一种淡紫拟青霉的液体发酵方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种淡紫拟青霉的发酵方法，具体的涉及一种淡紫拟青霉液体发酵方 法，属于农业技术领域。
【背景技术】
[0002] 淡紫拟青霉属于内寄生性真菌，是一些植物寄生线虫的重要天敌，能够寄生于卵， 也能侵染幼虫和雌虫，可明显减轻多种作物根结线虫、胞囊线虫、茎线虫等植物线虫病的危 害。该属主要特征是分生孢子梗呈瓶状或近球形(瓶梗），在菌丝端或短枝上轮生，分生孢子 单孢链状，至今该属报道有近50个种，皆为昆虫病原菌和线虫病原菌。
[0003] 淡紫拟青霉广泛分布于世界各地，具有功效高、寄主广、易培养等优点，特别在控 制植物病原线虫方面功效卓著。半个多世纪以来，国内外许多专家学者对此菌进行了广泛 而深入的研究，在生物学、生态学、大量培养、控害效能与田间应用等方面取得了一系列研 究成果。
[0004] 但对淡紫拟青霉的发酵方法研究还不是非常成熟，实验室的培养方法，在实际生 产中并不能同比例放大，在工业生产中发酵液的菌含量等指标明显降低，无法大规模生产。
[0005] 专利CN201110274968.X公开了一种淡紫拟青霉的液体发酵培养方法，但其制备的 淡紫拟青霉发酵液的孢子、菌体的含量都不高，且其采用的培养方法为摇床培养，并不适用 于大规模的工业生产。
[0006] 现有的淡紫拟青霉液体发酵技术具有以下缺陷：（1)淡紫拟青霉发酵液的孢子含 量低；（2)淡紫拟青霉发酵液的孢子萌发率较差；（3)淡紫拟青霉发酵液的菌体含量不高； (4)制备的淡紫拟青霉防治植物病虫害的效果不理想。
【发明内容】
[0007] 本发明为解决现有技术存在的不足，提供一种淡紫拟青霉液体发酵方法，以实现 以下发明目的： 1、 提高淡紫拟青霉发酵液的孢子含量，使孢子含量为4.1 X 109~4.4 X 109个/g; 2、 提高淡紫拟青霉发酵液的孢子萌发率，使孢子萌发率为98.9~99.5%; 3、 提高淡紫拟青霉发酵液的菌体含量，使菌体含量为89~96 g/L; 4、 使本发明制备的淡紫拟青霉对荔枝蝽蟓、大豆孢囊线虫、蓟马、褐飞虱具有明显的防 效； 5、 使本发明制备的淡紫拟青霉具有明显的抑制玉米小斑病、小麦赤霉病、黄瓜炭疽病 菌、棉花枯萎病的作用。
[0008] 为解决上述技术问题，采用以下技术方案： 一种淡紫拟青霉液体发酵方法，所述的发酵方法包括菌种活化、菌种扩培和发酵步骤。
[0009] 以下是对上述技术方案的进一步改进： 所述发酵步骤:采用的发酵培养基包括以下原料组分:棉籽饼粉、硅藻土、酵母浸出粉、 红薯粉、白砂糖、鱼蛋白胨、橄榄油、甘露醇、硫酸镁、硫酸铜、吐温20、磷酸氢f丐、硼酸、牛胆 盐、酪氨酸、二氧化锰、去离子水。
[0010] 所述发酵培养基的原料重量份配比为： 棉籽饼粉:硅藻土:酵母浸出粉:红薯粉：白砂糖:鱼蛋白胨:橄榄油:甘露醇:硫酸镁:硫 酸铜：吐温20:磷酸氢钙：硼酸：牛胆盐:酪氨酸：二氧化锰:去离子水=450~520: 90~105: 198~250: 280~350: 140~160: 45~53: 0.3~0.6: 0.8~1.1: 4~6: 4~6: 3.5~ 4.5: 18~22: 4~6: 0.8~1.2: 1.8~2.2: 1.8~2.3:30000〇
[0011] 所述菌种活化步骤:采用的菌种活化培养基包括以下原料组分:海藻多糖、山梨糖 醇、牛肉膏、天门冬酰胺、七水硫酸铜、二氧化锰、氯化钠、氯化钙、硼酸、柠檬酸铁、甘露醇、 琼脂、去离子水。
[0012] 所述菌种活化培养基的原料重量份配比为： 海藻多糖：山梨糖醇:牛肉膏:天门冬酰胺:七水硫酸铜:二氧化锰:氯化钠:氯化钙:硼 酸:柠檬酸铁:甘露醇:琼脂:去离子水=19~21: 14.5~15.5: 9~12: 0.02~0.04: 0.03 ~0.05: 0.04~0.05: 0.01~0.02: 0.03~0.05: 0.05~0.07: 0.02~0.04: 0.04~ 0.06: 18~23:1000。
[0013] 所述菌种扩培步骤:采用的菌种扩培培养基包括以下原料组分：玉米粉、山梨糖 醇、全脂奶粉、鸡蛋清、天门冬酰胺、络氨酸、二氧化锰、牛胆盐、氯化钙、硼酸、橄榄油、甘露 醇、硫铵、硫酸镁、去离子水。
[0014] 所述菌种扩培培养基的原料重量份配比为： 玉米粉：山梨糖醇:全脂奶粉:鸡蛋清:天门冬酰胺:络氨酸:二氧化锰:牛胆盐:氯化钙： 硼酸:橄榄油:甘露醇:硫铵:硫酸镁:去离子水=23~26: 6~9: 13~15: 9~10.5: 0.03~ 0.05: 0.01~0.03: 0.04~0.06: 0.02~0.03: 0.03~0.05: 0.05~0.06: 0.03~0.04: 0.04~0.06: 0.01~0.02: 0.01~0.02:1000。
[0015]所述菌种活化:培养温度为29°C，培养时间为7天。
[0016] 所述菌种扩培：l〇〇r/min震荡培养6天，控制温度为26~28°C，湿度为35~45%。
[0017] 所述发酵步骤:接种量为发酵培养基质量的5%;控制搅拌转速为60~70rpm，发酵 罐内温度为25~30°C，持续通入无菌空气，发酵时间为7~10天。
[0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果是： 1、 本发明制备的淡紫拟青霉发酵液，孢子含量为4.1 X 109~4.4 X 109个/g; 2、 本发明制备的淡紫拟青霉发酵液，孢子萌发率为98.9~99.5%; 3、 本发明制备的淡紫拟青霉发酵液，菌体含量为89~96 g/L; 4、 本发明制备的淡紫拟青霉对荔枝蝽蟓、大豆孢囊线虫、蓟马、褐飞虱具有明显的防 效;将本发明制备的淡紫拟青霉发酵菌液制成孢子质量含量为15%的菌悬液，对荔枝蝽蟓的 防效为93~95%，大豆孢囊线虫的防效为94~97%，蓟马的防效为89~93%，褐飞虱的防效为 92~98%; 5、 本发明制备的淡紫拟青霉可明显降低玉米小斑病、小麦赤霉病、黄瓜炭疽病菌、棉花 枯萎病的发病率； 6、 本发明淡紫拟青霉发酵方法可实现大规模的生产，且含菌量稳定，不易受杂菌污染。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1 一种淡紫拟青霉液体发酵方法 步骤1、菌种活化 (1)制备菌种活化培养基 所述菌种活化培养基为固体平板培养基，其制备方法为： 用电子天平准确称取菌种活化培养基的原料组分，包括：海藻多糖19g、山梨糖醇 14.5g、牛肉膏9g、天门冬酰胺0.02g、七水硫酸铜0.03g、二氧化锰0.04g、氯化钠 O.Olg、 氯化钙0.03g、硼酸0.05g、柠檬酸铁0.02g、甘露醇0.04g、琼脂18g、去离子水lkg; 将上述菌种活化培养基原料加热溶解，加热至温度70~75°C，持续加热15~16min; 用NaOH和HC1调节pH=6后，倒至灭菌后的培养皿内，冷却至常温，制得菌种活化培养基。
[0020] (2)接种与活化 选取的菌种为淡紫拟青霉菌种，保藏号为ACCC30673,为市购商品； 将菌种转接到菌种活化培养基上，进行活化培养，培养条件为29°C，培养时间为7天。 [0021 ] 步骤2、菌种扩培 将活化后的淡紫拟青霉菌株接种于装有菌种扩培培养基的300ml的锥形瓶中； 每个锥形瓶内装有150ml菌种扩培培养基，接种量为lcm2菌种活化培养基上的菌种； 所述菌种扩培培养基的配方为： 玉米粉23g、山梨糖醇6g、全脂奶粉13g、鸡蛋清9g、天门冬酰胺0.03g、络氨酸 O.Olg、二氧化锰0.04g、牛胆盐0.02g、氯化钙0.03g、硼酸0.05g、橄榄油0.03g、甘露醇 0.04g、硫铵O.Olg、硫酸镁O.Olg、去离子水lkg; 用NaOH和HC1调节菌种扩培培养基PH为6.5。
[0022]将锥形瓶置于摇床培养箱内，100r/min震荡培养6天；控制温度为26°C，湿度为 35%； 将扩培得到的菌液放置在4~6°C的冰箱内10~12小时，备用。
[0023]步骤3、发酵 (1)制备发酵培养基 将发酵培养基的原料组分精确称量后，加入发酵罐内； 所述的发酵培养基的原料组分包括:棉籽饼粉450g、硅藻土 90g、酵母浸出粉198g、 红薯粉280g、白砂糖140g、鱼蛋白胨45g、橄榄油0.3g、甘露醇0.8g、硫酸镁4g、硫酸铜 48、吐温20 3.58、磷酸氢钙188、硼酸48、牛胆盐0.88、酪氨酸1.88、二氧化锰1.88、去 离子水30kg; 开启搅拌，80rpm搅拌30min，调节发酵罐内培养基的pH为5; 关闭发酵罐所有进出口，升温，使发酵罐内压力达到〇.l〇5MPa，温度达到121°C，灭菌25 ~30min; 降温，使发酵罐内发酵培养基的温度为25~26°C。
[0024] (2)接种 将步骤2扩培得到的菌液，在无菌条件下，从接种口倒入发酵罐内，接种量为发酵罐内 发酵培养基质量的5%;接种后迅速关闭接种口。
[0025] (3)发酵 控制搅拌转速为60rpm，发酵罐内温度为25~26°C，持续通入无菌空气，保证发酵罐内 的无菌状态;发酵时间为7天，得到发酵菌液。
[0026] 实施例2 -种淡紫拟青霉液体发酵方法 步骤1、菌种活化 (1)制备菌种活化培养基 所述菌种活化培养基为固体平板培养基，其制备方法为： 用电子天平准确称取菌种活化培养基的原料组分，包括:海藻多糖20g、山梨糖醇15g、 牛肉膏l〇g、天门冬酰胺〇.〇3g、七水硫酸铜0.04g、二氧化锰0.05g、氯化钠0.02g、氯化 钙0.04g、硼酸0.06g、柠檬酸铁0.03g、甘露醇0.05g、琼脂20g、去离子水lkg; 将上述菌种活化培养基的原料加热溶解，加热至温度75~77°C，持续加热17~18min; 用NaOH和HC1调节pH=6后，倒至灭菌后的培养皿内，冷却至常温，制得菌种活化培养基。 [0027] (2)接种与活化 选取的菌种为淡紫拟青霉菌种，保藏号为ACCC30673,为市购商品； 将菌种转接到菌种活化培养基上，进行活化培养，培养条件为29°C，培养时间为7天。 [0028] 步骤2、菌种扩培 将活化后的淡紫拟青霉菌株接种于装有菌种扩培培养基的300ml的锥形瓶中； 每个锥形瓶内装有150ml菌种扩培培养基，接种量为lcm2菌种活化培养基上的菌种； 所述菌种扩培培养基的配方为： 玉米粉25g、山梨糖醇8g、全脂奶粉14g、鸡蛋清10g、天门冬酰胺0.04g、络氨酸 0.02g、二氧化锰0.05g、牛胆盐0.02g、氯化钙0.04g、硼酸0.06g、橄榄油0.03g、甘露醇 0.05g、硫铵O.Olg、硫酸镁O.Olg、去离子水lkg;