一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌及其制备方法与流程

技术领域：

本发明属于微生物学领域，涉及一种单核细胞增生李斯特氏菌，具体来说是一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌及其制备方法。

背景技术：
：

单核细胞增生李斯特氏菌(listeriamonocytogenes，lm)是一种营细胞内寄生的人畜共患的食源性致病菌，广泛存在于生鲜或即食食品中。lm可穿透人体的三大屏障——肠道屏障、血脑屏障和胎盘屏障，导致肠炎、脑膜炎、流产，因此是研究胞内寄生菌与宿主之间的相互作用的重要模式菌。在寄生及繁殖的不同阶段中，lm有多个毒力因子来协助其进行机体的感染继而发挥致病作用，目前已发现多个与lm致病性与毒力相关因子其中多是表面蛋白或者是分泌蛋白。编码这些蛋白的毒力基因(hly，plca，plcb，mpl，acta，inla和inlb)主要位于细菌染色体上的两个毒力岛上。其中hly基因编码的溶菌素(listeriolysiono，llo)是一个主要毒力因子。

llo是一种由529个氨基酸组成具有溶血活性的成孔蛋白，属胆固醇依赖性溶细胞素家族的成员。它在lm从初级和次级吞噬体逃逸中以及在宿主细胞质中的增殖中都起到关键的作用。基于hly基因在lm致病性中起到的重要作用，构建lm的hly缺失减毒菌株不仅对于研究开发lm减毒疫苗研究等有重要意义。而且，对于研究llo在细胞内囊泡逃逸过程及其在lm在细胞与细胞间的感染机理具有一定指导意义。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌及其制备方法，所述的这种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌及其制备方法要解决现有技术中的没有合适的单核细胞增生李斯特氏菌用于减毒疫苗的技术问题。

本发明提供了一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌，所述的这种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌缺失hly基因。

进一步的，所述的基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌的保藏编号为：cctccm2016523。

本发明还提供了一种疫苗，含有上述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌。

本发明还提供了一种抗体，由上述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌免疫产生。

本发明还提供了上述基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌的制备方法，包括如下步骤：

1)分别使用hly5′f、hly5′r、hly3′f和hly3′r引物以egd-e基因组为模板扩增hly基因的上游片段p1/p2、下游片段p3/p4；

2)得到的pcr片段电泳后割胶回收，使用酶xbali对片段进行单酶切，并电泳割胶回收，产物使用t4dna连接酶连接，得到的上下游连接产物与pmd19-tvector连接并转化至dh5α感受态细胞中，得到的菌悬液涂布于含100μl/mlamp平板上，37℃培养，挑取单菌落扩大培养后进行pcr鉴定，对应的阳性克隆菌液使用质粒抽提试剂盒抽提质粒；

3)将连有同源臂的pmd19-tvector与pksv7质粒使用相同的限制性内切酶smai和sali进行双酶切，产物使用t4dna连接酶连接并导入lm感受态细胞，将阳性克隆的质粒抽提后进行smai和sali限制性内切酶双酶切，获得hly基因缺失的lm减毒菌株。

本发明在构建单核细胞增生李斯特氏菌减毒菌株菌株的过程中，首先利用同源重组技术对标准菌株egd-e进行减毒得到李斯特减毒菌株egd-e△hly。然后并从生长状态、溶血、毒力基因转录水平、宿主致死率等方面研究hly基因缺失菌株的生物特性，为食源性致病菌lm致病机理研究提供基础。

上述构建的基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌的保藏编号为：cctccno:m2016523；菌株名称为：单核细胞增生李斯特氏菌egd-e(hly基因缺失)listeriamonocytogenesegd-e(hly基因缺失)，保藏日期：2016年9月26日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址为：中国武汉武汉大学，邮编：430072。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明构建的hly基因缺失菌株生长速率与egd-e无差异；hly基因缺失后，该缺失菌株与egd-e有显著性差异，溶血性降低。hly基因敲除还导致inlc和prfa基因转录水平的下调，基因plcb，vip的上调。同时，通过实验证明，hly基因敲除后的突变菌株毒性下降。

附图说明

图1显示了egd-e△hly的构建原理。

图2显示了hly上下游片段的克隆图，其中a为hly5′片段和3′片段的pcr扩增结果；b为5′片段与3′片段连接到pmd-19t后的菌落pcr鉴定结果。

图3显示了pksv7重组质粒鉴定结果(m：marker)。

图4显示了egd-e△hly的鉴定结果(m：marker；1-9为鉴定菌株，10为阳性对照)。

图5为egd-e△hly的生长曲线测定结果。

图6为溶血实验结果(nc为阴性对照，pc为阳性对照pc)。

图7为毒力基因realtime-pcr测定结果。

图8为egd-e△hly与egd-e的毒力测定结果，其中a为细胞侵袭效率；b为小鼠存活率(其中pbs组小鼠存活率始终为100％)。

具体实施方式

各个实验采用的试剂盒用量如下：

反转录反应

1.基因组dna的去除

2.反转录反应

realtime-pcr反应

实施例1一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌的构建

挑取egd-e(atccbaa-679)单菌落过夜摇床培养，使用天根生化科技(北京)有限公司细菌基因组提取试剂盒(no：dp302-02)获得egd-e基因组，分别使用hly5′f、hly5′r、hly3′f和hly3′r引物以egd-e基因组为模板扩增hly基因的上游片段p1/p2(seqidno.27)、下游片段p3/p4(seqidno.28)。得到的pcr片段电泳后割胶回收，使用酶xbali对片段进行单酶切，并电泳割胶回收。产物使用t4dna连接酶连接，得到的上下游连接产物与pmd19-tvector连接并转化至dh5α感受态细胞中，得到的菌悬液涂布于含100μl/mlamp平板上，37℃培养。挑取单菌落扩大培养后进行pcr鉴定，对应的阳性克隆菌液使用质粒抽提试剂盒抽提质粒。

将上述连有同源臂的pmd19-tvector与pksv7质粒使用相应的限制性内切酶smai和sali进行双酶切，产物使用t4dna连接酶连接并导入lm感受态细胞。将阳性克隆的质粒抽提后进行smai和sali限制性内切酶双酶切鉴定并测序，测序过程由华大基因公司完成，将序列比对正确的脱盐质粒与lm感受态混匀，每200μllm(1×1011cfu/ml)感受态的质粒用量约1μg，电转化条件2.25kv/cm，4ms。

电转后将感受态细胞转入3-5ml的bhi培养基中振荡培养约2h，离心收集菌体后涂布于含10μg/mlcam的bhi平板于30℃培养，挑取菌落进行鉴定，将含有重组质粒的阳性克隆转接到bhi(含10μg/mlcam)液体培养基中41℃按1：100连续转接10次，将末代细菌培养物划线于bhi(含10μg/mlcam)平板上41℃过夜培养；挑取bhi(含10μg/mlcam)平板上的单菌落于bhi液体培养基中30℃连续培养并按1:100转接8次，取末代培养物划线于bhi平板，30℃过夜培养；挑取单菌落进行pcr鉴定将疑似突变株分别划线于抗性平板和非抗性平板，含cam的抗性bhi平板上不生长，无抗性bhi平板上可生长的为疑似突变株，对疑似变株使用引物hlykof、hlykor进行鉴定以确定突变株。减毒株egd-e△hly的构建原理如图1所示。

表1引物序列

注：hly5′f和hly5′r为hly基因上游片段引物，hly3′f和hly′r为hly基因下游片段引物；下划线标注酶切位点序列。

对上述构建的基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌进行了保藏，保藏编号为：cctccno:m2016523；菌株名称为：单核细胞增生李斯特氏菌egd-e(hly基因缺失)listeriamonocytogenesegd-e(hly基因缺失)，保藏日期：2016年9月26日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)。

实施例2对菌株的鉴定

使用hly5′f、hly5′r、hly3′f、hly3′r(表1)引物扩增同源臂p1/p2、p3/p4(序列见seqidno.27和seqidno.28)，连接pmd-19t，pcr鉴定hly(p1/p4)片段与质粒pmd-19t的连接；使用smai和sali对扩增得到pmd-19t以及pksv7质粒进行双酶切，得到的hly(p1/p4)与酶切后的pksv7连接、鉴定，鉴定为阳性的克隆由上海华大基因科技有限公司测序，将测序正确的阳性克隆命名为pksv7-hly(p1/p4)。电转化后利用引物hlykof与hlykor(表1)及涂布无抗性平板对突变株进行鉴定，鉴定结果为阳性的菌株命名为egd-e△hly。

实施例3本发明菌株的鉴定结果如下：

1.上下游同源臂的扩增及连接pmd-19t鉴定结果：

使用hly5′和hly3′引物扩增同源臂pcr凝胶电泳结果如图2a，hly5′片段条带位置在900bp左右，hly3′片段条带位置在700左右。按照ncbi上提供的序列，两个条带应分别为880bp，724bp，结果符合预期。图2b为hly5′和hly3′片段连接到pmd-19t后导入大肠杆菌的菌落pcr鉴定结果，共挑取6个菌落，其中4、5泳道出现阳性条带，条带位置与预期目标条带1604bp相符，说明连接成功。

2.重组质粒的鉴定结果：

鉴定实验使用引物hly5′f和hly3′r，鉴定结果如图3，1-4泳道以及6、7泳道有明显扩增条带，条带位置在1600bp左右，与理论值为1604bp相符，说明hly上下游连接片段hly(p1/p4)已经成功插入质粒pksv7中。质粒测序结果也表明重组质粒构建成功。

3.减毒菌株egd-e△hly的鉴定结果

使用hly基因上引物hlykof与hlykor，经pcr扩增、鉴定，hly基因缺失菌株无扩增条带，而没有发生重组的菌株经扩增、凝胶电泳会出现对应的理论值为535bp的条带。如图4所示，1、5、9泳道无扩增条带，其对应的菌株为阳性转化子，其中10泳道为阳性对照。阳性转化子分别涂布于抗性平板和非抗性平板，在含氯霉素的抗性平板上无菌落生长，在无氯霉素抗性的bhi平板上有菌落生长。

综合以上鉴定结果说明质粒携带的外源基因已经与自身基因组完成基因重组，且质粒已经丢失，将阳性转化子命名为egd-e△hly。

实施例4

本发明为考察egd-e△hly基因缺失菌株的生长状况变化，以egd-e为对照测定了egd-e△hly的生长曲线。具体方法如下：挑取egd-e与egd-e△hly单菌落于bhi液体培养基中摇床过夜培养，按1:100转接至装100ml新鲜bhi培养基的锥形瓶中，37℃、200r/min培养，每1h取200μl于酶标板中测定od600光密度值，共记录12h，得到的数据绘制生长曲线。

测定结果如下：如图5，egd-e△hly突变菌株与egd-e生长曲线基本重合，前3小时为生长初期，后经历对数期，并在第10小时到达稳定期各时期的生长速率无差异。说明hly基因的缺失对egd-e的生长不造成影响。

实施例5

本发明为考察egd-e△hly缺失菌株的溶血活性变化，对溶血活性进行测定。具体方法如下：挑取egd-e、egd-e△hly、英诺克李斯特菌(listeriainnocua，li)的单菌落于bhi中培养至稳定生长早期(od600≈0.6)。将lm培养物5500rmp4℃离心10min。取0.1ml上清液样品加入到1ml溶血素缓冲液(0.145mol/lnacl，0.02mol/lcacl2)中，并加入0.025ml脱纤维羊血。设置阴性对照(negativecontrol,nc)和阳性对照(positivecontrol，pc)，其中将0.1ml培养基用作阴性对照，0.1ml1％triton-100x作为阳性对照。将混合物于37℃培养箱孵育30分钟，5500r/min离心10min。使用分光光度计测定上清液的od540值。

如图6所示，测定结果如下：如图egd-e△hly与egd-e有显著性差异，溶血性降低。

实施例6

本发明为考察hly基因缺失后对其他毒力基因的影响，使用realtime-pcr方法在转录表达水平对其他毒力基因进行了测定。具体方法如下：取5ml过夜培养的egd-e、egd-e△hly菌液中加入1ml预冷的苯酚乙醇混合液(苯酚：乙醇＝1:9)，冰浴30min；离心收集菌体后加入50μl变溶菌素(250u/ml)和50μl溶菌酶(25mg/ml)37℃水浴30min；然后加入1mltrizol，离心后转移上清并加入200μl三氯甲烷，手摇震荡15s呈乳浊液后室温放置2min；离心转移上层水相并加入等体积异丙醇后缓慢摇动，室温放置5-10min；离心弃上清后加入1ml75％乙醇清洗沉淀，晾干乙醇，用30-60μldepc水溶解沉淀。获得的rna根据takara反转录试剂盒(takaracode：drr047a)进行反转录成cdna(其中包括基因组dna的去除反应)，以cdna为模板进行sybrgreen荧光染料法realtime-pcr。各毒力基因转录水平变化计算方法为：以lm的16s核糖体rna为内参基因，假设扩增效率统一为100％，各毒力基因的ct值减去内参基因16s的ct得到△ct，突变菌株的△ct减去野生型菌株△ct得到△△ct，则各基因相对表达量增高了2^-△△ct倍。基因名称及引物详细序列见表2。

表2realtime-pcr引物序列

测定结果如下：如图7，其中hly基因信号值较低，与对照组有显著差异(p<0.001)，验证hly基因成功敲除，同时hly敲除还导致inlc和prfa基因的下调，数值分别降为0.19和0.24，下降了4.2倍和3倍。相反的，基因plcb，vip表现上调，与对照组有显著性差异(p<0.001)，表达量分别是对照组的2.8倍和4倍。

实施例7

本发明为考察hly基因缺失后毒力变化对egd-e△hly进行了caco-2细胞侵袭实验以及小鼠致死率测定。具体方法如下：1)caco-2细胞侵袭实验胰酶消化下的caco-2细胞，使用含20％fbs的dmem重悬，准确计数后均匀平铺12孔板底部，2.0×10⁵cells/孔，放置于细胞培养箱(37℃，2.5％co2)过夜。取对数生长期的细菌，按moi＝100:1接种于孔板中共培养2h。每孔更换0.5ml200μg/ml含20％fbs的dmem配置的的庆大霉素溶液，于37℃培养箱中30min以清除胞外菌。吸出庆大霉素溶液，使用pbs洗2次，每孔加入1ml1％triton^tmx-100充分吹打，收集于1.5ml无菌离心管中，稀释后取100μl涂布于bhi固体培养板中，37℃培养箱中培养24h后计数统计。2)小鼠致死率测定取对数生长期的egd-e、egd-e△hly离心收集，使用无菌pbs重悬配置成浓度为10⁷cells/ml菌悬液。3组6-8周龄balb/c小鼠，每组8只，每只腹腔注射200μl菌悬液，其中对照组注射200μlpbs，每天记录小鼠死亡状况。

测定结果如下：egd-e△hly缺失菌株细胞侵袭实验结果如图8a所示，egd-e△hly小鼠致死结果如图8b，hly基因敲除后，细胞实验检测到的菌落显著降低，小鼠致死结果与对照组(pbs注射组)一致，均未出现小鼠死亡现象。说明hly基因敲除后，egd-e的毒性下降。

实施例8

毒力因子李斯特菌溶素o(llo)缺失使得lm的菌株毒性降低，安全性提高。使用单核增生性李斯特氏菌hly基因缺失菌株免疫小鼠，2×10⁵cell/只，静脉注射。感染后7天，检测小鼠体内的ifn-γ和cd8+t细胞，结果显示ifn-γ量增加，cd8+t细胞数量大量增加，说明小鼠体内的细胞免疫被激发。同时使用野生型egde菌株感染小鼠，小鼠的死亡率降低，说明lmδhly可以用于毒性lm引发的小鼠感染，对lm具有抗性。基于lmδhly的保护性免疫，可开发lmδhly用于疫苗载体。

序列表

<110>上海理工大学

<120>一种基因敲除减毒单增李斯特菌及其制备方法

<160>28

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>29

<212>dna

<213>hly5′f

<400>1

attcccgggccgcggacatcttttaatgt29

<210>2

<211>29

<212>dna

<213>hly5′r

<400>2

atttctagatttgttgcgcaattggtaga29

<210>3

<211>29

<212>dna

<213>hly3′f

<400>3

atttctagacaccacgctttatccgaaat29

<210>4

<211>29

<212>dna

<213>hly3′r

<400>4

attgtcgacaagctgtccttgctgcaaat29

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>hlykof

<400>5

tgacgaaatggcttacagtg20

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>hlykor

<400>6

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<210>7

<211>21

<212>dna

<213>16s正向引物

<400>7

acatcctttgaccactctgga21

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>16s反向引物

<400>8

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<210>9

<211>20

<212>dna

<213>prfa正向引物

<400>9

ggctctatttgcggtcaact20

<210>10

<211>19

<212>dna

<213>prfa反向引物

<400>10

gctatgtgcgatgccactt19

<210>11

<211>21

<212>dna

<213>hly正向引物

<400>11

cagcattgatttgccaggtat21

<210>12

<211>21

<212>dna

<213>hly反向引物

<400>12

tcactgtaagccatttcgtca21

<210>13

<211>19

<212>dna

<213>inla正向引物

<400>13

tgtggacggcaaagaaaca19

<210>14

<211>21

<212>dna

<213>inla反向引物

<400>14

ccaaccaacaaatgtgtgacc21

<210>15

<211>21

<212>dna

<213>inlb正向引物

<400>15

gcaggcatctacaaacttcca21

<210>16

<211>19

<212>dna

<213>inlb反向引物

<400>16

gccatttcgggcttctcta19

<210>17

<211>22

<212>dna

<213>plca正向引物

<400>17

actacaatggtccgagtgtgaa22

<210>18

<211>21

<212>dna

<213>plca反向引物

<400>18

cagcatactgacgaggtgtga21

<210>19

<211>19

<212>dna

<213>plcb正向引物

<400>19

gcaaatgcctgttgtgatg19

<210>20

<211>22

<212>dna

<213>plcb反向引物

<400>20

cgtcagtatttgtcgggttatc22

<210>21

<211>20

<212>dna

<213>acta正向引物

<400>21

aggcggtagaccaacatctg20

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>acta反向引物

<400>22

cccgcatttcttgagtgttt20

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>srta正向引物

<400>23

cgcagttccatctgtagacg20

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>srta反向引物

<400>24

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<210>25

<211>18

<212>dna

<213>sigb正向引物

<400>25

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<210>26

<211>20

<212>dna

<213>sigb反向引物

<400>26

tcgggcgatggactctacta20

<210>27

<211>880

<212>dna

<213>p1/p2序列

<400>27

ccgcggacatcttttaatgtagggattttattgctcgtgtcagttctgggagtagtgtaa60

aaataatctttataaatgttgattagtggttggatccgataatcaaaactatcgttgctg120

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gtaatcgtttctaatacacctgaaagtgatgcatttaaaaaaattggcccatggtaaatg240

ttgagattgtcttttgctctaatatcgatgtaccgtattcctgcttctagttgttggtac300

aatgacatcgtttgtgtttgagctagtggtttggttaatgtccatgttatgtctccgtta360

tagctcatcgtatcatgtgtacctggtatagagagcgctgctaggtttgttgtgtcaggt420

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agcgaatatgcttttccgcctaatgggaaagtaaaaaagtataaaataaaacagagtaat540

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attcctatcttaaagtgacttttatgttgaggcattaacatttgttaacgacgataaagg660

gacagcaggactagaataaagctataaagcaagcatataatattgcgtttcatctttaga720

agcgaatttcgccaatattataattatcaaaagagaggggtggcaaacggtatttggcat780

tattaggttaaaaaatgtagaaggagagtgaaacccatgaaaaaaataatgctagttttt840

attacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaa880

<210>28

<211>724

<212>dna

<213>p3/p4序列

<400>28

caccacgctttatccgaaatatagtaataaagtagataatccaatcgaataattgtaaaa60

gtaataaaaaattaagaataaaaccgcttaacacacacgaaaaaataagcttgttttgca120

ctcttcgtaaattattttgtgaagaatgtagaaacaggcttattttttaatttttttaga180

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aagtttaagccacctatagtttctactgcaaaacgtataatttagttcccacatatacta300

aaaaacgtgtccttaactctctctgtcagattagttgtaggtggcttaaacttagtttta360

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gctt724