本发明涉及微生物技术与酶技术领域。具体涉及一种纳豆激酶高产菌株的筛选方法。
背景技术：
纳豆是日本人最爱吃的传统大豆发酵食品，纳豆激酶（nattokinase，nk）是用大豆发酵制备的一种具有多种生物活性的蛋白酶，人们已对其进行了相当广泛深入的研究。现代科学研究已表明，它的结构为无空间折叠的线性氨基酸链，特征性作用底物为纤维蛋白，其溶栓作用优于蛇毒纤溶酶、尿激酶（uk）和蚓激酶，具有4倍大于纤溶酶的纤溶活性，分子量远远小于尿激酶、蚓激酶，且可由肠道吸收。据报道，纳豆激酶可以有效地溶解血栓，另外还具有降低血液粘度，抑制血小板凝固，降血脂、降胆固醇，改善血液循环状况，维持血细胞的正常形态和功能等多种生理功能。纳豆激酶不仅拥有纤溶酶原激活活性，而且还能直接消化利用有限的蛋白质纤维。纳豆激酶的体内外溶栓性质通过实验也已得到确定，在体内作用迅速，持续时间长，还能激活体内的纤维蛋白酶，使之温和、持续地提高血液的溶纤活性。其溶解血栓作用上的优点是它的持续性。目前临床上常用的血栓溶解剂（溶栓药物）大都是注射剂，无论是哪种注入体内，其作用时间(半衰期)都很短，只有4～20分钟，而纳豆激酶的作用时间可长达4～8小时。所以，纳豆激酶不仅有望成为临床治疗血栓病的首选治疗剂，其不同级别不同类型的制剂在预防和保健领域也将发挥重要作用。
虽然人们已对纳豆激酶的理化特性和生理药理活性进行了相当多的研究，并且不断有新菌株被分离筛选出的报道，但大都是采用经典的菌种筛选方法获得的。经典的菌种筛选方法主要有：反复的自然选育法、物理诱变法和化学诱变法等。这些方法虽然为新菌种的发现和获得做出了重大贡献，但普遍存在工作量大、效率低，随机性大、目标性差，就像大海捞针一样，周期长，材料消耗量大等缺陷。先进的基因定点突变筛选法虽然大大提高了筛选的目标性和方向性，但其应用有个前提条件是，必须要搞清拟诱变与筛选菌株/菌种的基因组成、基因结构和基因功能，而由于科技发展的水平等原因，目前这几项都能真正清楚的微生物菌种/菌株还很少见，对于产纳豆激酶的纳豆芽孢杆菌菌株来说，更是罕见。因而，使大多数的菌株的筛选无法或难以实现。
技术实现要素：
针对现有技术的缺点或不足，本发明提供一种纳豆激酶高产菌株的筛选方法，该方法是依据纳豆激酶的理化特性和纳豆芽孢杆菌的生长代谢特性通过一种选择性培养基的设计与应用，借助于高通量筛选和od值的快速检测等技术以实现快速准确的纳豆激酶高产菌株的筛选。
该纳豆激酶高产菌株的筛选方法包括以下工艺步骤：
（1）筛选培养基的制备
初筛液态培养基组成：大豆蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l；二异丙基氟代磷酸酯0.001-0.1g/l、o,o-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羟基乙基)磷酸酯0.001-1g/l、苯甲基磺酰氟（pmsf）0.001-0.5g/l或碘乙酸0.001-1g/l中的一种或其组合；青霉素0.001-0.5g/l、洁霉素0.001-0.5g/l或先锋霉素0.001-0.5g/l中的一种或其组合；余量：去离子水；调节ph到7.2，121℃灭菌20-30min，备用；
初筛固态培养基：上述培养基组分，添加琼脂15g/l同样条件下灭菌即得初筛固态培养基，备用；
复筛液态培养基：豆粉4-10%，蔗糖2-8%，余量：去离子水，ph=7.2，115℃灭菌20min，备用；
复筛固态培养基：大豆蛋白胨10-40g/l，酵母粉5-20g/l，氯化钠10g/l，琼脂15g/l；ph=7.2，121℃灭菌20-30min，备用；
（2）初筛
按照微生物的无菌操作规范，在96或384深孔板内各加入1ml液体培养基，将来自自然或经理化等因子处理的在普通lb培养基上长出的典型单菌落分别接种到每个深孔内，37℃、180r/min摇床发酵培养24-48h，然后离心取上清液200ul于96或384微孔板内，采用酶标仪法测其光密度od680nm，选取od680nm值较大的数株作为候选高产菌株；
（3）复筛
a.双碟培养将获得的候选高产菌株原种再各取一份分别接种到初筛固态双碟培养基上，37℃，倒置培养24-48h；生长旺盛的单菌落即为纳豆激酶高产菌株，挑取几个单菌落，备检；
b.复验将得到的初筛固态培养良好的纳豆激酶高产菌株按1%接种量接到50ml复筛液体培养基上，37℃、180r/min摇瓶发酵培养48h，离心取上清液即为粗酶液，采用folin-酚法和琼脂糖-纤维蛋白平板法比较其酶活力大小，酶活力最大者即为纳豆激酶高产菌株；
c.斜面培养保藏将选取的纳豆激酶高产菌株从对应的初筛固态双碟培养基上挑取一环接种到复筛固态试管斜面培养基上，37℃，倒置培养48h后即得所述高产菌株，置4℃冰箱中保藏。
实施上述发明需用的主要仪器有：数显电热恒温水浴锅，hh-4型，河南智诚科技发展有限公司；便携式防水型ph/mv/℃测定仪，hi8424型，hannainstruments；可见分光光度计，723型，上海精密科学仪器有限公司，微量移液器，百得实验室仪器有限公司，phb-1型ph计，上海宇隆仪器有限公司，alc-2103型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司，gl-16a冷冻离心机、tgl-16c型台式高速离心机、tdl-5a型低速离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司，涡旋混合器hq-60-ⅱ，北京北方同正生物技术发展有限公司，ldzx-0kbs型立式高温蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂，elix10型超纯水系统，milipore，thz-312型台式恒温振荡器、shp-150型生化培养箱、dk-8d型电热恒温水槽、dhg-9246a型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司，sw-cj-zf型双人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司，v-1100型可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司，酶标仪，biotek，usa，等。
本发明的特点和有益效果是：
与典或传统的自然选育法、物理诱变法和化学诱变法等菌种筛选方法相比，本发明具有方向明确，目标精准，工作量小，用时短，效率高，成功率大等优点，不仅使其工作量大、效率低，筛选的随机性大、目标性差的缺点得以克服，还使筛选周期明显缩短；该方法不是以菌落大小为主要依据，而是以快速得到的酶活高低为判断标准；与前沿的基因定点突变筛选法相比，不仅没有降低筛选的目标性和方向性，还节省了大量的人力物力财力消耗等，同时，也大大降低了筛选的难度。本方法操作简单，方便快捷，省时省力省钱，可广泛用于丝氨酸蛋白酶类产生菌的快速筛选，亦可为其它相关菌种的高效快速筛选提供借鉴。
具体实施方式
以下详细介绍本发明的实施例。
实施例1：
主要仪器：数显电热恒温水浴锅，hh-4型，河南智诚科技发展有限公司；便携式防水型ph/mv/℃测定仪，hi8424型，hannainstruments；可见分光光度计，723型，上海精密科学仪器有限公司，微量移液器，百得实验室仪器有限公司，phb-1型ph计，上海宇隆仪器有限公司，alc-2103型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司，gl-16a冷冻离心机、tgl-16c型台式高速离心机、tdl-5a型低速离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司，涡旋混合器hq-60-ⅱ，北京北方同正生物技术发展有限公司，ldzx-0kbs型立式高温蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂，elix10型超纯水系统，milipore，thz-312型台式恒温振荡器、shp-150型生化培养箱、dk-8d型电热恒温水槽、dhg-9246a型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司，sw-cj-zf型双人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司，v-1100型可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司，酶标仪，biotek，usa。
纳豆激酶高产菌株的筛选方法包括以下工艺步骤：
（1）筛选培养基的制备
初筛液态培养基组成：大豆蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l；二异丙基氟代磷酸酯0.1g/l、o,o-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羟基乙基)磷酸酯1g/l、苯甲基磺酰氟（pmsf）0.5g/l或碘乙酸1g/l；青霉素0.001g/l、洁霉素0.001g/l或先锋霉素0.001g/l；余量：去离子水，调节ph到7.2，121℃灭菌20-30min，备用；
初筛固态培养基：上述培养基组分，添加琼脂15g/l同样条件下灭菌即得初筛固态培养基，备用；
复筛液态培养基：豆粉10%，蔗糖8%，余量：去离子水，ph=7.2，115℃灭菌20min，备用；
复筛固态培养基：大豆蛋白胨40g/l，酵母粉20g/l，氯化钠10g/l，琼脂15g/l；ph=7.2，121℃灭菌30min，备用；
（2）初筛
按照微生物的无菌操作规范，在96或384深孔板内各加入1ml液体培养基，将来自自然或经理化等因子处理的在普通lb培养基上长出的典型单菌落分别接种到每个深孔内，37℃、180r/min摇床发酵培养48h，然后离心取上清液200ul于96或384微孔板内，采用酶标仪法测其光密度od680nm，选取od680nm值较大的数株作为候选高产菌株；
（3）复筛
a.双碟培养将获得的候选高产菌株原种再各取一份分别接种到初筛固态双碟培养基上，37℃，倒置培养48h；生长旺盛的单菌落即为纳豆激酶高产菌株，挑取几个单菌落，备检；
b.复验将得到的初筛固态培养良好的纳豆激酶高产菌株按1%接种量接到50ml复筛液体培养基上，37℃、180r/min摇瓶发酵培养48h，离心取上清液即为粗酶液，采用folin-酚法和琼脂糖-纤维蛋白平板法比较其酶活力大小，酶活力最大者即为纳豆激酶高产菌株；
c.斜面培养保藏将选取的纳豆激酶高产菌株从对应的初筛固态双碟培养基上挑取一环接种到复筛固态试管斜面培养基上，37℃，倒置培养48h后即得所述高产菌株，置4℃冰箱中保藏。
实施例2：
主要仪器：与实施例1相同。
纳豆激酶高产菌株的筛选方法包括以下工艺步骤：
（1）筛选培养基的制备
初筛液态培养基：大豆蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l；二异丙基氟代磷酸酯0.001g/l、o,o-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羟基乙基)磷酸酯0.001g/l、苯甲基磺酰氟（pmsf）0.001g/l或碘乙酸0.001g/l；青霉素0.5g/l、洁霉素0.5g/l或先锋霉素0.5g/l；余量：去离子水，调节ph到7.2，121℃灭菌20-30min，备用；
初筛固态培养基：上述培养基组分，添加琼脂15g/l同样条件下灭菌即得初筛固态培养基，备用；
复筛液态培养基：豆粉4%，蔗糖2%，余量：去离子水，ph=7.2，115℃灭菌20min，备用；
复筛固态培养基：大豆蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，琼脂15g/l；ph=7.2，121℃灭菌20min，备用；
（2）初筛
按照微生物的无菌操作规范，在96或384深孔板内各加入1ml液体培养基，将来自自然或经理化等因子处理的在普通lb培养基上长出的典型单菌落分别接种到每个深孔内，37℃、180r/min摇床发酵培养24h，然后离心取上清液200ul于96或384微孔板内，采用酶标仪法测其光密度od680nm，选取od680nm值较大的数株作为候选高产菌株；
（3）复筛
a.双碟培养将获得的候选高产菌株原种再各取一份分别接种到初筛固态双碟培养基上，37℃，倒置培养24h；生长旺盛的单菌落即为纳豆激酶高产菌株，挑取几个单菌落，备检；
b.复验将得到的初筛固态培养良好的纳豆激酶高产菌株按1%接种量接到50ml复筛液体培养基上，37℃、180r/min摇瓶发酵培养48h，离心取上清液即为粗酶液，采用folin-酚法和琼脂糖-纤维蛋白平板法比较其酶活力大小，酶活力最大者即为纳豆激酶高产菌株；
c.斜面培养保藏将选取的纳豆激酶高产菌株从对应的初筛固态双碟培养基上挑取一环接种到复筛固态试管斜面培养基上，37℃，倒置培养48h后即得所述高产菌株，置4℃冰箱中保藏。
实施例3：
主要仪器：与实施例1相同。
纳豆激酶高产菌株的筛选方法包括以下工艺步骤：
（1）筛选培养基的制备
初筛液态培养基：大豆蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l；二异丙基氟代磷酸酯0.05g/l、o,o-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羟基乙基)磷酸酯0.1g/l、苯甲基磺酰氟（pmsf）0.05g/l或碘乙酸0.1g/l；青霉素0.08g/l、洁霉素0.1g/l或先锋霉素0.06g/l；余量：去离子水，调节ph到7.2，121℃灭菌30min，备用；
初筛固态培养基：上述培养基组分，添加琼脂15g/l同样条件下灭菌即得初筛固态培养基，备用；
复筛液态培养基：豆粉8%，蔗糖5%，余量：去离子水，ph=7.2，115℃灭菌20min，备用；
复筛固态培养基：大豆蛋白胨30g/l，酵母粉10g/l，氯化钠10g/l，琼脂15g/l；ph=7.2，121℃灭菌25min，备用；
（2）初筛
按照微生物的无菌操作规范，在96或384深孔板内各加入1ml液体培养基，将来自自然或经理化等因子处理的在普通lb培养基上长出的典型单菌落分别接种到每个深孔内，37℃、180r/min摇床发酵培养32h，然后离心取上清液200ul于96或384微孔板内，采用酶标仪法测其光密度od680nm，选取od680nm值较大的数株作为候选高产菌株；
（3）复筛
a.双碟培养将获得的候选高产菌株原种再各取一份分别接种到初筛固态双碟培养基上，37℃，倒置培养36h；生长旺盛的单菌落即为纳豆激酶高产菌株，挑取几个单菌落，备检；
b.复验将得到的初筛固态培养良好的纳豆激酶高产菌株按1%接种量接到50ml复筛液体培养基上，37℃、180r/min摇瓶发酵培养48h，离心取上清液即为粗酶液，采用folin-酚法和琼脂糖-纤维蛋白平板法比较其酶活力大小，酶活力最大者即为纳豆激酶高产菌株；
c.斜面培养保藏将选取的纳豆激酶高产菌株从对应的初筛固态双碟培养基上挑取一环接种到复筛固态试管斜面培养基上，37℃，倒置培养48h后即得所述高产菌株，置4℃冰箱中保藏。
实施例4：
主要仪器：与实施例1相同。
纳豆激酶高产菌株的筛选方法包括以下工艺步骤：
（1）筛选培养基的制备
初筛液态培养基：大豆蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l；二异丙基氟代磷酸酯0.05g/l、o,o-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羟基乙基)磷酸酯0.1g/l、苯甲基磺酰氟（pmsf）0.05g/l；青霉素0.08g/l、洁霉素0.1g/l；余量：去离子水，调节ph到7.2，121℃灭菌30min，备用；
初筛固态培养基：上述培养基组分，添加琼脂15g/l同样条件下灭菌即得初筛固态培养基，备用；
复筛液态培养基：豆粉8%，蔗糖5%，余量：去离子水，ph=7.2，115℃灭菌20min，备用；
复筛固态培养基：大豆蛋白胨30g/l，酵母粉10g/l，氯化钠10g/l，琼脂15g/l；ph=7.2，121℃灭菌25min，备用；
（2）初筛
按照微生物的无菌操作规范，在96或384深孔板内各加入1ml液体培养基，将来自自然或经理化等因子处理的在普通lb培养基上长出的典型单菌落分别接种到每个深孔内，37℃、180r/min摇床发酵培养32h，然后离心取上清液200ul于96或384微孔板内，采用酶标仪法测其光密度od680nm，选取od680nm值较大的数株作为候选高产菌株；
（3）复筛
a.双碟培养将获得的候选高产菌株原种再各取一份分别接种到初筛固态双碟培养基上，37℃，倒置培养36h；生长旺盛的单菌落即为纳豆激酶高产菌株，挑取几个单菌落，备检；
b.复验将得到的初筛固态培养良好的纳豆激酶高产菌株按1%接种量接到50ml复筛液体培养基上，37℃、180r/min摇瓶发酵培养48h，离心取上清液即为粗酶液，采用folin-酚法和琼脂糖-纤维蛋白平板法比较其酶活力大小，酶活力最大者即为纳豆激酶高产菌株；
c.斜面培养保藏将选取的纳豆激酶高产菌株从对应的初筛固态双碟培养基上挑取一环接种到复筛固态试管斜面培养基上，37℃，倒置培养48h后即得所述高产菌株，置4℃冰箱中保藏。
实施例5：
主要仪器：与实施例1相同。
纳豆激酶高产菌株的筛选方法包括以下工艺步骤：
（1）筛选培养基的制备
初筛液态培养基：大豆蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l；二异丙基氟代磷酸酯0.05g/l、o,o-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羟基乙基)磷酸酯0.1g/l；青霉素0.08g/l；余量：去离子水，调节ph到7.2，121℃灭菌30min，备用；
初筛固态培养基：上述培养基组分，添加琼脂15g/l同样条件下灭菌即得初筛固态培养基，备用；
复筛液态培养基：豆粉8%，蔗糖5%，余量：去离子水，ph=7.2，115℃灭菌20min，备用；
复筛固态培养基：大豆蛋白胨30g/l，酵母粉10g/l，氯化钠10g/l，琼脂15g/l；ph=7.2，121℃灭菌25min，备用；
（2）初筛
按照微生物的无菌操作规范，在96或384深孔板内各加入1ml液体培养基，将来自自然或经理化等因子处理的在普通lb培养基上长出的典型单菌落分别接种到每个深孔内，37℃、180r/min摇床发酵培养32h，然后离心取上清液200ul于96或384微孔板内，采用酶标仪法测其光密度od680nm，选取od680nm值较大的数株作为候选高产菌株；
（3）复筛
a.双碟培养将获得的候选高产菌株原种再各取一份分别接种到初筛固态双碟培养基上，37℃，倒置培养36h；生长旺盛的单菌落即为纳豆激酶高产菌株，挑取几个单菌落，备检；
b.复验将得到的初筛固态培养良好的纳豆激酶高产菌株按1%接种量接到50ml复筛液体培养基上，37℃、180r/min摇瓶发酵培养48h，离心取上清液即为粗酶液，采用folin-酚法和琼脂糖-纤维蛋白平板法比较其酶活力大小，酶活力最大者即为纳豆激酶高产菌株；
c.斜面培养保藏将选取的纳豆激酶高产菌株从对应的初筛固态双碟培养基上挑取一环接种到复筛固态试管斜面培养基上，37℃，倒置培养48h后即得所述高产菌株，置4℃冰箱中保藏。
实施例6：
主要仪器：与实施例1相同。
纳豆激酶高产菌株的筛选方法包括以下工艺步骤：
（1）筛选培养基的制备
初筛液态培养基：大豆蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l；二异丙基氟代磷酸酯0.05g/l；洁霉素0.1g/l；余量：去离子水，调节ph到7.2，121℃灭菌30min，备用；
初筛固态培养基：上述培养基组分，添加琼脂15g/l同样条件下灭菌即得初筛固态培养基，备用；
复筛液态培养基：豆粉8%，蔗糖5%，余量：去离子水，ph=7.2，115℃灭菌20min，备用；
复筛固态培养基：大豆蛋白胨30g/l，酵母粉10g/l，氯化钠10g/l，琼脂15g/l；ph=7.2，121℃灭菌25min，备用；
（2）初筛
按照微生物的无菌操作规范，在96或384深孔板内各加入1ml液体培养基，将来自自然或经理化等因子处理的在普通lb培养基上长出的典型单菌落分别接种到每个深孔内，37℃、180r/min摇床发酵培养32h，然后离心取上清液200ul于96或384微孔板内，采用酶标仪法测其光密度od680nm，选取od680nm值较大的数株作为候选高产菌株；
（3）复筛
a.双碟培养将获得的候选高产菌株原种再各取一份分别接种到初筛固态双碟培养基上，37℃，倒置培养36h；生长旺盛的单菌落即为纳豆激酶高产菌株，挑取几个单菌落，备检；
b.复验将得到的初筛固态培养良好的纳豆激酶高产菌株按1%接种量接到50ml复筛液体培养基上，37℃、180r/min摇瓶发酵培养48h，离心取上清液即为粗酶液，采用folin-酚法和琼脂糖-纤维蛋白平板法比较其酶活力大小，酶活力最大者即为纳豆激酶高产菌株；
c.斜面培养保藏将选取的纳豆激酶高产菌株从对应的初筛固态双碟培养基上挑取一环接种到复筛固态试管斜面培养基上，37℃，倒置培养48h后即得所述高产菌株，置4℃冰箱中保藏。
本发明不限于上述实施例，所有在本发明的实质范围内作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。