一株马来西亚链霉菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株新菌株，特别涉及一种拮抗菌一一马来西亚链霉菌A8 A8)，同时还涉及该菌株的应用。
【背景技术】
[0002] 目前农业生产上常使用化学农药防治作物病害的发生。但由于化学农药容易出现 抗药性和药物残留，不仅污染环境，还严重地威胁人体健康。生物防治技术具有不污染环 境、对人和其他生物安全、防治作用持久、产品无残留、对病虫的杀伤特异性强，易于同其他 植物保护措施协调配合并能节约能源等优点，必将在有害生物综合防治中发挥着越来越重 要的作用。随着人们对无公害食品的需求的日益增加以及对环境保护的日益关注，生物防 治成为了人们控制植物病害的理想途径。因此，筛选出生物活性高、抗菌谱广的菌株具有重 要的意义。
[0003] 链霉菌可以产生多种抗生素，目前世界上已经发现的抗生素中约有80%是由放线 菌产生，其中又以链霉菌属列居放线菌中最大的菌属，该属可产生1000多种抗生素。这些 抗生素除了可以广泛应用于医药领域，在农作物生产方面还具有植物保护的用途。
[0004] 生防农药中大部分都是农用抗生素，具有毒性低、残留少的特点，可以有效抑制植 物病原菌的生长和繁殖。因此，链霉菌产生的农用抗生素在生防农药中占有重要地位。早 期的研究表明马来西亚链霉菌EC000002可产生阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素等多 种活性物质，对番茄灰霉病、水稻稻瘟病、烟草赤星病和辣椒炭疽病等多种植物病害有较好 的防治效果。由于同种而不同来源的链霉菌菌株可产生不同的拮抗化合物，且同一化合物 产生在不同种中对不同病原菌的拮抗效果也是不同的。
[0005] 香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型f.sp.ci/Aease) 侵染引起的，传染性强、破坏大、很难有效治理，在我国广东、广西、云南、海南、福建等省区 发生普遍。病害严重的香蕉园区，香蕉植株成片枯黄、甚至死亡，蕉农损失严重。香蕉枯萎 病已成为威胁我国香蕉产业健康发展的最大威胁之一。目前香蕉枯萎病的防治方法主要有 采用抗病品种和化学药剂，但是，由于香蕉具有单性结果，多倍性、高度不育、没有种子等特 性，很难进行杂交育种，因此香蕉抗病品种选育进度缓慢。而香蕉枯萎病是一种土传病害， 危害香蕉的维管束，目前还没有有效防治的化学药剂。近年来，香蕉枯萎病生物防治越来越 受到国内外研究者的青睐，并取得了一些成效，目前利用的生防菌主要有芽孢杆菌、假单孢 菌、沙雷氏菌、洋葱伯克尔德氏菌、菊欧氏杆菌、木霉菌、非致病性尖孢镰刀菌和链霉菌等。
[0006] 甜瓜枯萎病是由甜瓜专化型枯萎病菌尖袍镰刀菌f.sp. 引起，在甜瓜全生育期均可发生。目前随着保护地栽培方式大范围推广，连作甜瓜 枯姜病发生更趋严重。甜瓜枯萎病的防治是一种世界性的难题，传统的化学及农业防治措 施通常会带来环境问题、或成本高、劳动强度大等不能成功的应用于农业生产。目前，对于 生物防治甜瓜枯萎病虽有报道，但可供商品化开发应用的生防产品并不多。
[0007] 番前枯萎病是由番前专化型枯萎病菌尖孢镰刀菌（f.sp. 乂引起，目前生产上主要采用化学药剂防治番茄枯萎病，不仅造成生态环境严 重污染，而且直接增加农产品有毒化学物质的残留量，对人类健康带来危害。生物防治对人 畜安全、环境兼容性好、病菌不易产生抗药性，因而引起人们的重视，并初见成效。已报道的 番茄枯萎病生防菌主要有木霉菌、非致病尖孢镰刀菌、假单胞菌和芽孢杆菌等。
[0008] 关于马来西亚链霉菌对香蕉枯萎病、甜瓜枯萎病和番茄枯萎病等植物病原真菌的 拮抗作用尚未见报道。因此，针对不同病害的病原菌筛选高效拮抗化合物及其菌株，是开发 和利于链霉菌资源的基础。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种马来西亚链霉菌A8 {.Streptomyces malaysiensis你）。
[0010] 本发明的马来西亚链霉菌A8 (A8)采用稀释分离法 从海南东方市的香蕉园土壤中筛选得到，已于2015年9月10日保藏在中国典型培养物保 藏中心（地址：中国武汉.武汉大学），保藏编号为CCTCCN0:M2015518。
[0011] 本发明的马来西亚链霉菌A8对多种枯萎病病原菌，特别是对香蕉枯萎病菌、番茄 枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌等重要经济作物枯萎病菌具有很好的拮抗作用，且遗传稳定性强， 是一种非常有潜力的生防农药，可应用于香蕉、甜瓜和番茄等作物枯萎病的生物防治。
【附图说明】
[0012] 图1为本发明菌株A8的分生孢子形态图； 图2和3为本发明菌株A8的孢子丝形态图； 图4为本发明菌株A8的系统发育树； 图5为本发明菌株A8与香蕉枯萎病、番前枯萎病和甜瓜枯萎病的对峙培养图。
【具体实施方式】
[0013]马来西亚链霉菌A8 (5^6>/^咖尺6>6· A8)特性 1)菌体形态特征 光学显微镜下观察，该菌株孢子丝螺旋形(见图1 )，分生孢子圆筒状至桶形，孢子表面 有皱纹(见图2和3)。
[0014] 2)菌落培养特征 将菌株A8接种在高氏一号琼脂、甘油天冬素琼脂（ISP)、无机盐淀粉琼脂（ISP)、酵母 精麦芽精琼脂（ISP)、燕麦粉琼脂（ISP)、营养琼脂、马铃薯葡萄糖培养基和酪氨酸培养基 中，于28 °C培养7d后，开始观察各种培养基上的培养特征，结果见表1。
[0015] 表1马来西亚链霉菌A8的菌落培养特征
3)生理生化特征 能利用果糖、D-半乳糖、肌糖、棉籽糖和木糖，可使蛋白酶水解，能产生黑色素。但不能 利用蔗糖、醋酸糖和柠檬酸盐，不能水解淀粉，不能产生硫化氢，也不能使牛奶凝固和胨化。 属于好氧菌，能在28°C~40°C下生长，但不能在10°C和45°C下生长。
[0016] 4)分子生物学特征 采用SDS-蛋白酶K，氯仿-异戊醇（体积比24:1)抽提，0. 6倍体积异丙醇沉淀的方 法提取菌株总DNA。采用细菌16SrDNA通用引物F8和R1492扩增细菌的16SrDNA，将 PCR扩增产物回收后进行测序。再将得到的碱基序列在GenBank等国际核酸序列数据库内 进行同源序列搜索（BlastSearch)，找出该菌株与数据库中同源性最高的模式菌株或保 藏于ATCC或DSM等国际菌种保藏中心的菌株。根据比对结果，菌株A8与马来西亚链霉菌 (5^6>/^咖尺6>6· 的16SrDNA具最高同源性，达99. 9%。基于1000个重复的 抽样分析，使用MEGA4. 0软件构件系统发育树，显示本菌株A8与马来西亚链霉菌模式菌株Streptomyces malaysiensisAB249918 一系统进化分支（见图 4)。
[0017] 参照《伯杰细菌鉴定手册》、《放线菌的分类和鉴定》及文献"Str印tomyces malaysiensissp.nov. ,anewstreptomycetespecieswithrugose,ornamented spores"，结合本菌株A8的显微形态特征、培养特征、生理生化试验结果和序列分析，最终 确定本发明菌株为马来西亚链霉菌，并命名为
[0018] 本发明菌株A8对5种枯萎病病原菌的拮抗作用 以下实验中用到的香蕉枯萎病病原菌FOCI 5/7.ci/Aease)、香 蕉枯萎病病原菌F0C4、番前枯萎病病原菌 XrcOjOersici)、 甜瓜枯萎病病原菌9230 0x75770/?/. 6·/λa?e>7o?i6·)、甜瓜枯萎病病原菌9062均 由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。
[0019] 采用平板对峙实验（同步拮抗实验)，分别以香蕉枯萎病菌F0CUF0C4,番茄枯萎病 菌282,甜瓜枯萎病菌9062、9230为指示菌。将拮抗菌菌株A8接种于高氏一号培养基中进行 培养；同时，将各指示菌株分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA)培养基中进行培养。当拮抗 菌和指示菌菌株在各自的培养基中培养活化后，分别用打孔器打成直径为5mm的菌饼。选 取指示菌株的菌饼一块，置于盛装PDA培养基的平皿中央位置（平皿直径9cm);再选取由 拮抗菌株得到的菌饼四块，根据对峙法，将该四块菌饼等距接种于距该平皿中央位置为2cm 的圆周上。将该培养皿在28°C的环境温度下培养4d后，用十字法3次重复测定该PDA培养 基中上述菌株的抑菌圈半径、拮抗菌半径，计算拮抗指数。
[0020] 抑菌圈半径=拮抗菌菌饼中心至病原菌菌丝边缘的距离 拮抗指数=(抑菌圈半径-拮抗菌半径）/拮抗菌半径 将本发明菌株A8进行继代培养，逐代进行平板对峙实验，观测其拮抗指数的变化，从 而确定该菌种对病原菌拮抗作用的遗传稳定性。结果见图5和表2。
[0021 ] 表2菌株A8对病原菌拮抗作用的遗传稳定性
由表2可见，在第20代时本发明菌株A8对香蕉枯萎病菌FOCI、F0C4,番茄枯萎病菌 282,甜瓜枯萎病菌9062、9230均都具有拮抗效果，且拮抗指数与第一代相比变化不大，说 明该菌株对上述5种病原菌的拮抗作用很稳定。
【主权项】
1. 一株马来西亚链霉菌（姆菌株，已于2015年 9月10日保藏在位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCCN0:M2015518〇2. 权利要求1所述的马来西亚链霉菌作为枯萎病菌 拮抗生物制剂的应用。3. 权利要求1所述的马来西亚链霉菌作为香蕉枯萎 病菌拮抗生物制剂的应用。4. 权利要求1所述的马来西亚链霉菌（5Y_T6>/?i6^j^6w 作为番前枯萎 病菌拮抗生物制剂的应用。5. 权利要求1所述的马来西亚链霉菌作为甜瓜枯萎 病菌拮抗生物制剂的应用。6. -种防治枯萎病的生物制剂，由载体和拮抗菌组成，其特征在于：拮抗菌为权利要 求1所述的马来西亚链霉菌7. -种防治香蕉枯萎病的生物制剂，由载体和拮抗菌组成，其特征在于：拮抗菌为权 利要求1所述的马来西亚链霉菌8. -种防治番茄枯萎病的生物制剂，由载体和拮抗菌组成，其特征在于：拮抗菌为权 利要求1所述的马来西亚链霉菌9. 一种防治甜瓜枯萎病的生物制剂，由载体和拮抗菌组成，其特征在于：拮抗菌为权 利要求1所述的马来西亚链霉菌
【专利摘要】本发明公开了一株具有拮抗枯萎病菌特性的马来西亚链霉菌A8及其应用，其保藏号为CCTCC？NO:M2015518。本发明菌株A8能够抑制香蕉、甜瓜、番茄等专化型枯萎病病原菌的生长，具有广谱的拮抗作用，且遗传稳定性强。可应用于香蕉、甜瓜和番茄等作物枯萎病的生物防治。CCTCCNO:M201551820150910
【IPC分类】A01N63/00, C12R1/465, A01P3/00, C12N1/20
【公开号】CN105349455
【申请号】CN201510755006
【发明人】邓晓, 李勤奋, 武春媛, 李怡, 刘景坤
【申请人】中国热带农业科学院环境与植物保护研究所
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月9日