一种产蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种产蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术：

蔗糖磷酸化酶(ec2.4.1.7，sucrosephosphorylase,spase)，是gh13家族中的一员，是催化转移葡萄糖苷键的特异性酶。主要催化2种类型的反应：一是将1-磷酸葡萄糖中的葡萄糖基转移至受体；二是将蔗糖中的葡萄糖基转移至受体，受体包括无机磷酸、水、含酚羟基、醇羟基及羧基的物质。如以氢醌为受体可生成美白添加剂熊果苷，消除了氢醌作为美白添加剂的毒性作用，以葡萄糖为受体可生成麦芽糖和曲二糖。曲二糖以及曲二糖衍生的低聚糖不易被消化，可以预防龋齿，在肠道系统有很好的耐受性，是双歧杆菌，乳酸菌，真杆菌属的增殖因子，因而是一种很好的益生元成分；同时它也是一种低热量甜味剂，因此可以替代普通的碳水化合物糖类，为肥胖以及糖尿病患者提供一种新的功能性保健甜味剂；曲二糖还能够特异性抑制不同组织器官内α-葡糖苷酶ⅰ活性，具有抗毒性的活性，促进了新药特别是抗hiv-ⅰ新药的产生。蔗糖磷酸化酶还可催化合成某些不稳定物质的衍生物，提高其稳定性。因此，蔗糖磷酸化酶在食品、化妆品及医药方面有广泛的应用价值。

蔗糖磷酸化酶属胞内酶，酶的基因主要来源于肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)、变异链球菌(streptococcusmutans)、嗜糖假单胞菌(pseudomonassaccharophila)、长双歧杆菌(bidifobacteriumlongum)、巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)、青春双歧杆菌(bifidobacteriumadolescentis)b.adolescentis来源的蔗糖磷酸化酶在以蔗糖为糖基供体时，具有很高的活性且受体范围较广，合成曲二糖时具有产物特异性高，转化率高的特点。另一方面，其他菌株来源的蔗糖磷酸化酶不能以葡萄糖为受体合成曲二糖。目前b.adolescentis来源的蔗糖磷酸化酶只在大肠杆菌中获得异源表达，但是大肠杆菌容易产生内毒素，不适合应用于食品工业。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种重组表达b.adolescentis来源的蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以保藏编号为cctccm2016536的枯草芽孢杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)168为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以phycgtd4或pbsmul3为表达载体。

本发明的第二个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将seqidno.2所示的编码蔗糖磷酸化酶的基因与表达载体连接，转入枯草芽孢杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述seqidno.2所示的基因编码seqidno.1所示的蔗糖磷酸化酶。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括保藏编号为cctccm2016536的枯草芽孢杆菌或bacillussubtilis168，bacillussubtiliswb400，bacillussubtiliswb600，bacillussubtiliswb800。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为phycgtd4或pbsmul3；所述phycgtd4已于《high-levelextracellularproteinproductioninbacillussubtilisusinganoptimizeddual-promoterexpressionsystem》的表2中公开；所述pbsmul3的核苷酸序列如seqidno.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法具体如下：

1)扩增seqidno.1所示的蔗糖磷酸化酶基因；

2)将克隆出的目的基因seqidno.1连接到pmd18t，构建成为重组载体pmd18t-sp，转化至e.colijm109进一步克隆，酶切后将目的基因连接到表达载体pbsmul3，命名为pbsmul3-sp。

3)将重组质粒pbsmul3-sp通过电转化进入枯草芽孢杆菌表达宿主，获得枯草芽孢杆菌蔗糖磷酸化酶基因工程菌。

本发明的第三个目的是提供一种产蔗糖磷酸化酶的方法，所述方法是将所述重组芽孢杆菌接种至发酵培养基中，于30～35℃，200～250rpm培养24～72h。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为lb培养基。

本发明的第四个目的是提供一种产曲二糖的方法，所述方法是将所述重组枯草芽孢杆菌的发酵液离心得到粗酶液。以0.5mol/l蔗糖和0.5mol/l葡萄糖为底物，加酶量为0.25u/mol底物，于50～55℃，ph7.0～7.2反应12～48h。

本发明的第五个目的是提供一种蔗糖磷酸化酶，，氨基酸序列如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如seqidno.1所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有蔗糖磷酸化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明还提供所述重组枯草芽孢杆菌在食品、医药、化工领域的应用。

有益效果：本发明以食品准入的枯草芽孢杆菌为宿主构建了表达b.adolescentis来源的蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌，酶活达1.577u/ml，应用该重组菌生产曲二糖，反应36h时底物转化率达56％，为曲二糖的工业化制备奠定了基础。

附图说明

图1重组质粒pbsmul3-sp的构建过程图；

图2pmd18t-sp双酶切验证图；从左至右，泳道1为5000marker，2-3为蔗糖磷酸化酶连接表达载体酶切验证

图3pbsmul3-sp重组质粒的双酶切验证图；从左至右，泳道1～3为蔗糖磷酸化酶连接表达载体酶切验证，泳道4为10000bpmarker。

图4pbsmul3-sp重组菌摇瓶发酵sds-page电泳图，左侧12～24h为蔗糖磷酸化酶胞外上清；右侧12～24h黑色为破壁上清；

图5最高转化率的酶转化hplc色谱图。

具体实施方式

酶活的测定方法：将1ml5％的蔗糖溶液和0.9ml的50mmol/l，ph6.7的磷酸缓冲液充分混匀，在55℃预热10min,加入100ul的酶液，反应10min后加入3mldns，煮沸7min迅速冷却，加蒸馏水定容至15ml，540nm下测吸光度(以灭活的酶液为催化剂同样操作作为空白对照)。

酶活定义：将每分钟水解蔗糖糖生成1μmol的果糖所需酶量定义为蔗糖磷酸化酶的一个单位的酶活力(u)。

产物的hplc检测：最终反应体系中的蔗糖、葡萄糖、果糖、、乳糖以及单糖的量采用hplc来确定。色谱条件为：agilent1200hplc色谱仪，agilent自动进样器，色谱柱nh2-504e(4.6mm×250mm)，示差检测器为安捷伦g1362a；流动相采用75％(v/v)乙腈和水的混合溶液，流速为0.8ml/min，柱温设定为35℃。采用外标法，根据保留时间和峰面积确定相应低聚乳果糖的浓度。

转化率按公式计算：

实施例1青春双歧杆菌蔗糖磷酸化酶编码基因的克隆及表达载体的构建

按图1的流程进行表达载体的构建，根据合成的蔗糖磷酸化酶基因设计引物d-f、d-r：

d-f：5’-gcgaagcttaaggaggatattatgaaaaacaaagttcagctgat-3’

d-r：5’-gcgggatccttaagcaacaactggaggattgg-3’

所述限制性酶切位点加下划线的字母表示。pcr体系为：20μm引物dzm-f和dzm-r各0.5μl，dntpmix4μl，5×psbuffer10μl，2.5u/μl的primestar聚合酶0.5ul，模板0.5μl，加双蒸水补齐50μl。pcr条件：94℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1min50s，30个循环。将pcr产物进行胶回收、加a纯化后与克隆载体pmd18t连接，酶切回收目的基因将其与表达载体pbsmul3进行双酶切，并于16℃连接过夜，转化e.colijm109，涂布含有氨苄(100μg/ml)抗性的lb平板，37℃培养10-12h，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证。如图3所示，酶切后有两条片段，大小分别为7000bp左右(表达载体pbsmul3)和1512bp(蔗糖磷酸化酶)即连接成功。然后对验证正确的重组质粒测定dna序列，阳性克隆子即pbsmul3-sp。

实施例2重组质粒pbsmul3-sp的转化

1)新鲜lb平板(lb固体培养基：蛋白胨10g/l，酵母膏5，nacl10g/l，0.2g/l琼脂粉)挑枯草芽孢杆菌bacillussubtilis(保藏编号为cctccm2016536)单菌落接种于5mllb液体培养基中，37℃，200rpm培养10.5h。

2)取2.5ml转接入40ml加0.5m的山梨醇lb培养基，37℃，200rpm震荡培养四个半小时。

3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm，4℃，离心5min收集菌体。

4)用40ml预冷的电转缓冲液(山梨醇0.5m，甘露醇0.5m，葡萄糖10％)洗涤菌体，5000rpm，4℃，离心5min去上清，如此漂洗4次。

5)将洗涤后的菌体重悬于1ml电转培养基中，分装到1.5mlep管中，每管装300ul感受态细胞。

6)将300μl感受态细胞中加入10μl重组质粒，冰浴孵育15min，加入预冷的电转杯(2mm)中，电击一次。电转仪设置：2.4kv，25uf，200ω，电击1次。

7)电击完毕立即加入1ml复苏培养基rm(山梨醇0.5m，甘露醇0.38m，蛋白胨10g/l，酵母膏5，nacl10g/l)吹吸，37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养，挑取菌落至lb卡那霉素培养基中，进行验证，酶切后表达载体和目的基因条带大小一一对应即验证正确，然后进行摇瓶发酵产酶。

实施例3摇瓶发酵产酶

将实施例2中得到的重组枯草芽孢杆菌菌株接种于lb培养基中，在37℃下培养8h后以5％接种量转接至tb发酵培养基中，先放至37℃、200rpm恒温培养2h，再移至33℃恒温培养48h产酶。发酵结束后，离心收集上清液即为粗酶液。

lb培养基(g/l)：蛋白胨10g/l，酵母膏5，nacl10g/l

tb培养基(g/l)：蛋白胨10，酵母粉24，甘油5，k2hpo4·3h2o16.43，kh2po42.31。

对粗酶液中的酶活进行测定，结果显示，酶活力为1.577u/ml，蛋白含量蛋白含量2.15mg/ml。蛋白电泳结果显示在56kda处有一条与理论分子量一致的条带(图4)。

实施例4酶转化法制备曲二糖

在初始反应温度55℃，以0.5m蔗糖和0.5m葡萄糖为底物，加酶量为0.25u/mol底物。设置水浴摇床温度为55℃、转速150r/min，从第24h开始每隔12h取样煮沸终止反应，直至反应达到平衡。产物用hplc进行检测。当反应结束(反应36h)后转化率可达到56％，色谱峰图见图5。

实施例5

采用实施例1～3相同策略构建重组枯草芽孢杆菌，区别在于，将载体替换为phycgtd4(已于《high-levelextracellularproteinproductioninbacillussubtilisusinganoptimizeddual-promoterexpressionsystem》的表2中公开)，所示，经检测，酶活达1.438u/ml。

实施例6

采用实施例1～3相同策略构建重组枯草芽孢杆菌，区别在于，将宿主替换为枯草芽孢杆菌168，经检测，酶活达1.121u/ml。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

<120>一种产蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用

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