本发明涉及生物制药技术领域，特别是涉及一种布氏菌活疫苗s2菌体的高密度发酵方法。
背景技术：
布氏菌病是由布鲁氏菌引起的人畜共患传染病，临床上主要表现为波状热、流产、关节炎等。布氏菌病不但影响人体健康，摧残劳动力，还严重影响畜牧业的发展。牛、羊、猪等主要家畜感染布氏菌病后，会发生大量流产、不孕、不育、死胎等，致使牲畜数量锐减，造成严重经济损失，并严重影响相关从业人员的身体健康。目前，国内外主要通过给家畜使用布氏菌病活疫苗预防布氏菌病。
细菌病活疫苗是由菌株制备得到，对应的，现在一般采用s2菌株制备布氏菌病活疫苗，得到布氏菌病活疫苗s2菌体。目前布氏菌病活疫苗的制备方法是将菌株逐级发酵培养繁殖，将最终发酵后的菌体进行浓缩，冻干制成疫苗，主要包括以下步骤：菌株→一级种子制备→二级种子制备→制苗菌体制备→菌体浓缩→菌体冻干→疫苗成品包装。
在生产布氏菌病活疫苗的过程中，核心是上述步骤中的制苗菌体制备，即在二级种子的基础上大规模发酵培养制苗菌体。布氏菌病活疫苗的s2菌体为需氧型微生物，发酵时需通气培养，在培养过程中消耗的营养物及氧气量较大，因此，合理使用培养基、补充营养物及调节通气量是影响发酵结果的至关重要的因素。目前，传统培养方法使用自制马丁肉汤(主要成份是牛肉汤、猪胃消化液和氯化钠，详见《兽用生物制品制造及检验规程》)等普通培养基，在发酵过程中不调整发酵参数，发酵菌数仅有2×1010cfu/ml左右，发酵菌数较低。
细菌高密度发酵(high-densityfermentation)是进行细菌活疫苗生产时较传统发酵工艺而言使用的新型发酵工艺，是指利用一定的发酵装置，通过综合优化的发酵培养技术，提高单位体积内菌体的浓度，从而提高产量，降低生产成本。目前还没有将细菌高密度发酵用于布氏菌病活疫苗发酵的报道。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，提供一种提高疫苗产量的布氏菌病活疫苗s2菌体的高密度发酵方法，包括使用布鲁氏杆菌s2菌株进行一级种子的制备、二级种子的制备、制苗菌体的制备，得到菌体浓度为5-7×1010cfu/ml的布氏菌s2菌体的高密度发酵液。
所述制苗菌体的制备具体为：在发酵罐中加入胰蛋白胨肉汤培养基，调整ph值至7.0得到制苗培养基，灭菌后接种二级种子液，接种体积为所述制苗培养基体积的2-3％，连续通气培养36-40小时。
所述制苗菌体的制备中所述连续通气培养分为三个阶段，三个阶段中培养时间、通气量、搅拌转速均不相同。
所述三个阶段中的第一阶段培养时间为8-10小时，通气量为150-200l/min，搅拌转速为100-200r/min；优选的，培养时间为8-9小时，通气量为160-180l/min，搅拌转速为160-180r/min；最优选，培养时间为9小时，通气量为160l/min，搅拌转速为160r/min。
所述三个阶段中的第二阶段培养时间为17-19小时，通气量为400-500l/min，搅拌转速为400-500r/min；优选的，培养时间为17-18小时，通气量为430-470l/min，搅拌转速为470-490r/min；最优选，培养时间为18小时，通气量为470l/min，搅拌转速为470r/min。
所述三个阶段中的第三阶段培养时间为9-11小时，通气量为300-400l/min，搅拌转速为300-400r/min；优选的，培养时间为9-10小时，通气量为360-380l/min，搅拌转速为370-390r/min；最优选，培养时间为9小时，通气量为380l/min，搅拌转速为370r/min。
所述制苗菌体的制备中连续通气培养18-20小时(优选18小时)后补加营养液，所述营养液的补加体积量为制苗培养基和二级种子液总体积的2.5-3％(优选2.5-2.8％，最优选2.8％)。
所述营养液按质量百分含量包括5-10wt％柠檬酸，2-8wt％乳酸，16-20wt％葡萄糖和余量的水；优选包括6-9wt％柠檬酸，4-7wt％乳酸，17-19wt％葡萄糖和余量的水；最优选包括6wt％柠檬酸，4wt％乳酸，19wt％葡萄糖和余量的水。
所述二级种子的制备具体为：
向种子罐中加入胰蛋白胨肉汤培养基(包括4wt％的胰蛋白胨肉汤干粉和余量的水)，用5m氢氧化钠溶液调整ph值至7.0，121℃灭菌40分钟后降温至37℃，接种一级种子液，连续通气培养36-40小时，通气量为40-50l/min，制备得到二级种子液。
所述一级种子的制备具体为：
取发酵菌s2菌种接种于扁瓶胰蛋白大豆琼脂固体培养基，36.5℃-37℃静止培养48-72h后用50ml蛋白胨水将菌体洗下，得到一级种子液。
本发明提供的布氏菌病活疫苗s2菌体的高密度发酵方法将细菌高密度发酵法用于发酵布鲁氏菌菌体，在发酵过程中使用胰蛋白胨肉汤作为培养基，并通过自控程序补加营养液，营养液独特的配比既能为菌体补充营养又能调节ph值，同时本发明优化了发酵过程的搅拌转速、通气量等参数，实现了对布氏菌s2菌体的高密度发酵，发酵液单位体积内菌体可达到5-7×1010cfu/ml，较传统发酵方法提高3倍左右，提高单位体积内菌体的浓度，从而可以提高培养基的利用率,提高疫苗产量，降低疫苗生产成本。
附图说明
图1所示为本发明实施例与比较例的菌数浓度生长曲线对比图。
具体实施方式
高密度发酵过程中影响发酵效果的因素非常多,如细菌生长所需的营养物质、接种密度、培养时间、发酵罐的搅拌转速、发酵罐的通气量、溶氧浓度、培养温度、发酵液的ph值以及补加营养液的方式等都会影响最终的发酵结果。
本发明的发明人经过长期探索，针对生产布氏菌病活疫苗s2菌体，发现在其他条件不变的前提下，通过优化控制培养时的搅拌转速、发酵罐的通气量、营养液的配方及营养液的补加方式等参数实现了对布氏菌s2菌体的高密度发酵。
本发明提供的布氏菌病活疫苗s2菌体的高密度发酵方法，包括以下步骤：
a.一级种子的制备
取发酵菌s2菌种1支接种于75cm2扁瓶tsa(胰蛋白大豆琼脂)固体培养基，36.5℃-37℃静止培养48-72h，之后用50ml蛋白胨水(包括1wt％的蛋白胨,0.5wt％的氯化钠和余量的水)将菌体洗下，得到一级种子液。
b.二级种子的制备
50l种子罐加入30l胰蛋白胨肉汤培养基(包括4wt％的胰蛋白胨肉汤干粉和余量的水)，用5m氢氧化钠溶液调整ph值至7.0，121℃灭菌40分钟，之后降温至37℃，接种步骤a得到的一级种子液50ml，连续通气培养36-40小时，通气量为40-50l/min恒定不变，发酵过程中不补液，当胰蛋白胨肉汤培养基中的溶氧值上升至90％时，停止发酵，得到二级种子液。
c.制苗菌体的制备
1500l发酵罐加入1000l胰蛋白胨肉汤培养基(组成同步骤b)，用5m氢氧化钠溶液调整ph值至7.0得到制苗培养基，121℃灭菌50分钟，之后降温至37℃，接种步骤b得到的二级种子液，接种体积为制苗培养基体积的2-3％，连续通气培养36-40小时，连续通气培养过程分以下三个阶段：
第一阶段：前8-10小时通气量为150-200l/min，搅拌转速为100-200r/min；
第二阶段：中间17-19小时通气量为400-500l/min，搅拌转速为400-500r/min；
第三阶段：后9-11小时通气量为300-400l/min，搅拌转速为300-400r/min。
在连续通气培养18-20小时后开始补加营养液，营养液的补加体积为培养液总体积(即配苗培养基与二级种子液混合的体积)的2.5％-3％。营养液配方包括：柠檬酸50-100g，乳酸20-80g，葡萄糖160-200g，蒸馏水1000ml，充分溶解。
补液通过自控程序控制流加量，随着发酵液的ph值升高的快慢补加相应量的营养液。当发酵液ph值不再上升，菌体耗氧量下降，溶氧值上升至90％时，停止通气，终止发酵，得到布氏菌s2菌体的高密度发酵液。
以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。
以下实施例中tsa培养基(购自碧迪医疗器械(上海)有限公司)和胰蛋白胨肉汤培养基(购自偃师市百家工贸有限公司)均为商品化干粉培养基。
本发明的高密度发酵方法中各步骤的参数见表1所示。
表1本发明的高密度发酵方法中各步骤的参数
为了突出本发明的高密度发酵方法的优异效果，用现有方法(如比较例1)、及方法步骤按照本发明但是参数不在本发明范围内的比较例进行布氏菌s2菌体的发酵，其中各步骤的参数如表2所示。
表2各比较例方法中各步骤的参数
从表2可以看出，用以上对比例的发酵方法得到的菌体浓度均偏低，明显低于本发明的实施例。
从比较例1可知，步骤c使用传统自制的马丁肉汤培养基得到的发酵菌数最少；实施例1和5与比较例1的菌数浓度生长曲线对比图见图1。改用本发明的胰蛋白胨肉汤培养基(比较例2)，得到的发酵菌数较少，但较比较例1多，其原因主要是胰蛋白胨肉汤培养基为化学合成培养基，其成份配比科学，营养合理，成份稳定，而马丁肉汤培养基为自制培养基，成份单一，较不稳定，故在其它条件相同的情况下胰蛋白胨肉汤培养基较马丁肉汤培养基发酵的菌数多。
比较例3-8的步骤c使用本发明用的胰蛋白胨肉汤培养基，并采用本发明的三阶段发酵方法，同时在发酵过程中补加了营养液，可以看出比较例3-8较比较例2得到的菌数多。但比较例3-8中步骤c采用的发酵参数都偏离本发明的发酵参数范围，因此比较例3-8的菌数结果较上面的实施例低。
比较例9较本发明方法缺乏补加营养液的步骤，因此其菌数结果偏低。比较例10和11虽然按照本发明的方法实施，但补加的营养液配比不在本发明方法的合理范围内，因此其菌数结果也偏低。
以上所述实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。