仪预热，将上述试剂加入到PCR反应管中，混合均匀后瞬时离心，放 入PCR仪中。反应条件为：94°C预变性2min;30个循环（94°C变性30s，66°C退火30s，72°C 延伸30s) ;72°C终延伸5min。待PCR结束变得到CC31基因，用1.5%琼脂糖凝胶电泳对合 成的基因进行检测。
[0058] 目的基因与克隆载体的连接：
[0059] 将抗菌肽基因与克隆载体pMD18-T载体连接，在0. 2mL微量离心管中，加入 PMD18-TVectorlyL，胶回收后的抗菌肽基因 2yL，ddH202yL，Solution1 (冰上融 化）5yL，全量为10yL;混合均匀后瞬时离心；放入连接仪中，4°C，12h，得pMD18-T/CC31 进行PCR、双酶切等鉴定结果如图3、4。
[0060] b构建抗菌肽的重组表达载体
[0061] 抗菌肽基因的克隆载体及表达载体的双酶切：
[0062] 将含有表达载体pHT43的大肠杆菌接种到3mL含有10μg/mLCm的LB培养基中， 37°C200rpm振荡过夜培养，提取质粒，将其与-20 °C保存的鉴别正确的克隆质粒分别进行 双酶切，酶切体系如下：
[0063]
[0065] 酶切反应条件为：37°C水浴，3h，其中质粒DNA分别为：pHT43、pMD-18T/CC31质粒。 取上述试剂于PCR反应管中，混匀后瞬时离心，使溶液聚集在试管底部，37°C水浴3h后，酶 切反应完全。取5μL反应液与1μL6XLoadingBuffer混合均匀，在含有EB的1 %Agarose gel电泳检测。电泳检测正确后，将剩下15μL的双酶切液进行胶回收。
[0066] 抗菌肽基因与表达载体ρΗΤ43的连接：
[0067] 将酶切好的CC31基因片段和酶切后的质粒ρΗΤ43进行连接，即可构建成质粒载体 PHT43/CC31，连接反应体系如下：
[0068]
L0069」 连接反应条仵为合，]3：杈。里组表迖栽体进仃？(^、双_切等鉴足结采如 图5、6〇
[0070] (1)构建基因工程菌：
[0071] 挑取宿主菌WB800N的单菌落接种于2mL SPI培养基中，置于50mL离心管中，200r/ min、37°C摇床中过夜培养，从中取100 μ L转接于5mL的SPI培养基中，在摇床中相同条件 培养，3h后开始测0D6。。值，每20分钟一次，0D6。。值在0. 6~0. 8之间时，从中取200 μ L菌液 转接于2mL SPII培养基中置于50mL离心管内，摇床培养90min (37°C、200r/min)。到90min 后迅速加入20yL100XEGTA溶液，在培养lOmin。最后分装，每0. 5mL-份，置于1. 5mL离 心管中，-80°C保存。取枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞0. 5mL置于一个无菌的1.5mL EP 管中，同时加入10 μ L质粒，轻轻混勾，在37°C、200r/min摇床中，培养90min后8000g离心， 弃掉350 μ L上清液，重悬菌体。取适量的菌液涂布于含有10 μ g/mL Cm的LB平板上，37°C 恒温培养箱过夜培养。
[0072] (2)诱导表达产物纯化鉴定：
[0073] 挑取对照菌（含空载质粒pHT43的枯草芽孢杆菌WB800N)和重组菌pHT43/CC31/ WB800N各一个单菌落，分别接种于5.OmLLB液体培养基（含Cm5yg/mL)中。37°C，200rpm 空气振荡培养箱培养过夜，该菌液作为种子液。取种子液500μ L置于50mL的LB培养基 (含Cm)中，注入250mL三角瓶中，37°C，200rpm空气振荡培养箱培养，当菌液0D_nm为0. 85 时开始诱导（t= 0)，添加IPTG(体积浓度为0. 8mmol/L)。诱导24h之后取样，10000g，4°C 离心10min，从上清液中取20μL与等体积的2XSDS上样缓冲液混合，超声波破碎lmin，接 着沸水浴l〇min，制备成蛋白样，用于Tricine-SDS-PAGE检测结果如图7。将pHT43/CC31/ WB800N重组菌表达上清液通过Mini超滤系统5000kda膜分离，分离液过G50层析柱后上 液相分离。取3μ L分析级HPLC分析粗品，流动相是水和乙腈，进行30min的梯度洗脱。首 先将HPLC用含95%的水和5%的乙腈的起始梯度平衡10min。然后注入准备好的样品，反 应时间为40min，收集从检测器中出来的样品。最后用25%的水和75%的乙腈混合液清洗 30min，HPLC检测CC31的出峰时间在10~12min之间，纯度为89. 27%。
[0074] 实施例2
[0075] 将实施例1得到的纯化产物CC31进行活性检测。
[0076] 最小杀菌浓度采用96孔板法测定。挑平板中大肠杆菌、停乳链球杆菌、金黄色 葡萄球菌、沙门氏菌、短乳杆菌、卷曲乳杆菌、德氏乳杆菌、双歧杆菌、毕赤酵母SMD1168和 毕赤酵母GS115的单菌落于适宜液体培养基中，四种致病菌37°C，200rpm空气震荡培养过 夜，四种乳酸菌厌氧37°C，200rpm震荡培养过夜，两种毕赤酵母30°C，200rpm空气震荡培 养48h。将抗菌肽用1XPBS分级稀释为：2000、1500、750、500、375、250、187· 5、125、93· 75、 62. 5、46. 875、31. 25、23. 475和15. 625 μΜ共计16个梯度。将培养后的菌液稀释至2X 105~ 7 X 105CFU/mL，将稀释好的测试菌液分别滴加到3个96孔培养板中，每行的1~12孔，每 孔60 μ L，然后每孔滴加20 μ L的抗菌肽，每孔加120 μ L培养基。每个样品设定3个重复， 同时以不含测试菌作为阴性对照，四种致病菌的于37°C，恒温培养，转速为lOOrpm，培养 24h;四种乳酸菌的37°C，厌氧恒温培养，培养24h;两种毕赤酵母的30°C，恒温培养，转速为 lOOrprn，培养48h。用肉眼观察无浑浊的，即为受试菌的最小抑菌浓度（MIC)。最小杀菌浓 度采用96孔板法测定。将MIC前所有孔的混合液取5 μ L移入相应新鲜培养基96孔板中， 然后进行培养48h，观察结果，没有混浊可以当做99. 5%的原始种入的细菌被杀死，即为该 菌的最低杀菌浓度（MBC)。结果见表1.
[0077] 表1抗菌肽CC31的最小抑菌浓度（MIC)和最小杀菌浓度（MBC)
[0078]
[0079] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 抗菌肽CC31在枯草芽孢杆菌中的表达方法，其特征在于，包括如下步骤： 51、 抗菌肽基因的合成及克隆载体的构建 511、 设计如下两对四条引物，每对都具有互补序列； Fl-.5'-GCTCTAGAGGTTGGCTGAAAAAAATCGGCAAGAAGATTGA-3, Rl-.5'-ACGGGTATGTTGGCCAACACGTTCAATCTTCTTGCCGATTTTTTTC-3 , F2 ： 5r -ACGTGTTGGCCAACATACCCGTATTATTCCGCTGCCGCTGGGTTATTTTGCGAA-3r R2 :5, -TCCCCCGGGTTAGGTTTTTTTCGCAAAATAACCCAGCGGCAGCG-3' 512、 将引物Fl与RU F2与R2分别进行延伸，得到延伸液PU P2,具体步骤如下：提 前开起PCR仪预热，将2XTaq MasterMix 25yL、上游引物Fl(IOyM) 2yL、下游引物 Rl (10 y M) 2 y URNase-Freewater 21 y L加入到PCR反应管中，混合均匀，瞬时离心后，置 于PCR仪中，反应条件为：94°C预变性2m i n;30个循环；72°C终延伸2m i n，得延伸液P1， 重复以上工艺，得延伸液P2 ; 513、 以第一次PCR得到的相应延伸液Pl与P2相互作为彼此的模板和引物进行PCR， 具体步骤如下：提前开起PCR仪预热，将2XTaq MasterMix 25 yL、Pl 0.5 yL、P2 0.5 yL、 RNase-Freewater 24 y L加入到PCR反应管中，混合均匀，瞬时离心后，置于PCR仪中，反应 条件为：94°C预变性2min ;30个循环；72°C终延伸2min，得抗菌肽基因； 514、 将所得的抗菌肽基因与克隆载体pMD18-T载体连接，在0. 2mL微量离心管中，加入 PMD18-T Vector I y L，胶回收后的抗菌肽基因2 y L，CldH2O 2 y L，Solution 1 (冰上融化） 5yL，全量为IOyL ;混合均匀，瞬时离心后；置于连接仪中，4°C，12h，得pMD 18-T/CC31 ; 515、 将含有表达载体pHT43的大肠杆菌接种到3mL含有10 y g/mL Cm的LB培养基 中，37°C，200rpm振荡过夜培养，提取质粒，将其与-20°C保存的鉴别正确的克隆质粒分别 进行双酶切，酶切体系如下：Xba I In L、Sam I In L、质粒 DNA IOy L、CutSmart Buffer 2yL、灭菌的双蒸水6yL ;酶切反应条件为：37°C水浴，3h，其中质粒DNA分别为：pHT43、 PMD-18T/CC31 质粒； 516、 取上述试剂于PCR反应管中，混匀后瞬时离心，使溶液聚集在试管底部，37°C水浴 3h后，酶切反应完全； 517、 将酶切好的CC31基因片段和酶切后的质粒pHT43进行连接，即可构建成质粒载 体 PHT43/CC31，连接反应体系如下：CC31 基因 6yL、10XT4DNA ligase Buffer IyU质粒 pHT43 2.5 yL、T4 DNA ligase 0.5yL;连接反应条件为：16°C水浴，过夜； 52、 重组表达载体pHT43/CC31转化到宿主细胞中，构建三种表达工程菌菌株； 53、 将步骤S2所得的表达工程菌以IPTG为诱导剂表达，获得表达产物； 54、 分离纯化所得的表达产物，获得抗菌肽蛋白CC31，并检测其正确性。2. 如权利要求1所述的抗菌肽CC31在枯草芽孢杆菌中的表达方法，其特征在于，所述 步骤S2中的宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB800N。3. 如权利要求1所述的抗菌肽CC31在枯草芽孢杆菌中的表达方法，其特征在于，所述 步骤S3中的表达产物为离心上清液。4. 如权利要求1所述的抗菌肽CC31在枯草芽孢杆菌中的表达方法，其特征在于，所述 步骤S4中所述分离纯化采用高效液相色谱法（HPLC)纯化，利用质谱法（MS)检测其正确 性。5. 如权利要求1所述的抗菌肽CC31在枯草芽孢杆菌中的表达方法，其特征在于，所述 步骤S12和步骤S13中的30个循环为：94°C变性30s，63°C退火30s，72°C延伸30s。6. 如权利要求1所述的抗菌肽CC31在枯草芽孢杆菌中的表达方法，其特征在于，所得 的抗菌肽CC31在制备治疗革兰氏阴和/或革兰氏阳性菌疾病药物、动物饲料添加剂中的应 用。
【专利摘要】本发明公开了一种抗菌肽CC31在枯草芽孢杆菌中的表达方法，通过分子生物学技术，选择表达载体pHT43构建重组表达载体，成功构建了重组表达载体pHT43/CC31，将重组表达载体转化到枯草芽孢杆菌WB800N中，得到表达工程菌pHT43/CC31/WB800N。在LB培养基中，经IPTG诱导表达，表达产物采用高效液相色谱法(HPLC)纯化，得到CC31蛋白，利用质谱法(MS)检测其正确性。本发明方法在枯草芽孢杆菌WB800N中表达了抗菌肽CC31，分离纯化简单，易操作。表达产物对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有抗菌活性，对有益菌无抑菌活性，热稳定性好，适于大规模工业化生产，可应用于医药、食品、饲料添加剂以及养殖领域。
【IPC分类】C12R1/125, C12N15/75
【公开号】CN105238809
【申请号】CN201510763093
【发明人】姜宁, 张爱忠, 张晨雪, 朱双, 祁丽, 全佳慧, 黄福佳, 张伟庆
【申请人】黑龙江八一农垦大学
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年11月4日