通过淀粉和木聚糖的降解酶的表达开发能进行淀粉和木聚糖的醇发酵的耐热酵母多形汉...的制作方法

专利名称：：通过淀粉和木聚糖的降解酶的表达开发能进行淀粉和木聚糖的醇发酵的耐热酵母多形汉...的制作方法
技术领域：
：本申请涉及通过发酵进行纤维素乙醇生产的领域，具体地涉及淀粉和木聚糖碳源的发酵，更具体地涉及用于通过淀粉和木聚糖发酵进行乙醇生产的重组多形汉逊酵母(H.poIymorpha)菌株,并且还更具体地涉及分泌重组的α淀粉酶和葡糖淀粉酶、和/或木糖水解酶和木糖苷酶以通过在含淀粉和木聚糖的培养基上进行发酵实现乙醇生产的多形汉逊酵母菌株。前言由可再生原料如植物生物质进行燃料乙醇生产具有重要的经济学和生态学意义。植物木质纤维素具有作为目前生物乙醇生产中被广泛应用的蔗糖和基于淀粉的多糖的替代性原料的潜力。木质纤维素和其他植物来源的多糖代表了一种可通过二氧化碳的生物转化进行再生产的可再生的持续性能量来源。由植物生产的生物燃料胜过化石燃料的许多受追捧的环境益处之一是温室气体的显著减少[6，24]。目前世界上生产的绝大多数的乙醇来源于淀粉或蔗糖。许多农作物中富含淀粉和糖类，但是当乙醇作为一种液体交通运输燃料而扩大生产时，需要不与食物和动物饲料的使用直接竞争的原料。这些原料包括来自农业和林业上的木质纤维素副产品残余物[14]。木质纤维素是来源于木材和农业残余物的植物物质的通用术语。其主要包含木质素和纤维素以及大量的半纤维素，具有较少量的结构蛋白和有机溶剂可萃取的物质[14]。半纤维素是由作为骨架的木聚糖组成并且存在于植物细胞壁中的一种取代的多糖[11]。木质纤维素和淀粉加工成乙醇包括四个主要的单元操作预处理，水解，发酵和产物分离/纯化。淀粉的生物转化包括酶水解和所得的葡萄糖发酵成乙醇，伴随动物饲料副产品的产生。由于木质纤维素具有较复杂的结构，并且在不同植物(谷类植物、软木材、硬木材等)和同一植物(茎、壳、杆、穗轴、稻杆、叶、核等)中的组成具有很大不同，因此木质纤维素的水解较为困难[14]。木糖是在具有C5L-阿拉伯糖和其他C6糖类如葡萄糖、甘露糖、半乳糖作为主要己糖的半纤维素成分水解得到的主要的戊糖[11]。由于木质纤维素的工艺涉及许多步骤，且需要高能量投入，因此，木质纤维素作为原料的商业生机需要开发更直接且廉价的技术。糖类聚合物的直接微生物转化(DMF，直接微生物发酵)是一种可使由木质纤维素生产生物乙醇的经济效益提高的选择。开发这项技术的关键先决条件之一是获得能够在高温下直接使淀粉和木聚糖发酵成乙醇的微生物。目前DMF所涉及的水解酶的最佳温度约为50°C，而目前由木质纤维素糖类和淀粉糖类进行生物乙醇生产所用的绝大部分微生物为嗜温生物，其最佳生长和发酵温度在28°C到40°C之间[6]。本实验室的最近研究显示耐热的甲基营养型酵母多形汉逊酵母能够在高温(37-480C)下使D-木糖和D-葡萄糖发酵为乙醇。因为多形汉逊酵母生长和发酵的最佳温度较高，所以它是用于DMF技术的深入开发的一个优秀候选者[3，26]。由于多形汉逊酵母不能利用淀粉和木聚糖作为碳源和能量来源，所以异源木聚糖降解酶基因和淀粉降解酶基因在这种酵母中的克隆和过表达是必需的。β-1，4木聚糖是存在于植物细胞壁的几乎所有部分中的异质性多糖。β-1,4-连接的木糖单体形成主链，主链上连接有一些取代基[30]。木聚糖主链的水解由β_1，4木聚糖内切酶(1，4-β-D-木聚糖的木聚糖水解酶，EC3.2.1.8)和β-D-木糖苷酶(1，4-β-木聚糖的木糖水解酶，EC3.2.1.37)催化。β-木聚糖内切酶作用于木聚糖和木寡糖，主要产生木寡糖的混合物。β-D-木糖苷酶将木寡糖水解为D-木糖[19]。真菌木霉属(Trichoderma)和曲霉属(Aspergillus)分泌大量有效的木聚糖降解酶。里氏木霉(Trichodermareesei)是已知具有纤维素水解活性和木聚糖水解活性的一种丝状嗜温性真菌[3]。由这种真菌分泌的两种主要可诱导型木聚糖内切酶为Xynl和Xyn2。Xyn2占木聚糖上培养的里氏木霉的总木聚糖水解活性的50%以上。曲霉属的成员也是纤维素水解酶和木聚糖水解酶的有效生产者。编码804个氨基酸的β-木糖苷酶的黑曲霉(A.niger)的xlnD基因在酵母中被成功表达[19]。淀粉由两种高分子量成分组成直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉为较少的组分(20-30%)，是由α-1，4-连接的葡萄糖残基和一些α-1,6支化点形成的一种直链多糖；而支链淀粉代表淀粉中的较多的成分(70-80%)，且高度分支[4]。淀粉由两种分泌的淀粉酶降解α-淀粉酶和葡糖淀粉酶[25]。α-淀粉酶(1，4_a-D-葡聚糖的葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)催化淀粉和相似底物的α-1,4-葡萄糖苷键的淀粉内部裂解，释放麦芽糖、寡糖和极限糊精。葡糖淀粉酶(1，4-a-D-葡聚糖葡萄糖水解酶，EC3.2.1.3)水解葡萄寡糖(glucooligosaccharide)和麦芽糖为D-葡萄糖。酵母西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)生产分解淀粉的酶类,并使淀粉高效地发酵成乙醇[34]。由这种酵母分泌的α-淀粉酶是由SWA2基因编码。GAMl基因编码分泌性葡糖淀粉酶。一些从谷物颗粒如玉米的加工中得到的农业木质纤维素残余物(如玉米纤维壳)含有大量的淀粉。因此建立能够将淀粉和木质纤维素直接积极转化成乙醇的微生物菌株具有重大的经济意义。概述本文描述的是能够直接使淀粉和木聚糖进行乙醇发酵的分解淀粉和木聚糖的多形汉逊酵母菌株。我们在此描述了通过将基因西方许旺酵母SWA2和GAM1，里氏木霉ΧΥΝ2和黑曲霉xlnD成功插入该酵母的染色体中并表达它们而构建菌株。同时，过表达丙酮酸脱羧酶(roc)的菌株经过基因工程改造而具有这些基因中的一个或多个。在每种情况中菌株都能够单独在含可溶性淀粉或可溶性木聚糖的培养基上生长，并且能够以不同水平使可溶性淀粉或可溶性木聚糖发酵为乙醇。同时过表达roc的菌株给出比仅过表达SWA2和GAMl基因的菌株更高的乙醇滴度。本发明提供一种多形汉逊酵母菌株，所述多形汉逊酵母菌株包含编码α-淀粉酶的至少一种基因和编码葡糖淀粉酶的至少一种基因，所述基因与在所述多形汉逊酵母菌株中表达所述基因的至少一种启动子可操作地连接，并且所述酶以充足的量自所述多形汉逊酵母菌株输出到培养基中，从而允许所述多形汉逊酵母菌株在只含可溶性淀粉作为碳源的培养基中生长。在所述多形汉逊酵母菌株中，编码所述α-淀粉酶和葡糖淀粉酶中至少其一的基因可以被整合入所述多形汉逊酵母的染色体中。在所述多形汉逊酵母菌株中，编码所述α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的所述基因中的每一种均可以被整合入所述多形汉逊酵母的染色体中。在所述多形汉逊酵母菌株中，编码所述α-淀粉酶或葡糖淀粉酶的所述基因中的至少一种可以是从西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)菌株获得。在所述多形汉逊酵母菌株中，编码α-淀粉酶或所述葡糖淀粉酶的所述至少一种基因还可以包括与所述基因可操作地连接以终止所表达的基因的转录的终止子。在所述多形汉逊酵母菌株中，所述启动子可以包括从多形汉逊酵母获得的HpGAP启动子。在所述多形汉逊酵母菌株中，所述α-淀粉酶基因和葡糖淀粉酶的基因中的每一种都可以与从多形汉逊酵母获得的HpGAP启动子可操作地连接。所述多形汉逊酵母菌株还可以包括编码丙酮酸脱羧酶的基因，所述编码丙酮酸脱羧酶的基因与在所述多形汉逊酵母菌株中表达所述丙酮酸脱羧酶的至少一种启动子可操作地连接。本发明还提供一种制造乙醇的方法，所述方法包括使多形汉逊酵母菌株在促使所述多形汉逊酵母制造乙醇的条件下生长在含可溶性淀粉的培养基中。本发明还提供一种多形汉逊酵母菌株，所述多形汉逊酵母菌株包含编码木聚糖内切酶的至少一种基因和编码木糖苷酶的至少一种基因，所述基因与在所述多形汉逊酵母菌株中表达所述基因的至少一种启动子可操作地连接，并且所述酶以充足的量自所述多形汉逊酵母菌株输出到培养基中，从而允许所述多形汉逊酵母菌株在只含可溶性木聚糖作为碳源的培养基中生长。在所述多形汉逊酵母菌株中，编码所述木聚糖内切酶和木糖苷酶中至少其一的基因可以被整合入所述多形汉逊酵母的染色体中。所述多形汉逊酵母菌株中，编码所述木聚糖内切酶和木糖苷酶的所述基因中的每一种均被整合入所述多形汉逊酵母的染色体中。在所述多形汉逊酵母菌株中，编码所述木聚糖内切酶或木糖苷酶的所述基因中的至少一种可以是从选自由黑曲霉(Aspergillusniger)和里氏木霉(Trichodermareseei)所组成的组的菌株获得。在所述多形汉逊酵母菌株中，编码所述木聚糖内切酶或所述木糖苷酶的所述至少一种基因还可以包括与所述基因可操作地连接以终止所表达的基因的转录的终止子。在所述多形汉逊酵母菌株中，所述启动子可以包括从多形汉逊酵母获得的HpGAP启动子。所述多形汉逊酵母菌株还可以包括编码丙酮酸脱羧酶的基因，所述编码丙酮酸脱羧酶的基因与在所述多形汉逊酵母菌株中表达所述丙酮酸脱羧酶的至少一种启动子可操作地连接。本发明还提供一种制造乙醇的方法，所述方法包括使多形汉逊酵母菌株在促使所述多形汉逊酵母制造乙醇的条件下生长在含可溶性木聚糖的培养基中。本发明还提供一种多形汉逊酵母菌株，所述多形汉逊酵母菌株包含编码α-淀粉酶的至少一种基因、编码葡糖淀粉酶的至少一种基因、编码木聚糖内切酶的至少一种基因和编码木糖苷酶的至少一种基因，每个基因都与在所述多形汉逊酵母菌株中表达所述基因的至少一种启动子可操作地连接，并且所述酶以充足的量自所述多形汉逊酵母菌株中输出到培养基中，从而允许所述多形汉逊酵母菌株在只含可溶性淀粉或可溶性木聚糖作为碳源、或含两者的单独组合作为碳源的培养基中生长。所述多形汉逊酵母菌株还可以包括编码丙酮酸脱羧酶的基因，所述编码丙酮酸脱羧酶的基因与在所述多形汉逊酵母菌株中表达所述丙酮酸脱羧酶的至少一种启动子可操作地连接。本发明还提供一种制造乙醇的方法，所述方法包括使多形汉逊酵母菌株在促使所述多形汉逊酵母制造乙醇的条件下生长在含可溶性淀粉的培养基中。本发明还提供一种重组核酸，所述重组核酸包含编码α-淀粉酶的基因和编码葡糖淀粉酶的基因中的至少一种，所述基因与从多形汉逊酵母获得的HpGAP启动子可操作地连接。所述重组核酸可以满足以下至少一项a.所述α-淀粉酶由根据SEQID.NOI的核苷酸序列编码；b.所述α-淀粉酶具有根据SEQID.NO2的氨基酸序列；c.所述葡糖淀粉酶由根据SEQID.NO3的核苷酸序列编码；以及d.所述葡糖淀粉酶具有根据SEQID.NO4的氨基酸序列。本发明还提供一种重组核酸，所述重组核酸包含编码木聚糖内切酶的基因和编码β-木糖苷酶的基因中的至少一种，所述基因与从多形汉逊酵母获得的HpGAP启动子可操作地连接。所述重组核酸可以满足以下至少一项e.所述β-木糖苷酶由根据SEQID.NO5的核苷酸序列编码；f.所述β-木糖苷酶具有根据SEQID.NO6的氨基酸序列；g.所述木聚糖内切酶由根据SEQID.NO7的核苷酸序列编码；以及h.所述木聚糖内切酶具有根据SEQID.NO8的氨基酸序列。在所述重组核酸中，编码所述木糖苷酶和木聚糖内切酶的所述基因还与内源性连接于所述基因的终止子核苷酸序列可操作地连接。在所述重组核酸中，内源性连接于所述基因的所述终止子核苷酸序列是根据SEQIDΝ0:9和SEQIDNO10中的至少一项。图1.质粒pGAMl(6.63kb)、pGAMlSWA2(9.lkb)、pORl(10.8kb)和pORll(IOkb)的线性图谱。灰色框表示的是含LEU2基因的酿酒酵母(S.cerevisiae)基因组片段，绿色框表示的是HpGAP启动子，HpAOX终止子橙色框，蓝色框表示的是GAMl基因的0RF，SWA2基因的ORF:红色框，氨基糖苷3-磷酸转移酶基因(APH):黑色框。限制性位点H,HindIII；RV,EcoRV；K,KpnI；RI,EcoRI；SI,SalI；BI,BamHI；Bg,BglII；Sc,SacI;P，PstI;Sm，SmaI。图2.质粒pK08-GAPpr(7.6kb)、pK08-GAPpr—SWA2(9.lkb)和pK08-GAPpr_XYN2(8.27kb)的线性图谱。灰色框表示的是含LEU2基因的酿酒酵母基因组片段，黄色框表示的是HpGAP启动子，HpAOX终止子蓝色框，SWA2基因的ORF:红色框，TrXYN2基因的ORF橙色框。限制性位点H,HindIII;Nd，NdeI；K,KpnI；RI,EcoRI；SI,SalI;BI，BamHI；Bg,BglII；Sc,SacI；P,PstI；Nt,NotI。图3.质粒pXYN2(4·24kb)、pXYN2xlnD(7.6lkb)和p0R2(9.57kb)的线性图谱。灰色框，含LEU2基因的酿酒酵母基因组片段；绿色框，HpGAP启动子；橙色框，HpAOX终止子；蓝色框，含黑曲霉xlnD基因ORF的片段；红色框，含里氏木霉XYN2基因的ORF的片段。限制性位点H,HindIII；RV,EcoRV；K,KpnI；RI,EcoRI；SI,SalI；B,BamHI；Bg,BglII；Sc,SacI；P,PstI；Sm,SmaI；Xb,XbaI；Sp,SphI。图4.含2%可溶性淀粉作为唯一碳源的YNB基本培养基中多形汉逊酵母重组体2Eth_leul-l/p0Rl#14’(A)和#7(B)在不同培养基pH下的乙醇生产量Ι-pH未校正；2-pH6；3-ρΗ5·5;48°C，135rpm。图5.含3%或9%桦木木聚糖的YNB基本培养基中多形汉逊酵母重组菌株4952Eth-leul-l/p0R2在不同pH的培养基(A)和通气条件(B)下的乙醇生产量。48°C。图6.通过PCR对多形汉逊酵母转化体的基因组DNA中HpGAP启动子下的GAM1，SWA2,XYN2和xlnD基因进行证实。泳道##2，3:利用K43，Ko51引物对分析通过用质粒P0R2转化获得的转化体，以显示人工构建体与HpGAP启动子和HpAOX终止子融合的里氏木霉ΧΥΝ20RF。泳道##4，5:利用Κ43，Κο47引物对分析由质粒p0R2获得的转化体，以显示构建体与HpGAP启动子融合的黑曲霉xlnD。泳道##6，7:利用K43，Ko49引物对分析由质粒pORl和pORll获得的转化体，以显示构建体与HpGAPl启动子融合的西方许旺酵母的GAMl0泳道##8，9:利用K43，Ko50引物对分析由质粒pORl和pORll获得的转化体，以显示构建体与HpGAPl启动子和HpAOX终止子融合的西方许旺酵母SWA2的ORF。泳道##1,10:DNA标准参照物。图7.表达由HpGAPl启动子驱动的西方许旺酵母SWA2基因和GAMl基因的多形汉逊酵母重组体形成的透明斑(halo)。由于SWA2基因和GAMl基因的天然启动子的抑制，对照西方许旺酵母菌株在补充了葡萄糖的培养基上未产生斑(B)。第二个对照中的2Eth_leul-l菌株不能在以淀粉作为唯一碳源的培养基上生长(A)。图8.含2%可溶性淀粉的YNB基本培养基中多形汉逊酵母重组菌株2Eth_leul_l/P0R1##7和14’的乙醇生产量，48°C，135rpm。图9.重组菌株#7，14(4952EttTleul-l/p0Rl)，I，，2，，4，，2g(4952EttTleul-l/pORll)和受体菌株4952Eth_leul-l的培养基的SDS-PAGE分析。用8%的分离胶进行电泳，通过考马斯染色和银染显示出蛋白条带。A，葡糖淀粉酶的显示；B，α-淀粉酶的显示；α-淀粉酶的弥散条带可能是糖基化的程度不同所造成。L，蛋白分子量标准参照物。图10.多形汉逊酵母重组体##7，14(4952EttTleul-l/p0Rl)和多拷贝整合体##1，，2，，3，，4，和2g(4952Eth_leul_l/p0Rll)形成的透明斑。图11.斑点印迹Southern杂交的结果显示了多形汉逊酵母转化体中编码淀粉降解酶的基因的拷贝数。利用HpGAP启动子作为探针。菌株l_wt(l拷贝标准)；2，3-##7，14(约3-4拷贝)；4，5，7-分别为##1’，2’，4’，(约6-8拷贝);6_#3，(3拷贝)。图12.含3-4个淀粉酶基因拷贝的重组酵母菌株##7，14，6(4952Eth_leul-l/pORl)和含6-8个基因拷贝的##1’，2’，4’和2g(4952Eth_leul_l/p0Rll)的培养基中的α-淀粉酶(A)和葡糖淀粉酶(B)的比活性。图13.多形汉逊酵母重组体2Eth-leul_l/p0Rl的乙醇生产量(#1:菌株##7和14的平均乙醇生产量)和2Etrieul-l/pORll(#2:菌株##1’，2’，4’，2g的平均乙醇生产量)的乙醇生产量。菌株在含3%可溶性淀粉的YNB基本培养基中进行培养，pH5.5，48°C，135rpm。图14.含3%可溶性淀粉的基本培养基中，过表达淀粉分解酶基因和roCl基因的多形汉逊酵母菌株的乙醇生产量；48°C，135rpm。4’，转化体4952Eth-leul_l/p0Rll(受体菌株，对照)；6p,10,12,转化体4’/pIoxZeoloxPDClHpο图15.由多形汉逊酵母重组体#6p(4，/ploxZeoloxPDClHp)及其衍生物整合体##1，2，2-1，3，4，5，7，9，10(6p/p0Rl)形成的透明斑。图16.在47°C，限制性通气条件下，含3%可溶性淀粉的基本培养基中，过表达淀粉降解酶和Pdclp的多形汉逊酵母菌株的乙醇生产量。4’，转化体4952Eth_leul-l/p0Rll;6p，转化体4’/ploxZeoloxPDClHp;3,4,5,转化体6p/p0Rl。图17.表达木聚糖内切酶基因和木糖苷酶基因的多形汉逊酵母重组体在以木聚糖作为唯一碳源的培养基上的生长。Α，表达木聚糖内切酶基因和β-木糖苷酶基因的重组菌株(菌株##6Χ和8Χ)在以木聚糖作为唯一碳源的固体培养基上的生长。B，在含3%来自桦木的木聚糖(BI)或2%木糖(Β2)的液体基本培养基中表达木聚糖内切酶基因和木糖苷酶基因的菌株在生长期间的生物质累积，48°C，240rpm。6X，8X，转化体4952Eth_leul_l/p0R2。图18.表达黑曲霉xlnD基因和里氏木霉XYN2基因的多形汉逊酵母重组体所形成的黄斑(A)或透明斑⑶。图19.多形汉逊酵母在重组菌株4952Eth7pOR2##6X和8X的培养基中的木聚糖内切酶㈧和β_木糖苷酶⑶的比活性。图20.Α.含与SWA2基因(SEQ.1DNOI)和多形汉逊酵母AOX终止子(双下划线)可操作地连接的多形汉逊酵母GAP启动子(单下划线)的重组构建体序列。B.来自西方许旺酵母的由SWA2基因编码的α-淀粉酶的氨基酸序列(SEQ.1DΝ02)。图21.Α.含与GAMl基因(SEQ.1DNO3)和多形汉逊酵母AOX终止子(双下划线)可操作地连接的多形汉逊酵母GAP启动子(单下划线)的重组构建体序列。B.来自西方许旺酵母的由GAMl基因编码的葡糖淀粉酶(SEQ.1DNO4)的氨基酸序列。图22.Α.含与黑曲霉的xlnD基因(SEQ.1DNO5)可操作地连接的多形汉逊酵母GAP启动子(单下划线)的重组构建体序列，该xlnD基因包括内源性终止子序列(SEQ.1DNO9，双下划线)。B.由xlnD基因编码的β-木糖苷酶的氨基酸序列(SEQ.1DNO6)。图23.Α.含与里氏木霉的Xyn2基因(SEQ.1DNO7)可操作地连接的多形汉逊酵母GAP启动子(单下划线)的重组构建体序列，该Xyn2基因包含内源性终止子序列(SEQ.1DNO10，双下划线)。B.由Xyn2基因编码的β-木聚糖内切酶的氨基酸序列(SEQ.1DNO8)。方法、菌株和结果的详述菌株和培养某利用异丙基苹果酸脱氢酶缺陷的且不能在乙醇中生长的多形汉逊酵母菌株4952Eth_leul-l[14]作为受体，以分离淀粉降解重组体和木聚糖降解重组体。该菌株是NCYC495Ieul-1的衍生物[8]。在37°C或48°C使酵母菌株和转化体在YPD(O.5%酵母提取物，1%蛋白胨，2%葡萄糖)培养基或基本培养基(无氨基酸的O.67%YNB,2%葡萄糖，3%可溶性淀粉(SigmaS2630-500G)或3%来自桦木的木聚糖(FlukaX0502-100G))上生长。对于4952Eth_leul-l菌株，培养基中再加入亮氨酸(40mg/L)。在YPD上选择酵母转化体时，加入O.2mg/L的G418(遗传霉素)或150ug/ml的博莱霉素(zeocine)。利用大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株[C>80dlacZΔΜ15,recAl,endAl,gyrA96,thi_l,hsdR17(rK、m+K),supE44,relAl,deoR,Δ(lac-ZYA-argF)U169]作为宿主进行质粒扩增。按以前所报道的那样在37°C的LB培养基中培养该菌株[27]。转化的大肠杆菌细胞在含100mg/L氨苄青霉素的培养基上进行培养。DNA抟术应用标准克隆技术[27]。利用WizardsPlusSV小量制备DNA纯化系统(WizardsPlusSVMiniprepsDNAPurificationSystem,Promega,Madison,WI,USA)从大肠杆菌中分离出质粒DNA。利用Wizards基因组DNA纯化试剂盒(WizardsGenomicDNAPurificationKit,Promega,Madison,WI,USA)分离多形汉逊酵母、西方许旺酵母、里氏木霉和黑曲霉的基因组DNA。按照制造商说明书，使用限制性核酸内切酶，T4DNA连接酶和T4DNA聚合酶(Fermentas,Vilnius,Lithuania)。用0.8%的琼脂糖凝胶(FisherScientific,FairLawn,NJ,USA)在IXTAE中分离DNA片段[27]。用DNA凝胶提取试剂盒(DNAGelExtractionKit,Millipore,Bedford,MA,USA)从凝胶中分离片段。TaqDNA聚合酶和高保真混合聚合酶(HighFidelityMixPolymerase,两者均为Fermentas,Vilnius,Lithuania)分别用于分析性PCR和制备性PCR。在GeneAmpsPCRSystem9700循环变温器(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)中进行PCR。通过电穿孔转化多形汉逊酵母按以前所述进行[5]。携带西方许旺酵母的α-淀粉酶基因和葡糖淀粉酶基因的质粒的构建利用PCR将编码葡糖淀粉酶的GAMl基因的开放阅读框(ORF)和天然终止子(3.27kb)从西方许旺酵母菌株NRRLY-2470的基因组DNA中分离出来，所用引物为Ko48(CCCAAGCTTATGATTTTTCTGAAGCTG)和Ko49(GGAAGATCTTTCTTTACAAGACCAATG)。将HindIII和BglII的限制性位点加入到引物Κο48和Κο49中(下划线所示为切割位点)。PCR产物用限制性核酸内切酶HindIII和BglII消化，然后置于被HindIII和BamHI消化后的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的强组成型启动子(HpGAPpr)下。通过双重连接的方式将构建体HpGAPpr+GAMl插入到质粒pUC57的BamHI位点。所得质粒被命名为pGAMl，并且在如下构建中用作载体(图1)。利用PCR对编码α-淀粉酶的SWA2基因的0RF(2kb)进行扩增，所用引物为SWAl(TAGTCGCATATGAGATTTTCAACTGAAGG)，SWA2(CTATTGATTGCAGATGCCAGATCCC)，以西方许旺酵母NRRLY-247的基因组DNA作为模板。将限制性位点NdeI加入到引物SWAl中。用NdeI对PCR产物的5’端进行消化，而补平3’端。将产物插入到质粒pK08-GAPpr中(图2)。将SWA2基因的ORF置于HpGAPpr之下并与HpAOX终止子(HpAOXtr)融合。利用构建的质粒pK08-GAPpr_SWA2作为樽板，使用引物K43(CCGGATCCCAATTATCATTAATAATC),Ko51(CGCGGATCCAATCTTGCCTTTAAAATG)，通过PCR对含HpGAPpr+SWA2_0RF+HpA0Xtr的DNA片段进行扩增。所得PCR产物用限制性内切酶BamHI进行消化，然后插入到质粒PGAMl的BamHI位点中。将该构建质粒命名为pGAMlSWA2(图1)。将酿酒酵母LEU2基因(选择性标记物)插入到质粒PGAM1SWA2的PstI限制性位点中，并将所得构建体命名为PORl(图1)。用限制性核酸内切酶PstI消化质粒pGLG61后从中分离在酵母中赋予对G418的抗性的氨基糖苷3-磷酸转移酶基因(ΑΡΗ)。将含该基因的pGLG61[30]的Pst1-片段与携带重组基因GAM1、SWA2和细菌部分基因但是没有酿酒酵母LEU2基因的质粒pORl的PstI部分相连接。所得质粒命名为PORll(图1)。在多形汉逊酵母中表达的SWA2和GAMl重组构建体的序列分别如图20和图21所分别携带早.氏木霉与黑曲霉的木聚糖内切酶基因和P-木糖苷酶基因的质粒的构建编码β-木糖苷酶的xlnD基因来自真菌黑曲霉。利用引物Ko46(TGCTCTAGAATGGCGCACTCAATGTCTCG)和Ko47(CCCGAGCTCAGCTATGCTAGCAAGCAGC)将xlnD基因的ORF与天然终止子(2.79kb)从黑曲霉菌株NRRL3的基因组DNA中分离出来。PCR产物用限制性内切酶SacI和XbaI(这些核酸内切酶的位点位于产物两侧)进行处理，然后置于HpGAPpr之下。将构建体HpGAPpr+xlnD插入到质粒pUC57的SacI位点。所得质粒命名为pxlnD，并在以后的构建中用作载体(图3)。利用PCR对无内含子区域的编码木聚糖内切酶(O.67kb)的XYN2基因的ORF进行扩增，所用引物为TRl(TTCTCACATATGGTTGCCTTTTCCAGCCCTCATCTGCGC)，TR2(CTAGTTGCTGACACTCTGTGAGGCAGAACCACTACCACC),TRir(GAGCCGCCAAAGTTGATGGGAGCAGAAGATCCAGTCGTC)，TRif(GACGACTGGATCTTCTGCTCCCATCAACTTTGGCGGCTC)，模板为里氏木霉NRRL11460的基因组DNA。PCR产物的5’端用NdeI进行消化，而3’端被补平。将产物插入到质粒pK08-GAPpr(图2)中。将XYN2基因的ORF置于HpGAPpr之下，并用HpAOXtr终止。以所得质粒pK08_GAPpr_XYN2(图2)作为模板，利用PCR对含HpGAPpr+0RF_XYN2+HpA0Xtr的DNA片段进行扩增，引物为K43(CCGGATCCCAATTATCATTAATAATC)、Ko50(GGAAGATCTAATCTTGCCTTTAAAATG)。所得PCR产物用限制性内切酶BamHI和Bgl11进行消化后插入到质粒pxlnD的BamHI位点中。所构建质粒被命名为pxlnDXYN2(图3)。将酿酒酵母的LEU2基因插入到质粒pxlnDXYN2的PstI位点中，并且最终获得质粒命名为p0R2(图3)。在多形汉逊酵母中表达的XylD和XYL2重组构建体的序列分别如图22和图23所/Jnο筛选淀粉酶活性将用携带α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的基因的质粒转化后所获得的重组菌株接种于含2%可溶性淀粉(Sigma)作为碳源的基本培养基平板上，然后对重组菌体中的淀粉酶活性进行筛选。将平板在37°C下孵育两天，然后保持在4°C过夜。淀粉降解酶的克隆可通过菌落周围的透明斑来检测[4，16]。筛诜木聚糖内切酶活件将相应的转化体铺板于含O.2%的4-0-甲基-D-葡萄糖醛_D_木聚糖-雷玛唑亮蓝(RBB)-木聚糖(Sigma)和2%的葡萄糖作为碳源的基本培养基上，然后对转化体的木聚糖降解能力进行筛选。将平板在37°C下孵育3-4天。木聚糖内切酶将RBB-木聚糖剪切生成无色产物，在菌落的周围形成透明斑[11，20]。筛诜β_木糖苷酶活件将相应的转化体铺板于含ImM对硝基苯基-β-D-木糖苷(PNPX)和2%的葡萄糖作为碳源的基本培养基上，然后对转化体的β_木糖苷酶活性进行筛选。将平板在37°C下孵育1-3小时。通过菌落周围所产生的黄斑对酶活性进行检测[19]。α-淀粉酶和葡糖淀粉酶活性分析利用适度稀释的无细胞培养物进行酶分析。利用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法对总淀粉酶活性进行测定。用200μI的O.4Μ含2%可溶性淀粉的醋酸钠缓冲液(pH5.O)与50μI等份的培养上清在50°C下孵育30分钟。将混合物煮沸10分钟以终止反应。α-淀粉酶的I个活性单位的定义为，在同样培养条件下每分钟每毫升释放Iμmol的还原糖所需的酶的量[17，22]。在葡糖淀粉酶活性的分析中，在30°C将O.9ml煮沸淀粉溶液保持在醋酸钠缓冲液(pH5.5)中5分钟，然后加入O.1ml的样品，并将混合物孵育15分钟。然后通过煮沸反应混合物10分钟终止反应，并利用“Diagluc”分析试剂盒(UBT,Lviv,Ukraine)测定所生成的葡萄糖的浓度[9]。通过用总淀粉酶活性减去葡糖淀粉酶活性计算出α-淀粉酶的活性。葡糖淀粉酶的I个活性单位定义为每分钟从底物释放Iμmol的葡萄糖所需的酶的量[28]。g-木糖苷酶和木聚糖内切酶活性分析产酶培养物在3ml的YPD中过夜培养。通过离心收集细胞，并且上清液用于酶活性测定。用Bailey等报道的方法[I]在50°C时用1%的桦木木聚糖(Fluka)作为底物对β-1,4-木聚糖内切酶活性进行分析。用50mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.O)中的适度稀释的无细胞培养物溶液作为酶源。通过二硝基水杨酸方法测定所释放的糖的量[20]。利用浓度为5mM的生色底物PNPX对β-木糖苷酶进行定量。以上清作为β-木糖苷酶的来源进行活性测定分析。所有活性均以开特/ml来表示；一开特指每秒从桦木木聚糖或生色底物中产生Imol还原糖所需的酶的量[19]。乙醇牛产量分析对于乙醇生产量，在48°C、准好氧条件下在含3%可溶性淀粉或3%来自桦木的木聚糖的液体基本培养基中对多形汉逊酵母转化体进行4天的培养。每24小时用“Alcotest”试剂盒测定培养基中的乙醇浓度[10]。pH和通气对淀粉发酵为乙醇的效力的影响对所分离的转化体将淀粉直接发酵成乙醇的最佳条件进行研究。在48°C下，用盛有50mlYPD培养基的125ml维形烧瓶在摇床InkubatorlOOOHeidolph(Schwabach,Germany)中对酵母菌株预培养48小时,振摇设置在220rpm。将该细胞以2mg/ml的浓度接种于50ml含3%马铃薯可溶性淀粉作为唯一碳源的基本培养基中。对淀粉发酵过程中培养基的pH对乙醇生产量的影响进行研究。α-淀粉酶的最佳pH为约6.O,且葡糖淀粉酶为5.2-5.5。用pH5.5和6.O的培养基进行发酵。用IM磷酸钾缓冲液对培养基的PH进行调整。最优乙醇生产量是在pH为5.5的培养基中(图4A&B)。研究了通气对发酵效率的影响。对120rpm至180rpm的转速进行检测。当135rpm旋转时获得最高乙醇生产量。pH、通气和底物浓度对木聚糖发酵为乙醇的效力的影响对所分离的转化体将桦木木聚糖发酵成乙醇的最佳条件进行研究。在48°C下，用盛有50mlYPD培养基的125ml锥形烧瓶对酵母菌株预培养48小时，振摇设置在220rpm。然后在4000rpm下离心5分钟除去细胞，洗涤并接种(浓度为2mg/ml)于50ml含3%或9%桦木木聚糖和O.05%葡萄糖作为碳源的基本培养基中。对木聚糖发酵过程中培养基的pH对乙醇生产量的影响进行研究。用PH4.5和5.8的培养基进行发酵。IM磷酸钾缓冲液的溶液以在培养基中的O.1M终浓度对培养基的pH进行调整。培养基pH为5.8时获得乙醇最优生产量(图5A)。研究通气对发酵效率的影响。对120rpm至180rpm的转速进行检测。在120rpm的情况下获得最高乙醇生产量(图5B)。较高的木聚糖浓度(9%)导致更好的乙醇生产量(图5)。Southern印迹杂交按照产品手册利用非放射性的AmershamECL直接核酸标记和检测系统(GEHealthcare,USA)进行探针DNA的标记和杂交。定于定量的Southern斑点印记,将所制备的一系列稀释的酵母基因组DNA在O.4MNaOH中变性，点在干燥尼龙膜上(HybondN+，AmershamPharmaciaBiotech)并用合适的DNA片段进行标记,然后用上述的AmershamECL检测试剂盒进行显示。用HpGAPpr作为探针。凝月交电泳用Laemmli的方法进行SDS_PAGE[19]。用银染法和考马斯亮蓝染色法使无细胞提取物中的浓缩蛋白显示。电泳凝胶和浓缩胶的浓度分别为12%和5%的聚丙烯酰胺。将20μI的Laemmli溶液加入到20μI的样品中，然后取35μI的混合物注入到电泳凝胶中。MS多形汉狲酵母中西方许旺酵母的SWA2和GAMl某闵的表汰将多形汉逊酵母菌株4952Eth_leul_l作为受体，利用被SphI线性化的质粒PORl(质粒图谱如图1所示)进行转化。转化后细胞铺板于补充了2%葡萄糖和1%可溶性淀粉的基本培养基上。在约140个转化体中挑选出了形成最大淀粉降解透明斑的14个转化体。通过PCR利用相应引物显示这些转化体中在HpGAPpr之下的SWA2基因和GAMl基因的存在(图6)。转化体能够在可溶性淀粉上生长，并且在37°C和48°C时将底物发酵生成乙醇。通过菌落周围的透明斑的形成显示整合体中淀粉酶的有效分泌(图7A&B)。在48°C，pH5.5条件下，所选出的最佳整合体(2Eth_leul-l/pORl#7)在含3%可溶性淀粉的基本培养基中发酵48小时后产出3g/L以上的乙醇(图8)。为获得具有增加的淀粉降解活性的多形汉逊酵母菌株，我们尝试提高SWA2和GAMl的拷贝数。基于此目的使用了携带显性标记(赋予对G418的抗性的APH基因)以及SWA2和GAMl基因的质粒pORll。将多形汉逊酵母菌株4952Eth_leul-l作为受体，利用被SphI线性化的质粒pORll进行转化。转化以后，细胞被铺板于含O.2g/lG418的YPD培养基上。在所得约80个G418-抗性菌落中发现并挑选出5个稳定转化体。通过PCR方法利用相应引物，显示这些转化体中在HpGAPpr之下的SWA2基因和GAMl基因的存在(图6)。通过SDS-PAGE对这些菌株所生产的重组酶(α-淀粉酶和葡糖淀粉酶)进行验证(图9Α&Β)。用质粒pORll转化后的分离物与早期从pORl质粒中分离的最佳转化体相比，所形成的淀粉降解透明斑更大(图10)。Southern杂交验证了分离的转化体中约存在6_8个拷贝的SWA2基因和GAMl基因(图11)。与仅含3-4个拷贝淀粉酶基因的菌株相比，转化体4952Eth_leul-l/p0Rll表现出了更高的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶活性(图12Α&Β)。对分离的转化体的乙醇淀粉发酵效力进行研究。与pORl转化后早期分离的转化体相比，这些转化体显示出了增高的乙醇生产量(72小时培养后，6.5g/L)。在pH5.5，48°C，135rpm条件下，在含3%可溶性淀粉的基本YNB培养基中进行发酵(图13)。具有改良的淀粉发酵性质的多形汉逊酵母菌株的分离利用本实验室早期构建的质粒ploxZeoloxroClHp获得具有改良的淀粉降解性质的多形汉逊酵母菌株。在过表达丙酮酸脱羧酶基因(PDCl)后，这些菌株与对照菌株4952Eth_相比其特征在于乙醇生产量增高[14]。含HpGAPpr驱动的roCl基因的质粒ploxZeoloxroClHp经过BamHI线性化并用于早期分离的菌株#4’(4952Eth7pORl)的转化。用补充150μg/ml博莱霉素的YH)培养基对博莱霉素抗性转化体进行选择。选出一些稳定的整合体用于进一步研究。对这些重组体的乙醇发酵效力进行研究。与4’菌株相比(至多4g/L;图14)，所有转化体均表现出较高水平的乙醇生产量(7-8g/L)。利用菌株#6(转化体4’/ploxZeoloxroClHp，表现出最高水平的乙醇生产量)作为受体，用经过SphI线性化的质粒pORl进行转化。在无亮氨酸的基本培养基中选择Leu+转化体，并使其稳定化。将稳定转化体铺板于补充2%可溶性淀粉的基本培养基上。与菌株#6相比形成了更大的透明斑的一些整合体被选择用于进一步研究(图15)。对这些重组体的乙醇发酵效力进行研究。与菌株#6相比时，所有转化体均表现出较高水平的乙醇生产量(9-10g/L)。多形汉逊酵母中早.氏木霉XYN2基因和黑曲霉XLND基因的表达包含用HpGAPpr(图3)驱动的里氏木霉XYN2基因和黑曲霉xlnD基因的质粒p0R2被SphI线性化并用于多形汉逊酵母菌株4952Eth_leul-l的转化。Leu+转化体被稳定化。通过PCR利用相应引物对转化体中HpGAPpr之下的XYN2和xlnD基因的存在进行检测(图6)。转化体能够在木聚糖为唯一碳源生长(图17，A、B1和B2)。木聚糖内切酶和β-木糖苷酶在整合体中的有效分泌是通过在分别含O.2%RBB-木聚糖或ImMPNPX的培养基上形成的透明斑或黄斑来显示的(图18A和18B)。对两种酶的活性进行测定(图19A和19B)。在37和48°C时，转化体能够以低效率将桦木木聚糖发酵为乙醇(约O.35g/L)。多形汉逊酵母中里氏木霉XYN2基因、黑曲霉XLND基因与西方许旺酵母SWA2基因和GAMl某因的共表汰在第一个实例中，将包含整合入多形汉逊酵母染色体的来自西方许旺酵母的α-淀粉酶基因和葡糖淀粉酶基因的转化体4952Eth_leul-l/p0Rll用作宿主菌株。包含用HpGAPpr驱动的里氏木霉XYN2基因和黑曲霉xlnD基因的质粒p0R2被SphI线性化并用于转化多形汉逊酵母菌株4952Eth_leul-l/p0Rll。按前述方法稳定转化体。通过PCR利用相应引物检测XYN2基因和xlnD基因的存在。转化体能够以可溶性淀粉和/或可溶性木聚糖作为唯一碳源生长。基本上按前述方法验证所有四种酶的有效分泌。转化体可在37°C和48V使含可溶性淀粉和桦木木聚糖的混合培养基发酵生成乙醇。在第二个实例中，具有已转化到菌株中的α-淀粉酶基因和葡糖淀粉酶基因的前面所述的转化体4’/ploxZeoloroClHp过表达PDC基因，用作宿主菌株。又一次，包含用HpGAPpr驱动的里氏木霉XYN2基因和黑曲霉xlnD基因的质粒p0R2被SphI线性化并用于多形汉逊酵母宿主菌株的转化。按照前述方法稳定转化体。通过PCR利用相应引物检测XYN2和xlnD基因的存在。转化体将能够以可溶性淀粉和/或可溶性木聚糖作为唯一碳源生长。基本上按照前述方法验证所有四种酶的有效分泌。与第一个实例中制备的转化体相比，这些转化体可在37°C和48°C使含可溶性淀粉和桦木木聚糖的混合培养基以更高水平发酵生成乙醇，这是由于宿主细胞中PDC酶的补合的(complimentary)过表达。讨论由可再生植物材料进行燃料乙醇的生产具有巨大的经济学和生态学意义。玉米纤维壳成分是来自容易大量获得的玉米湿磨工业的副产物之一。该成分与其他加工副产物和来自乙醇发酵的釜馏物(Stillage)成分相混合和干燥来生产玉米麸质饲料。玉米纤维壳由35%的半纤维素、18%的纤维素和20%的淀粉组成(蛋白质、纤维油和木质素也包含在该材料中)[7]。木聚糖是半纤维素的主要成分。包括木聚糖和淀粉的酶水解在内的工业步骤是非常昂贵的。因此利用微生物将这些聚合物直接转化成乙醇具有重要的经济意义。为此目的，建立能够在高温下同时水解淀粉和木聚糖、并将所释放的糖发酵为乙醇的微生物，对于由玉米生产燃料乙醇具有重要意义。葡萄糖和木糖分别是淀粉和木聚糖水解后释放的主要糖类。多形汉逊酵母在高温下将葡萄糖和木聚糖发酵为乙醇。但是多形汉逊酵母不能利用淀粉质材料和木聚糖作为唯一碳源并在其上生长。我们从西方许旺酵母中克隆了SWA2和GAMl两种基因，它们分别编码α-淀粉酶和葡糖淀粉酶。这些酶均为淀粉水解所需。SWA2和GAMl基因在多形汉逊酵母中被成功表达。所分离的重组菌株能够利用淀粉为唯一碳源进行生长。它们还能够在48°C时使可溶性淀粉发酵为乙醇。我们显示基因拷贝数的增加提高了重组菌株的淀粉水解能力和乙醇生产能力。分别编码木聚糖内切酶和木糖苷酶的里氏木霉XYN2基因和黑曲霉xlnD基因在多形汉逊酵母中被克隆和表达。至少其中的两种酶是木聚糖水解所需。所分离的整合体能够利用木聚糖作为唯一碳源生长，并在37°C和48°C将其发酵为乙醇。所分离的菌株将木聚糖转化为乙醇的低效力很可能是由于汉逊酵母菌株的原始的木聚糖乙醇发酵能力较低。所构建菌株在木聚糖发酵上进一步提高将需要木糖的乙醇发酵提高作为前提。这些菌株然后可作为受体用于构建有效的木聚糖降解重组体。参考文献1.Bailey,M.J.，P.Biely，和Κ·Poutanen.1992.1nterlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity.(用于木聚糖酶活性分析的实验室间检测方法)J.Biotechnol.23:257-270.2.Banatj1.M.，P.NigamjD.singh，P.Marchantj和A.P.McHale.1998.Ethanolproductionatelevatedtemperaturesandalcoholconcentrations.Part1:yeastsingeneral.(高温下的乙醇生产和酒精浓度。第一部分酵母概述)WorldJMicrobiolBiotechnol.14:809-821.3.Dmytrukj0·V.，A.Y.Voronovsky,C.A.Abbas,Κ.V.Dmytrukj0.P.1shchukj和A.A.Sibirny.2008.OverexpressionofbacterialxyloseisomeraseandyeasthostxylulokinaseimprovesxylosealcoholicfermentationinthethermotolerantyeastHansemulapolymorpha.(耐热酵母多形汉逊酵母中细菌木糖异构酶和酵母宿主木酮糖激酶的过表达改善了木糖的醇发酵)FEMSYeastRes8:165-1734.EksteenjJ.M.，P.vanRensburgjR.R.CorderoOteroj和1.S.Pretorius.2003.StarchfermentationbyrecombinantSaccaromycescerevisiaestrainsexpressingthea-amylaseandglucoamylasegenesfromLipomyceskononenkoaeandSaccharomycopsisfibuligera.(由表达橘林油脂酵母和扣囊复膜孢酵母来源的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶基因的重组酿酒酵母菌株进行的淀粉发酵)Biotechnol.Bioengineer84:639-646.5.Faber,KNjP.HaimajW.Harder,M.Veenhuisj和G.Ab.1994.Highly-efficientelectrotransformationoftheyeastHansenulapolymorpha.(多形汉逊酵母的高效电转化。)Curr.Genet.25:305-310.6.FujitajY.,和J.1to.2004.Synergisticsaccharification,anddirectfermentationtoethanol,ofamorphouscellulosebyuseofanengineeredyeaststraincodisplayingthreetypesofcellulolyticenzyme.(利用同时表现三种类型的纤维素分解酶的工程改造的酵母菌株对非晶型纤维素进行协同糖化和直接乙醇发酵)Appl.Environ.Microbiol.70:1207-1212.7.Gaspar，Μ·，G.Kalman，和K.Reczey.2007.Cornfiberasarawmaterialforhemicelluloseandethanolproduction.(玉米纤维作为半纤维素和乙醇生产的原材料)ProcessBiochem.42:1135-1139.8.GellissenjG.，G.KunzejC.GaillardinjJ.M.CreggjE.BerardijM.Veenhuisj和1.vanderKle1.2005.NewyeastexpressionplatformsbasedonmethylotrophicHansenulapolymorphaandPichiapastorisandondimorphicArxulaadeninivoransandYarrowialipolyticaacomparison.(基于甲基营养型多形汉逊酵母和巴斯德毕赤酵母与基于二形性Arxulaadeninivorans和解脂耶氏酵母的新型酵母表达平台进行的比较)FEMSYeastRes.5:1079-1096.9.Gonchar,Μ.V.1998.Sensitivemethodforquantitativedeterminationofhydrogenperoxideandoxidasesubstratesinbiologicalsamples.(对生物样品中的过氧化氢和氧化酶底物进行定量测定的灵敏方法)Ukr.Biokhim.Zh.70:157-163.10.Gonchar，M.V.，Μ·Μ·Maidan和A.A.Sibirny.2001.Anewoxidase-peroxidasekitforethanolassaysinalcoholicbeverages.(一种对酒精饮料进行乙醇分析的新型氧化酶_过氧化物酶试剂盒)FoodTechnol.Biotechnol.39:37-42.11.denHaanR.，和W.H.vanZyl.2001.DifferentialexpressionoftheTrichodermareeseiβ-xylanaseII(xyn2)geneinthexylose-fermentingyeastPichiastipitis.(里氏木霉β_木糖苷酶II(xyn2)基因在发酵木糖的酵母树干毕赤酵母中的差异表达)ApplMicrobiolBiotechnol.57:521-527.12.Haki，G.D.，和S.K.Rakshit.2003.Developmentsinindustriallyimportantthermostableenzymes:areview.(工业中重要的热稳定性酶的发展综述)BioresourceTechnology.89:17-34.13.1shchukjO.P.，A.Y.Voronovsky,0·V.StasykjG.Ζ·GaydajΜ.V.Gonchar,C.A.Abbas,和A.A.Sibirny.2008.1mprovementofxylosehigh-temperaturefermentationinHansenulapolymorphaduetooverexpressionofthePDClgenecodingforpyruvatedecarboxylase.(多形汉逊酵母中由于编码丙酮酸脱羧酶的PDCl基因的过表达改良了木糖的高温发酵)FEMSYeastRes.1npress.14.Jeffries,T.W.,和Υ·S.Jin.2000.Ethanolandthermotoleranceinthebioconversionofxylosebyyeasts.(酵母的木糖生物转化中的乙醇和耐热性)Adv.Appl.Microbiol.47:221-268.15.KadamjK.L.，和S.L.Schmidt.1997.EvaluationofCandidaacidothermophiIuminethanolproductionfromlignocellulosicbiomass.(CandidaacidothermophiIum由木质纤维素生物质进行乙醇生产的评估)Appl.Microbiol.Biotechnol.48:709-713.16.KangjN.Y.，J.N.Park,J.Ε·Chin,H.B.Lee，S.Y.1mj和S.Ba1.2003.ConstructionofanamylolyticindustrialstrainofSaccharomycescerevisiaecontainingtheSchwanniomycesoccidentalisa-amylasegene.(含西方许旺酵母α-淀粉酶基因的酿酒酵母的淀粉降解工业菌株的构建)Biotechnol.Lett.25:1847-1851.17.KilicjD.,和B.Ozbek.2004.a-Amylaseinactivationbytemperatureduringstarchhydrolysis.(淀粉水解期间的温度导致的α-淀粉酶失活)ProcessBiochem.39:1139—1144.18.KulkarnijN.,A.Shendyej和Μ·Rao.1999.Molecularandbiotechnologicalaspectsofxylanases.(木聚糖酶的分子和生物技术方面)FEMSMicrobiol.Rev.23:411-456.19.LaGrange,D.C.,1.S.Pretorius,M.Claeyssensj和W.Η·vanZyl.2001.DegradationofxylantoD-xylosebyrecombinantSaccharomycescerevisiaecoexpressingtheAspergillusnigerβ-xylosidase(xlnD)andtheTrichodermareeseixylanaseII(xyn2)genes.(共表达黑曲霉β-木糖苷酶基因(xlnD)和里氏木霉木聚糖酶II(xyn2)基因的重组酿酒酵母将木聚糖降解为D-木糖)Appl.Environ.Microbiol.67:5512-5519.20.LaGrange,D.C.,1.S.Pretorius,和W.Η·vanZyl.1996.ExpressionofaTrichodermareeseiβ-xylanasegene(XYN2)inSaccharomycescerevisiae.(里氏木霉β-木聚糖酶基因(ΧΥΝ2)在酿酒酵母中的表达)Appl.Environ.Microbiol.62:1036-1044.21.LaemmlijU.K.1970.CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.(T4嗷菌体的头部组装期间结构蛋白的裂解)Nature.227:680-685.22.LiujZ.,G.Zhangj和S.Liu.2004.ConstructinganamylolyticbrewingyeastSaccharomycespastorianussuitableforacceleratedbrewing.(适合于力口速酉良造的淀粉降解酿酒酵母巴斯德酵母的构建)J.Biosc1.Bioeng.98:414-419.23.Marin,D.,A.Jimenezj和M.FernandezLobato.2001.ConstructionofanefficientamylolyticindustrialyeaststraincontainingDNAexclusivelyderivedfromyeast.(仅含酵母来源DNA的高效淀粉降解工业酵母菌株的构建)FEMSMicrobiol.Lett.201:249_253·24.Mosier，N.，和C.Wyman.2005.Featuresofpromisingtechnologiesforpretreatmentoflignocellulosicbiomass.(预处理木质纤维素生物质的有前景的技术的特征)Bioresour.Technol.96:673-686.25.Piontek，M.，J.Hagedorn，C.P.Hollenberg，G.Gellissen，和A.W.M.Strasser.1998.TwonovelgeneexpressionsystemsbasedontheyeastsSchwanniomycesoccidentalisandPichiastipitis.(基于西方许旺酵母和毕赤酵母的两种新颖的基因表达系统)Appl.Microbiol.Biotechnol.50:331-338.26.Ryabova,0.Β.,0.M.Chmil和Α·Α·Sibirny.2003.XyloseandcellobiosefermentationtoethanolbythethermotolerantmethylotrophicyeastHansenulapolymorpha.(木糖和纤维二糖由耐热甲基营养型酵母多形汉逊酵母发酵为乙醇)FEMSYeastRes.4:157—164.27.Sambrook，J.，E.F.Fritsh，和T.Maniatis.MolecularCloning:ALaboratoryManual.(分子克隆实验室手册)ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork.1989.28.ShigechijΗ.，Y.FujitajJ.KohjM.UedacjH.Fukudaj和A.Kondo.2004.Energy-savingdirectethanolproductionfromlow-temperature-cookedcornstarchusingacell—surfaceengineeredyeaststrainco-displayingglucoamylaseanda-amylase.(利用共表现葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的具有工程改造的细胞表面的酵母菌株由低温蒸煮的玉米淀粉进行节能的直接乙醇生产)Biochem.Eng.J.18:149-153.29.ShigechijH.，J.KohjΥ·FujitajΤ·MatsumotojY.BitojΜ.UedajΕ·SatohjH.Fukudaj和A.Kondo.2004.Directproductionofethanolfromrawcornstarchviafermentationbyuseofanovelsurface-engineeredyeaststraincodisplayingglucoamylaseanda-amylase.(利用共表现葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的具有新颖的工程改造的表面的酵母菌株由原料玉米淀粉经发酵进行直接的乙醇生产)Appl.Environ.Microbiol.70:5037-5040.30.Sohn，J.Η.，E.S.Choi,H.A.Kang,J.S.Rhee，M.0.Agaphonov,M.D.Ter-Avanesyanj和S.K.Rhee.1999.Adominantselectionsystemdesignedforcopynumber-controlledgeneintegrationinHansenulapolymorphaDL-L(用于多形汉逊酵母DL-1中拷贝数受控的基因的整合所设计的显性选择系统)ApplMicrobiolBiotechnol.51:800-807.31.TorronenjA.，L.R.MachjR.Massner,R.Gonzales,N.KalkkinenjA.Harkkij和C.P.Kubicek.1992.ThetwomajorxylanasesfromTrichodermareese1:characterizationofbothenzymesandgenes.(来自里氏木霉的两种主要木聚糖酶酶和基因的表征)Biothechnology.10:1461-1465.32.UlgenjK.0.,andB.Saygih.2002.BioconversionofstarchintoethanolbyarecombinantSaccharomycescerevisiaestrainYPG-AB.(由重组酿酒酵母菌株YPG-AB进行的淀粉生成乙醇的生物转化)ProcessBiochem.37:1157-1168.33.deVries,R.P.和J.Visser.2001.Asperillusenzymesinvolvedindegradationofplantcellwallpolysaccharides.(植物细胞壁多糖降解所涉及的黑曲霉的酶类)Microbiol.Mol.Biol.Rev.65:497-522.34.Wang,T.T.,L.L.Linj和W.H.Hsu.1989.CloningandexpressionofaSchwanniomycesoccidentalisa-amylasegeneinSaccharomycescerevisiae.(酿酒酵母中的西方许旺酵母α-淀粉酶基因的克隆和表达。)Appl.Environment.Microbiol.55:3167-3172.35.Zaldivar，J.，J.Nielsen，和LOlsson.2001.Fuelethanolproductionfromlignocellulose:achallengeformetabolicengineeringandprocessintegration.(由纤维木质素生产燃料乙醇对于代谢工程和工艺整合的挑战)ApplMicrobiolBiotechnol.56:17-权利要求1.一种多形汉逊酵母菌株，所述多形汉逊酵母菌株包含编码木聚糖内切酶的至少一种基因和编码β-木糖苷酶的至少一种基因，所述基因与在所述多形汉逊酵母菌株中表达所述基因的至少一种启动子可操作地连接，并且所述酶以充足的量自所述多形汉逊酵母菌株输出到培养基中，从而允许所述多形汉逊酵母菌株在只含可溶性木聚糖作为碳源的培养基中生长。2.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母菌株，其中编码所述木聚糖内切酶和木糖苷酶中至少其一的基因被整合入所述多形汉逊酵母的染色体中。3.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母菌株，其中编码所述木聚糖内切酶和木糖苷酶的所述基因中的每一种均被整合入所述多形汉逊酵母的染色体中。4.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母菌株，其中编码所述木聚糖内切酶或木糖苷酶的所述基因中的至少一种是从选自由黑曲霉(Aspergillusniger)和里氏木霉(Trichodermareseei)所组成的组的菌株获得。5.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母菌株，编码所述木聚糖内切酶或所述木糖苷酶的所述至少一种基因还包括与所述基因可操作地连接以终止所表达的基因的转录的终止子。6.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母菌株，其中所述启动子包括从多形汉逊酵母获得的HpGAP启动子。7.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母菌株，所述多形汉逊酵母菌株还包括编码丙酮酸脱羧酶的基因，所述编码丙酮酸脱羧酶的基因与在所述多形汉逊酵母菌株中表达所述丙酮酸脱羧酶的至少一种启动子可操作地连接。8.—种制造乙醇的方法，所述方法包括使权利要求1所述的多形汉逊酵母菌株在促使所述多形汉逊酵母制造乙醇的条件下生长在含可溶性木聚糖的培养基中。9.一种重组核酸，所述重组核酸包含编码木聚糖内切酶的基因和编码木糖苷酶的基因中的至少一种，所述基因与从多形汉逊酵母获得的HpGAP启动子可操作地连接。10.根据权利要求9所述的重组核酸，其中满足以下至少一项e.所述β-木糖苷酶由根据SEQID.NO5的核苷酸序列编码；f.所述β-木糖苷酶具有根据SEQID.NO6的氨基酸序列；g.所述木聚糖内切酶由根据SEQID.NO7的核苷酸序列编码；以及h.所述木聚糖内切酶具有根据SEQID.NO8的氨基酸序列。11.根据权利要求9所述的重组核酸，其中编码所述β-木糖苷酶和木聚糖内切酶的所述基因还与内源性连接于所述基因的终止子核苷酸序列可操作地连接。12.根据权利要求11所述的重组核酸，其中内源性连接于所述基因的所述终止子核苷酸序列是根据SEQIDNO9和SEQIDNO10中的至少一项。全文摘要在多形汉逊酵母中克隆和表达了来自酵母西方许旺酵母的分别编码α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的基因SWA2和GAMl。通过将SWA2基因和GAMl基因与多形汉逊酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(HpGAP)的强组成型启动子可操作地连接后整合入多形汉逊酵母的染色体中而实现该表达。所得转化体获得在包含可溶性淀粉作为唯一碳源的基本培养基上生长的能力，并可在高温发酵下由淀粉生产乙醇，高达10g/L。编码木聚糖内切酶的XYN2基因是从真菌里氏木霉获得，并且编码β-木糖苷酶的xlnD基因是从真菌黑曲霉获得。在HpGAP启动子的控制下通过将这些基因整合入多形汉逊酵母染色体中还实现这些基因的共表达。所得转化体能够在补充桦木木聚糖作为唯一碳源的基本培养基上生长。木聚糖降解酶的成功表达得到能够在48℃将桦木木聚糖发酵为乙醇的受体菌株。另外上述基因在过表达丙酮酸脱羧酶基因的多形汉逊酵母菌株中的共表达进一步提高乙醇生产量。文档编号C12P7/06GK103060216SQ20121035641公开日2013年4月24日申请日期2009年5月6日优先权日2008年5月6日发明者查尔斯·阿巴斯,安德烈·希博尼,安德烈·Y·沃罗诺夫斯基申请人:阿彻丹尼尔斯米德兰德公司