
本发明的目的通过以下技术方案来实现一株耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物，它的16S rRNA基因具有SEQ ID No.1所示的基因序列；该耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为CGMCC No. 5873。
上述耐盐耐碱的Cr (VI)还原微生物通过以下步骤筛选获得
(I)富集称取5g铬污染土壤于50mL已灭菌的液体LB培养基中(氯化钠5g I71, 酵母提取物5g L—1，胰蛋白胨IOg L-1，pH=7. O 7. 5)，28°C，160rpm振荡培养；
(2)驯化当土悬液由原来的黄色变成灰绿色时，取上悬液接种至含Cr(VI)的液体LB培养基中，28°C，160rpm振荡培养，当培养液再次由黄色变成灰绿色时，将其接种至另一含有更高Cr(VI)浓度的液体培养基中，以此逐步提高培养基中的Cr (VI)浓度，从而驯化目的菌株；驯化过程中所用的Cr (VI)以过滤灭菌后的1(2&207母液形式进行添加；驯化所用的 Cr(VI)浓度梯度依次为 5mM、8mM、10mM、12mM、15mM ；
(3)分离当驯化浓度为15mM Cr(VI)时，经过5d的培养，培养液变成灰绿色，以该菌液作为分离母液，取ImL按梯度稀释成lO'lO'lO'lO'lO'lO-7 ;分别从10_5、10_6、 Kr7的稀释液中吸取50uL涂布于含7mM Cr (VI)的固体培养基中，28°C倒置培养2 3d ;
(4)纯化分别挑取不同形态的单菌落，于含有7mM Cr(VI)的固体培养基中进行划线接种；28°C倒置培养2 3d后，再次挑取单菌落划线于含铬培养基中；如此纯化3 4 代，获得耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物。
本发明的有益效果是本发明筛选获得一种新的耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物Pseudochrobactrum saccharolyticum LY10,该菌株为革兰氏阴性菌，杆状0. 5 1. O μ mX1. O 2. 5 μ m,在好氧条件下可将重铬酸钾和铬酸钾中的高毒性Cr (VI)还原为低毒性的Cr(III);该菌具有一定的耐盐性和耐碱性；在培养基氯化钠浓度为2 20g L_1,pH 7. O 10. 7的范围内均可以很好地进行生长和Cr(VI)还原。该·菌株的Cr(VI)还原效率高，可用于制备水体或土壤中铬污染的生物修复材料，应用于去除水中和土壤中的Cr (VI) 污染物。
Pseudochrobactrum saccharolyticum LYlO 菌种已于 2012 年 3 月 12 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo. 5873 ;分类命名为解糖假苍白杆菌LY10,拉丁文学名为Pseudochrobactrum saccharolyticum LYlO0 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为北京市朝阳区北辰西路I号院 3号，邮编为100101。
图1是本发明菌株的系统发育树；
图2是本发明菌株在不同pH条件下的生长情况图3是本发明菌株在不同pH条件下的Cr(VI)还原情况柱状图4是本发明菌株在不同盐度下的Cr(VI)还原情况柱状图。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。
实施例1 :本发明菌株的筛选与分离
1、富集采集杭州原红星化工厂铬渣堆场污染土壤，称取5g土壤于50mL已灭菌的液体LB培养基中(氯化钠5g L—1，酵母提取物5g ΙΛ胰蛋白胨IOglApH= . O 7. 5)，28°C， 160rpm振荡培养。
2、驯化当土悬液由原来的黄色(Cr(VI)呈黄色)变成灰绿色(Cr(III)呈绿色)时，取上悬液接种至新配置的含Cr (VI)的液体LB培养基中，28°C，160rpm振荡培养，当培养液再次由黄色变成灰绿色时，将其接种至含有更高Cr(VI)浓度的液体培养基中，以此逐步提高培养基中的Cr(VI)浓度，从而驯化目的菌株。驯化过程中所用的Cr(VI)以过滤灭菌后的K2Cr2O7母液形式进行添加。驯化所用的Cr (VI)浓度梯度依次为5mM、8mM、IOmM, 12mM、 15mM。
3、分离当驯化浓度为15mM Cr(VI)时，经过5d的培养，培养液变成灰绿色，以该菌液作为分离母液，取ImL按梯度稀释成10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7。分别从10_5、10_6、 Kr7的稀释液中吸取50uL涂布于含7mM Cr (VI)的固体培养基中，28°C倒置培养2 3d。
4、纯化分别挑取不同形态的单菌落，于含有7mM Cr(VI)的固体培养基中进行划线接种。28°C倒置培养2 3d后，再次挑取单菌落划线于含铬培养基中。如此纯化3 4 代，获得具有高浓度Cr (VI)耐受能力的菌株，命名为LY10。
实施例2 :菌株的生理生化及16S分子鉴定
1、生理生化特征
菌株LYlO在不含铬的LB固体平板上生长24h后，菌落呈不透明的圆形，表面光滑湿润，呈乳白色。将菌株LYlO划线至含7mM Cr(VI)的固体培养基中，培养72h后，菌落因富集了一定量的铬而呈淡黄色。该菌株为革兰氏阴性菌，杆状，无鞭毛，大小为O. 5 1.0X1. O 2. 5um。该菌株的检测鉴定委托中国科学院微生物研究所进行(2011微检字第 243号)。细菌的氧化酶试验结果为阳性，接触酶试验结果为阳性。其BIOLOG鉴定结果如表
表1. LYlO对BIOLOG GN板上95种碳底物的利用能力
权利要求
1.一株耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物，其特征在于，它的16S rRNA基因具有SEQ IDNo.1所示的基因序列；该耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为=CGMCC No. 5873。
2.—种权利要求1所述耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物的筛选方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 (O富集称取5g铬污染土壤于50mL已灭菌的液体LB培养基中(氯化钠5g I71,酵母提取物5g L—1，胰蛋白胨IOg 171，？!1=7.0 7.5)，281，160印111振荡培养； (2)驯化当土悬液由原来的黄色变成灰绿色时，取上悬液接种至含Cr(VI)的液体LB培养基中，28°C，160rpm振荡培养，当培养液再次由黄色变成灰绿色时，将其接种至另一含有更高Cr (VI)浓度的液体培养基中，以此逐步提高培养基中的Cr (VI)浓度，从而驯化目的菌株；驯化过程中所用的Cr(VI)以过滤灭菌后的K2Cr2O7母液形式进行添加；驯化所用的Cr (VI)浓度梯度依次为 5mM、8mM、10mM、12mM、15mM ； (3)分离当驯化浓度为15mMCr(VI)时，经过5d的培养，培养液变成灰绿色，以该菌液作为分离母液，取ImL按梯度稀释成lO'lO'lO'lO'lO'lO-7 ;分别从10_5、10_6、10_7的稀释液中吸取50uL涂布于含7mM Cr (VI)的固体培养基中，28°C倒置培养2 3d ; (4)纯化分别挑取不同形态的单菌落，于含有7mMCr(VI)的固体培养基中进行划线接种；28°C倒置培养2 3d后，再次挑取单菌落划线于含铬培养基中；如此纯化3 4代，获得耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物。
全文摘要
本发明公开了一株耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物及其筛选方法，该菌株为杆状革兰氏阴性菌，耐盐耐碱，对铬污染物耐受浓度高，能在好氧条件下将高毒性Cr(VI)还原为低毒性的Cr(III)；当pH为8.5，NaCl浓度为20gL-1时，菌株经114h培养后，可将Cr(VI)浓度从130mgL-1降至9.1mgL-1，还原率高达95.2%；本发明所提供的菌株具有高的Cr(VI)还原效率，可作为铬污染水体与土壤的生物修复材料，用于去除水中和土壤中的Cr(VI)污染物。
文档编号C12N1/20GK103013850SQ201210356338
公开日2013年4月3日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者龙冬艳, 蔡宽, 刘磊 申请人:杭州高博环保科技有限公司