高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法与流程
本发明属于制糖工业用酶安全生产菌株的构建技术领域，涉及一种高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法。
背景技术：
普鲁兰酶是食品行业制糖生产技术中不可或缺的一类酶，主要由原核微生物分泌表达的糖链解枝酶。生产应用中多使用这类酶中的i型普鲁兰酶，其能够专一性切开淀粉原料中由α-1,6糖苷键构成的支链分支，因此普鲁兰酶与其它淀粉水解酶共同作用，可以让淀粉得以完全酶解，得到单分子葡萄糖分子，其在淀粉加工等食品行业中有着广阔的市场前景。近年来，国内外对普鲁兰酶生产菌株的研发投入大量人力物力，许多工业酶生产企业先后开发出多种不同类型的重组生产菌株或诱变菌。在适合工业生产应用的多种普鲁兰酶蛋白中，来自长野芽胞杆菌(bacillusnaganoensis)的普鲁兰酶（bnpulb），其酶学特征，包括最适反应温度及ph等均非常适合淀粉工业加工的需求，但该酶的原产菌的表达水平不高，因此其基因常被用于构建于重组表达生产，在适合食品工业用酶的宿主细胞中。枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)因为其不表达致热源和毒素因子，且其分泌途径强大，因此被列为安全生产菌株（gras）之一，常被用于许多胞外酶发酵生产的首选宿主细胞。枯草芽孢杆菌有许多种，其各自的转化性能、分泌能力等相关很大，其中a164以其营养需求不高，发酵密度高，蛋白分泌水平高等原因被视为蛋白生产的理想宿主细胞。
为了提高生产菌株的遗传稳定性，外源表达通常被整合到宿主细胞的基因组中，而抗生素基因常用作筛选标记来使用，但是在食品工业中，携带抗生素基因的重组菌株会带来生物安全性的问题，因此，有必要在完成外源基因的整合后再通过二次重组或者特异性重组的方式，将抗生素基因去除，得到无抗的生产菌株。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌cnp2的构建方法—通过两次基因操作，将两份拷贝普鲁兰酶基因整合到枯草芽孢杆菌的基因组中，并通过特异性重组系统，将抗生素基因去除，从而获得了一株安全的普鲁兰酶高产菌株。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案具体如下：
将人工合成的普鲁兰酶基因表达框tpu1及tpu2分别原位替代枯草芽孢杆菌的碱性蛋白酶基因apre以及淀粉酶基因amye，并将抗性基因ermc和kan敲除后得到所述重组枯草芽孢杆菌，具体步骤如下：
a.设计并基因合成线性dna片段tpu1及tpu2；
b.以枯草芽孢杆菌a164为出发菌株进行分子构建，将tpu1与枯草芽孢杆菌a164感受态细胞混合，进行转化，获得具有红霉素抗性的重组菌株cnp1；
所述枯草芽孢杆菌a164，最开始分离自德国马尔堡，该菌种可以通过美国国家菌种保藏中心购买得到，菌种保藏号为atcc6051a；
c.将tpu2与枯草芽孢杆菌cnp1感受态细胞混合，进行转化，获得具有红霉素/卡那霉素双抗性的重组菌株cnp2ek；
d.转入cre表达质粒，进行红霉素/卡那霉素双抗性的消除，得到重组枯草芽孢杆菌cnp2，即重组枯草芽孢杆菌。
所述基因表达框tpu1及tpu2分别经密码子优化、基因合成后获得，tpu1的核苷酸序列为：
caaatgcgctgaatgcctatgttacaggaattggggccaataaacggattgtattgtggg60
atacgacgctgaacaaacttgacgattcagaaattctgtttattatgggccacgaaatgg120
gccattatgtcatgaagcacgtttacatcggtctggctggctatttgctcgtgtcgctcg180
ccggattttatgtcattgataagctttacaagcggacggttcgcctaacccgcagcatgt240
ttcatttagaagggcggcatgatcttgcggcacttccgctgttattgcttttgttttctg300
ttttgagctttgcggttacgcctttttctaatgctgtctcgcgttatcaggagaataagg360
ctgaccagtatgggatcgagttgacagagaacagagaagccgctgttaaaacgtttcagg420
atttggccgtgacggggctgagccaggttgatcctccggtgcttgtgaagattttcagag480
gcagccatccgtcgatcatggaacggattcaacatgcggagaaagaagagaatgcgccgg540
aacatcaggatgctgacaaataaaaagaagcaggtatggaggaacctgcttctttttact600
attattgtgcagctgcttgcctgcactgcagatcgattgtttgagaaaagaagaagacca660
taaaaataccttgtctgtcatcagacagggtattttttatgctgtccagactgtccgctg720
tgtaaaaaaaaggaataaaggggggttgacattattttactgatatgtataatataattt780
gtataagaaaatggagtcgaaacgtaagatgaaaccttagataaaagtgctttttttgtt840
gcaattgaagaattattaatgttaagcttaattaaagataatatctttgaattgtaacgc900
ccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaatacgttatatagaaatatgtttgaaccttc960
ttcagattacaaatatattcggacggactctacctcaaatgcttatctaactatagaatg1020
acatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaatataactaccaatgaacttgttcatgtga1080
attatcgctttatttaattttctcaattcaatatataatatgccaatacattgttacaag1140
tagaaattaagacacccttgatagccttactatacctaacatgatgtagtattaaatgaa1200
tatgtaaatatatttatgataagaagcgacttatttataatcattacatatttttctatt1260
ggaatgattaagattccaatagaatagtgtataaattatttatcttgaaaggagggatgc1320
ctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatttgcaccgtctaatggatttatgaaaaatc1380
attttatcagtttgaaaattatgtattatgcttacattccatcgtatcatccgtaaaggc1440
tggatgttccttcttgctttccttcttacagcttctcttttctgccctacaggccaacat1500
gctaaagctgctgctcaacctgctgtttctaacgcttaccttgatgcttctaaccaagtt1560
cttgttaaactttctcaacctttcacacttggcgaaggctcttctggcttcacagttcat1620
gatgatacagctaacaaagatatccctgttacatctgtttctgatgctaaccaagttaca1680
gctgttcttgctggcacattccaacatatcttcggcggctctgattgggctcctgataac1740
cataacacacttcttaaaaaagttaactctaacctttaccaattctctggcaaccttcct1800
gaaggcaactaccaatacaaagttgctcttaacgattcttggaacaacccttcttaccct1860
tctgataacatcaaccttacagttcctgctggcggcgctcatgttacattctcttacatc1920
ccttctacacatgctgtttacgatacaatcaacaaccctaacgctgatcttcaagttgat1980
tcttctggcgttaaaacagatcttgttgctgttacacttggcgaaaaccctgatgtttct2040
catacactttctatccaaacagaagattaccaagctggccaagttatccctcgtaaagtt2100
cttgattcttctcaatactactactctggcgatgatcttggcaacacatacacaaaaaac2160
gctacaacattcaaagtttgggctcctacatctacacaagttaacgttcttctttacaac2220
tctgctacaggcgctgttacaaaaacagttcctatgacagcttctggccatggcgtttgg2280
gaagctacagttaaccaagatcttgaaaactggtactacatgtacgaagttacaggccaa2340
ggctctacacgtacagctgttgatccttacgctacagctatcgctcctaacggcacacgt2400
ggcatgatcgttgatcttgctaaaacagatcctgctggctgggaatctgataaacatatc2460
acacctaaaaacatcgaagatgaagttatctacgaaatggatgttcgtgatttctctatc2520
gattctaactctggcatgaaaaacaaaggcaaataccttgctcttacagaaaaaggcaca2580
aaaggccctgataacgttaaaacaggcgttgattctcttaaacaacttggcatcacacat2640
gttcaacttcaacctgttttcgctttcaactctgttaacgaaaacgatcctacacaatac2700
aactggggctacgatcctcgtaactacaacgttcctgaaggccaatacgctacaaacgct2760
aacggcacaacacgtatcaaagaattcaaagaaatggttctttctcttcatcaagatcat2820
atcggcgttaacatggatgttgtttacaaccatacattcgctacacaaatctctgatttc2880
gataaaatcgttcctgaatactactaccgtacagatgatgctggcaactacacaaacggc2940
tctggcacaggcaacgaaatcgctgctgaacgtcctatggttcaaaaattcatcatcgat3000
tctcttaaattctgggttaacgaataccatgttgatggcttccgtttcgatcttatggct3060
cttcttggcaaagatacaatgtctaaagctgctacacaacttcatgctatcgatcctggc3120
atcgctctttacggcgaaccttggacaggcggcacatctgctcttcctgctgatcaactt3180
cttacaaaaggcgctcaaaaaggcatgggcgttgctgttttcaacgataaccttcgtaac3240
ggccttgatggctctgttttcgattcttctgctcaaggcttcgctacaggcgctacaggc3300
cttacagatgctatcaaaaacggcgttgaaggctctatcaacgatttcacagcttctcct3360
ggcgaaacaatcaactacgttacatctcatgataactacacactttgggataaaatcgct3420
caatctaaccctaacgattctgaagctgatcgtatcaaaatggatgaacttgctcaagct3480
atcgttatgacatctcaaggcatccctttcatgcaaggcggcgaagaaatgcttcgtaca3540
aaaggcggcaacgataactcttacaacgctggcgatgttgttaacgaattcgattggtct3600
cgtaaagctcaataccctgatgttttcaactactactctggccttatccatcttcgtctt3660
gatcatcctgctttccgtatgacaacagctaacgaaatcaactctcatcttcaattcctt3720
aactctcctgaaaacacagttgcttacgaactttctgatcatgctaacaaagatacatgg3780
ggcaacatcgttgttatctacaaccctaacaaaacagctgaaacaatcaaccttccttct3840
ggcaaatgggaaatcaacgctacatctggcaaagttggcgaatctacacttggccaagct3900
gaaggctctgttcaagttcctggcatctctatgatgatccttcatcaagaagtttctcct3960
tctgatggcaaataaagaagcaggttcctccatacctgcttctttttaaggatccaagct4020
tgcggccgctaccgttcgtatagcatacattatacgaagttatttaaaccgtgtgctcta4080
cgaccaaaactataaaacctttaagaactttctttttttacaagaaaaaagaaattagat4140
aaatctctcatatcttttattcaataatcgcatccgattgcagtataaatttaacgatca4200
ctcatcatgttcatatttatcagagctcgtgctataattatactaattttataaggagga4260
aaaaatatgggcatttttagtatttttgtaatcagcacagttcattatcaaccaaacaaa4320
aaataagtggttataatgaatcgttaataagcaaaattcatataaccaaattaaggaggg4380
aaataatgaacgagaaaaatataaaacacagtcaaaactttattacttcaaaacataata4440
tagataaaataatgacaaatataagattaaatgaacatgataatatctttgaaatcggct4500
caggaaaaggccattttacccttgaattagtaaagaggtgtaatttcgtaactgccattg4560
aaatagaccataaattatgcaaaactacagaaaataaacttgttgatcacgataatttcc4620
aagttttaaacaaggatatattgcagtttaaatttcctaaaaaccaatcctataaaatat4680
atggtaatataccttataacataagtacggatataatacgcaaaattgtttttgatagta4740
tagctaatgagatttatttaatcgtggaatacgggtttgctaaaagattattaaatacaa4800
aacgctcattggcattacttttaatggcagaagttgatatttctatattaagtatggttc4860
caagagaatattttcatcctaaacctaaagtgaatagctcacttatcagattaagtagaa4920
aaaaatcaagaatatcacacaaagataaacaaaagtataattatttcgttatgaaatggg4980
ttaacaaagaatacaagaaaatatttacaaaaaatcaatttaacaattccttaaaacatg5040
caggaattgacgatttaaacaatattagctttgaacaattcttatctcttttcaatagct5100
ataaattatttaataagtaagttaagggatgcataaactgcatcccttaacttgtttttc5160
gtgtgcctattttttgtgaattgattatcgatcttttgcgccatggataacttcgtatag5220
catacattatacgaacggtacatatgcccgggggtaccgaattccctgctggtcgccatt5280
ttggctctttaccctctccttttaaaaaaattcagagtagacttacttaaaagactattc5340
tgtgaatttattgtaatagatggaataatattttagtagacccatttttttgagatgatt5400
ttatctctatttaggtatatcatctctcgctatttccgtagagactcgaaataactattt5460
tcatacagaaaagaacgaaaatagacatgagtaaatgttcattatgctgaaatgtcatgc5520
ttttttaggttaaatgctcctgagtcccggcaaattcctgtcgaaaaaattcgttcaaat5580
gacctgcgtgtgcttccgtgagaacaatggatattatcgtgatattttttcaaagcatga5640
tgataaaagtattctgaaaaataaactttacagaaaagggatagaatgaaaaaattattg5700
agagggaggaagaaataagatgaacattcgccaagcaaagacatcagatgcggccgcca5760
tgcgccgctgtttaaccaatatcgggaattttatagacaggcatccgatttgcaaggggc5820
agaggcttttttgaaagctcgtttggaaaatcacgagtctgttattttgatagcagaaga5880
aaatg5885；
tpu2的核苷酸序列为：
atgtttgcaaaacgattcaaaacctctttactgccgttattcgctggatttttattgctg60
tttcatttggttctggcaggaccggcggctgcgagtgctgaaacggcgaacaaatcgaat120
gagcttacagcaccgtcgatcaaaagcggaaccattcttcatgcatggaattggtcgttc180
aatacgttaaaacacaatatgaaggatattcatgatgcaggatatacagccattcagaca240
tctccgattaaccaagtaaaggaagggaatcaaggagataaaagcatgtcgaactggtac300
tggctgtatcagccgacatcgtatcaaattggcaaccgttacttaggtactgaacaagaa360
tttaaagaaatgtgtgcagccgctgaagaatatggcataaaggtcattgttgacgcggtc420
atcaatcataccaccagtgattatgccgcgatttccaatgaggttaagagtattccaaac480
tggacacatggaaacacacaaattaaaaactggtctgatcgcctgcactgcatagaatct540
aatattataactaaattttctaaaaaaaacattggaatagacatttattttgtatatgat600
gaaataaagttagtttattggataaacaaactaactttattaaggtagttgatggataaa660
cttgttcacttaaatcaatcgaaacgtaagatgaaaccttagataaaagtgctttttttg720
ttgcaattgaagaattattaatgttaagcttaattaaagataatatctttgaattgtaac780
gcccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaatacgttatatagaaatatgtttgaacct840
tcttcagattacaaatatattcggacggactctacctcaaatgcttatctaactatagaa900
tgacatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaatataactaccaatgaacttgttcatgt960
gaattatcgctttatttaattttctcaattcaatatataatatgccaatacattgttaca1020
agtagaaattaagacacccttgatagccttactatacctaacatgatgtagtattaaatg1080
aatatgtaaatatatttatgataagaagcgacttatttataatcattacatatttttcta1140
ttggaatgattaagattccaatagaatagtgtataaattatttatcttgaaaggagggat1200
gcctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatttgcaccgtctaatggatttatgaaaaa1260
tcattttatcagtttgaaaattatgtattatgcttatcaacaaatctaaaaaattcttcg1320
ttttctctttcatcttcgttatgatgctttctctttctttcgttaacggcgaagttgcta1380
aagctgctcaacctgctgtttctaacgcttaccttgatgcttctaaccaagttcttgtta1440
aactttctcaacctttcacacttggcgaaggctcttctggcttcacagttcatgatgata1500
cagctaacaaagatatccctgttacatctgtttctgatgctaaccaagttacagctgttc1560
ttgctggcacattccaacatatcttcggcggctctgattgggctcctgataaccataaca1620
cacttcttaaaaaagttaactctaacctttaccaattctctggcaaccttcctgaaggca1680
actaccaatacaaagttgctcttaacgattcttggaacaacccttcttacccttctgata1740
acatcaaccttacagttcctgctggcggcgctcatgttacattctcttacatcccttcta1800
cacatgctgtttacgatacaatcaacaaccctaacgctgatcttcaagttgattcttctg1860
gcgttaaaacagatcttgttgctgttacacttggcgaaaaccctgatgtttctcatacac1920
tttctatccaaacagaagattaccaagctggccaagttatccctcgtaaagttcttgatt1980
cttctcaatactactactctggcgatgatcttggcaacacatacacaaaaaacgctacaa2040
cattcaaagtttgggctcctacatctacacaagttaacgttcttctttacaactctgcta2100
caggcgctgttacaaaaacagttcctatgacagcttctggccatggcgtttgggaagcta2160
cagttaaccaagatcttgaaaactggtactacatgtacgaagttacaggccaaggctcta2220
cacgtacagctgttgatccttacgctacagctatcgctcctaacggcacacgtggcatga2280
tcgttgatcttgctaaaacagatcctgctggctgggaatctgataaacatatcacaccta2340
aaaacatcgaagatgaagttatctacgaaatggatgttcgtgatttctctatcgattcta2400
actctggcatgaaaaacaaaggcaaataccttgctcttacagaaaaaggcacaaaaggcc2460
ctgataacgttaaaacaggcgttgattctcttaaacaacttggcatcacacatgttcaac2520
ttcaacctgttttcgctttcaactctgttaacgaaaacgatcctacacaatacaactggg2580
gctacgatcctcgtaactacaacgttcctgaaggccaatacgctacaaacgctaacggca2640
caacacgtatcaaagaattcaaagaaatggttctttctcttcatcaagatcatatcggcg2700
ttaacatggatgttgtttacaaccatacattcgctacacaaatctctgatttcgataaaa2760
tcgttcctgaatactactaccgtacagatgatgctggcaactacacaaacggctctggca2820
caggcaacgaaatcgctgctgaacgtcctatggttcaaaaattcatcatcgattctctta2880
aattctgggttaacgaataccatgttgatggcttccgtttcgatcttatggctcttcttg2940
gcaaagatacaatgtctaaagctgctacacaacttcatgctatcgatcctggcatcgctc3000
tttacggcgaaccttggacaggcggcacatctgctcttcctgctgatcaacttcttacaa3060
aaggcgctcaaaaaggcatgggcgttgctgttttcaacgataaccttcgtaacggccttg3120
atggctctgttttcgattcttctgctcaaggcttcgctacaggcgctacaggccttacag3180
atgctatcaaaaacggcgttgaaggctctatcaacgatttcacagcttctcctggcgaaa3240
caatcaactacgttacatctcatgataactacacactttgggataaaatcgctcaatcta3300
accctaacgattctgaagctgatcgtatcaaaatggatgaacttgctcaagctatcgtta3360
tgacatctcaaggcatccctttcatgcaaggcggcgaagaaatgcttcgtacaaaaggcg3420
gcaacgataactcttacaacgctggcgatgttgttaacgaattcgattggtctcgtaaag3480
ctcaataccctgatgttttcaactactactctggccttatccatcttcgtcttgatcatc3540
ctgctttccgtatgacaacagctaacgaaatcaactctcatcttcaattccttaactctc3600
ctgaaaacacagttgcttacgaactttctgatcatgctaacaaagatacatggggcaaca3660
tcgttgttatctacaaccctaacaaaacagctgaaacaatcaaccttccttctggcaaat3720
gggaaatcaacgctacatctggcaaagttggcgaatctacacttggccaagctgaaggct3780
ctgttcaagttcctggcatctctatgatgatccttcatcaagaagtttctccttctgatg3840
gcaaataaagaagcaggttcctccatacctgcttctttttaagggatccaagcttgcggc3900
cgctaccgttcgtatagcatacattatacgaagttatcgggccagtttgttgaagattag3960
atgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagttattaatagct4020
gaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaaagcaaatctaaaattatctga4080
aaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagagaagaaagaatgaagat4140
tgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgttaaggctattgg4200
tgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggccctattcggatattgagatgatgtg4260
tgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatggacaaccggtgagtggaaggt4320
ggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcaggtggaatcaga4380
ttggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgattcaggtggata4440
cttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttccacgatgcgat4500
ttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgtaatattcgtgt4560
gcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtacaggtagcaatggcaggtgccat4620
gttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgagcgcttcggtcttaactgaagc4680
agttaagcaatcagatcttccttcaggttatgaccatctgtgccagttcgtaatgtctgg4740
tcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgctagagaatttctggaatgggattca4800
ggagtggacagaacgacacggatatatagtggatgtgtcaaaacgcataccattttgaac4860
gatgacctctaataattgttaatcatgttggttacgtatttattaacttctcctagtatt4920
agtaattatcatggctgtcatcccgggataacttcgtatagcatacattatacgaacggt4980
acatatgcccgggggtaccgaattccctgctggtcgccattttggctcgacatggatgag5040
cgatgatgatatccgtttaggctgggcggtgatagcttctcgttcaggcagtacgcctct5100
tttcttttccagacctgagggaggcggaaatggtgtgaggttcccggggaaaagccaaat5160
aggcgatcgcgggagtgctttatttgaagatcaggctatcactgcggtcaatagatttca5220
caatgtgatggctggacagcctgaggaactctcgaacccgaatggaaacaaccagatatt5280
tatgaatcagcgcggctcacatggcgttgtgctggcaaatgcaggttcatcctctgtctc5340
tatcaatacggcaacaaaattgcctgatggcaggtatgacaataaagctggagcgggttc5400
atttcaagtgaacgatggtaaactgacaggcacgatcaatgccaggtctgtagctgtgct5460
ttatcctgatgatattgcaaaagcgcctcatgttttccttgagaattacaaaacaggtgt5520
aacacattctttcaatgatcaactgacgattaccttgcgtgcagatgcgaatacaacaaa5580
agccgtttatcaaatcaataatggaccagacgacaggcgtttaaggatggagatcaattc5640
acaatcggaaaaggagatccaatttggcaaaacatacaccatcatgttaaaaggaacgaa5700
cagtgatggtgtaacgaggaccgagaaatacagttttgttaaaagagatccagcgtcggc5760
caaaaccatcggctatcaaaatccgaatcattggagccaggtaaatgcttatatctataa5820
acatgatgggagccgagtaattgaattgaccggatcttggcctggaaaaccaatgactaa5880
aaatgcagacggaatttacacgctgacgctgcctgcggacacggatacaaccaacgcaaa5940
agtgatttttaataatggcagcgcccaagtgcccggtcagaatcagcctggctttgatta6000
cgtgctaaatggtttatataatgactcgggcttaagcggttctcttccccattga6055。
所术基因表达框tpu1和tpu2分别包含一份拷贝的普鲁兰酶编码基因pulb，所述pulb基因的核苷酸序列如下：
caacctgctgtttctaacgcttaccttgatgcttctaaccaagttcttgttaaactttct60
caacctttcacacttggcgaaggctcttctggcttcacagttcatgatgatacagctaac120
aaagatatccctgttacatctgtttctgatgctaaccaagttacagctgttcttgctggc180
acattccaacatatcttcggcggctctgattgggctcctgataaccataacacacttctt240
aaaaaagttaactctaacctttaccaattctctggcaaccttcctgaaggcaactaccaa300
tacaaagttgctcttaacgattcttggaacaacccttcttacccttctgataacatcaac360
cttacagttcctgctggcggcgctcatgttacattctcttacatcccttctacacatgct420
gtttacgatacaatcaacaaccctaacgctgatcttcaagttgattcttctggcgttaaa480
acagatcttgttgctgttacacttggcgaaaaccctgatgtttctcatacactttctatc540
caaacagaagattaccaagctggccaagttatccctcgtaaagttcttgattcttctcaa600
tactactactctggcgatgatcttggcaacacatacacaaaaaacgctacaacattcaaa660
gtttgggctcctacatctacacaagttaacgttcttctttacaactctgctacaggcgct720
gttacaaaaacagttcctatgacagcttctggccatggcgtttgggaagctacagttaac780
caagatcttgaaaactggtactacatgtacgaagttacaggccaaggctctacacgtaca840
gctgttgatccttacgctacagctatcgctcctaacggcacacgtggcatgatcgttgat900
cttgctaaaacagatcctgctggctgggaatctgataaacatatcacacctaaaaacatc960
gaagatgaagttatctacgaaatggatgttcgtgatttctctatcgattctaactctggc1020
atgaaaaacaaaggcaaataccttgctcttacagaaaaaggcacaaaaggccctgataac1080
gttaaaacaggcgttgattctcttaaacaacttggcatcacacatgttcaacttcaacct1140
gttttcgctttcaactctgttaacgaaaacgatcctacacaatacaactggggctacgat1200
cctcgtaactacaacgttcctgaaggccaatacgctacaaacgctaacggcacaacacgt1260
atcaaagaattcaaagaaatggttctttctcttcatcaagatcatatcggcgttaacatg1320
gatgttgtttacaaccatacattcgctacacaaatctctgatttcgataaaatcgttcct1380
gaatactactaccgtacagatgatgctggcaactacacaaacggctctggcacaggcaac1440
gaaatcgctgctgaacgtcctatggttcaaaaattcatcatcgattctcttaaattctgg1500
gttaacgaataccatgttgatggcttccgtttcgatcttatggctcttcttggcaaagat1560
acaatgtctaaagctgctacacaacttcatgctatcgatcctggcatcgctctttacggc1620
gaaccttggacaggcggcacatctgctcttcctgctgatcaacttcttacaaaaggcgct1680
caaaaaggcatgggcgttgctgttttcaacgataaccttcgtaacggccttgatggctct1740
gttttcgattcttctgctcaaggcttcgctacaggcgctacaggccttacagatgctatc1800
aaaaacggcgttgaaggctctatcaacgatttcacagcttctcctggcgaaacaatcaac1860
tacgttacatctcatgataactacacactttgggataaaatcgctcaatctaaccctaac1920
gattctgaagctgatcgtatcaaaatggatgaacttgctcaagctatcgttatgacatct1980
caaggcatccctttcatgcaaggcggcgaagaaatgcttcgtacaaaaggcggcaacgat2040
aactcttacaacgctggcgatgttgttaacgaattcgattggtctcgtaaagctcaatac2100
cctgatgttttcaactactactctggccttatccatcttcgtcttgatcatcctgctttc2160
cgtatgacaacagctaacgaaatcaactctcatcttcaattccttaactctcctgaaaac2220
acagttgcttacgaactttctgatcatgctaacaaagatacatggggcaacatcgttgtt2280
atctacaaccctaacaaaacagctgaaacaatcaaccttccttctggcaaatgggaaatc2340
aacgctacatctggcaaagttggcgaatctacacttggccaagctgaaggctctgttcaa2400
gttcctggcatctctatgatgatccttcatcaagaagtttctccttctgatggcaaataa2460。
所述基因表达框tpu1含有用于敲除apre基因的同源片断，其核苷酸序列如下：
caaatgcgctgaatgcctatgttacaggaattggggccaataaacggattgtattgtggg60
atacgacgctgaacaaacttgacgattcagaaattctgtttattatgggccacgaaatgg120
gccattatgtcatgaagcacgtttacatcggtctggctggctatttgctcgtgtcgctcg180
ccggattttatgtcattgataagctttacaagcggacggttcgcctaacccgcagcatgt240
ttcatttagaagggcggcatgatcttgcggcacttccgctgttattgcttttgttttctg300
ttttgagctttgcggttacgcctttttctaatgctgtctcgcgttatcaggagaataagg360
ctgaccagtatgggatcgagttgacagagaacagagaagccgctgttaaaacgtttcagg420
atttggccgtgacggggctgagccaggttgatcctccggtgcttgtgaagattttcagag480
gcagccatccgtcgatcatggaacggattcaacatgcggagaaagaagagaatgcgccgg540
aacatcaggatgctgacaaataaaaagaagcaggtatggaggaacctgcttctttttact600
attattgtgcagctgcttgcctgcactgcagggatccaagcttgcggccgctaccgttcg660
tatagcatacattatacgaagttatttaaaccgtgtgctctacgaccaaaactataaaac720
ctttaagaactttctttttttacaagaaaaaagaaattagataaatctctcatatctttt780
attcaataatcgcatccgattgcagtataaatttaacgatcactcatcatgttcatattt840
atcagagctcgtgctataattatactaattttataaggaggaaaaaatatgggcattttt900
agtatttttgtaatcagcacagttcattatcaaccaaacaaaaaataagtggttataatg960
aatcgttaataagcaaaattcatataaccaaattaaggagggaaataatgaacgagaaaa1020
atataaaacacagtcaaaactttattacttcaaaacataatatagataaaataatgacaa1080
atataagattaaatgaacatgataatatctttgaaatcggctcaggaaaaggccatttta1140
cccttgaattagtaaagaggtgtaatttcgtaactgccattgaaatagaccataaattat1200
gcaaaactacagaaaataaacttgttgatcacgataatttccaagttttaaacaaggata1260
tattgcagtttaaatttcctaaaaaccaatcctataaaatatatggtaatataccttata1320
acataagtacggatataatacgcaaaattgtttttgatagtatagctaatgagatttatt1380
taatcgtggaatacgggtttgctaaaagattattaaatacaaaacgctcattggcattac1440
ttttaatggcagaagttgatatttctatattaagtatggttccaagagaatattttcatc1500
ctaaacctaaagtgaatagctcacttatcagattaagtagaaaaaaatcaagaatatcac1560
acaaagataaacaaaagtataattatttcgttatgaaatgggttaacaaagaatacaaga1620
aaatatttacaaaaaatcaatttaacaattccttaaaacatgcaggaattgacgatttaa1680
acaatattagctttgaacaattcttatctcttttcaatagctataaattatttaataagt1740
aagttaagggatgcataaactgcatcccttaacttgtttttcgtgtgcctattttttgtg1800
aattgattatcgatcttttgcgccatggataacttcgtatagcatacattatacgaacgg1860
tacatatgcccgggggtaccgaattccctgctggtcgccattttggctctttaccctctc1920
cttttaaaaaaattcagagtagacttacttaaaagactattctgtgaatttattgtaata1980
gatggaataatattttagtagacccatttttttgagatgattttatctctatttaggtat2040
atcatctctcgctatttccgtagagactcgaaataactattttcatacagaaaagaacga2100
aaatagacatgagtaaatgttcattatgctgaaatgtcatgcttttttaggttaaatgct2160
cctgagtcccggcaaattcctgtcgaaaaaattcgttcaaatgacctgcgtgtgcttccg2220
tgagaacaatggatattatcgtgatattttttcaaagcatgatgataaaagtattctgaa2280
aaataaactttacagaaaagggatagaatgaaaaaattattgagagggaggaagaaataa2340
gatgaacattcgccaagcaaagacatcagatgcggccgccattgcgccgctgtttaacca2400
atatcgggaattttatagacaggcatccgatttgcaaggggcagaggcttttttgaaagc2460
tcgtttggaaaatcacgagtctgttattttgatagcagaagaaaatg2507；
所述基因表达框tpu2含有用于敲除amye基因的同源片断，其核苷酸序列如下：
atgtttgcaaaacgattcaaaacctctttactgccgttattcgctggatttttattgctg60
tttcatttggttctggcaggaccggcggctgcgagtgctgaaacggcgaacaaatcgaat120
gagcttacagcaccgtcgatcaaaagcggaaccattcttcatgcatggaattggtcgttc180
aatacgttaaaacacaatatgaaggatattcatgatgcaggatatacagccattcagaca240
tctccgattaaccaagtaaaggaagggaatcaaggagataaaagcatgtcgaactggtac300
tggctgtatcagccgacatcgtatcaaattggcaaccgttacttaggtactgaacaagaa360
tttaaagaaatgtgtgcagccgctgaagaatatggcataaaggtcattgttgacgcggtc420
atcaatcataccaccagtgattatgccgcgatttccaatgaggttaagagtattccaaac480
tggacacatggaaacacacaaattaaaaactggtctgatcgcctgcactgcagggatcca540
agcttgcggccgctaccgttcgtatagcatacattatacgaagttatcgggccagtttgt600
tgaagattagatgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagtt660
attaatagctgaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaaagcaaatctaa720
aattatctgaaaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagagaagaaa780
gaatgaagattgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgtta840
aggctattggtgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggccctattcggatattg900
agatgatgtgtgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatggacaaccggtg960
agtggaaggtggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcagg1020
tggaatcagattggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgatt1080
caggtggatacttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttcc1140
acgatgcgatttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgta1200
atattcgtgtgcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtacaggtagcaatgg1260
caggtgccatgttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgagcgcttcggtct1320
taactgaagcagttaagcaatcagatcttccttcaggttatgaccatctgtgccagttcg1380
taatgtctggtcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgctagagaatttctgga1440
atgggattcaggagtggacagaacgacacggatatatagtggatgtgtcaaaacgcatac1500
cattttgaacgatgacctctaataattgttaatcatgttggttacgtatttattaacttc1560
tcctagtattagtaattatcatggctgtcatcccgggataacttcgtatagcatacatta1620
tacgaacggtacatatgcccgggggtaccgaattccctgctggtcgccattttggctcga1680
catggatgagcgatgatgatatccgtttaggctgggcggtgatagcttctcgttcaggca1740
gtacgcctcttttcttttccagacctgagggaggcggaaatggtgtgaggttcccgggga1800
aaagccaaataggcgatcgcgggagtgctttatttgaagatcaggctatcactgcggtca1860
atagatttcacaatgtgatggctggacagcctgaggaactctcgaacccgaatggaaaca1920
accagatatttatgaatcagcgcggctcacatggcgttgtgctggcaaatgcaggttcat1980
cctctgtctctatcaatacggcaacaaaattgcctgatggcaggtatgacaataaagctg2040
gagcgggttcatttcaagtgaacgatggtaaactgacaggcacgatcaatgccaggtctg2100
tagctgtgctttatcctgatgatattgcaaaagcgcctcatgttttccttgagaattaca2160
aaacaggtgtaacacattctttcaatgatcaactgacgattaccttgcgtgcagatgcga2220
atacaacaaaagccgtttatcaaatcaataatggaccagacgacaggcgtttaaggatgg2280
agatcaattcacaatcggaaaaggagatccaatttggcaaaacatacaccatcatgttaa2340
aaggaacgaacagtgatggtgtaacgaggaccgagaaatacagttttgttaaaagagatc2400
cagcgtcggccaaaaccatcggctatcaaaatccgaatcattggagccaggtaaatgctt2460
atatctataaacatgatgggagccgagtaattgaattgaccggatcttggcctggaaaac2520
caatgactaaaaatgcagacggaatttacacgctgacgctgcctgcggacacggatacaa2580
ccaacgcaaaagtgatttttaataatggcagcgcccaagtgcccggtcagaatcagcctg2640
gctttgattacgtgctaaatggtttatataatgactcgggcttaagcggttctcttcccc2700
attga2705。
所述基因表达框tpu1及tpu2均含有普鲁兰酶分泌信号肽编码序列以及用于重组的同源臂序列，tpu1中所述信号肽的核苷酸序列如下：
atgcttacattccatcgtatcatccgtaaaggctggatgttccttcttgctttccttctt60
acagcttctcttttctgccctacaggccaacatgctaaagctgctgct108；
tpu2中所述信号肽的核苷酸序列如下：
atgcttatcaacaaatctaaaaaattcttcgttttctctttcatcttcgttatgatgctt60
tctctttctttcgttaacggcgaagttgctaaagctgct99。
所述基因表达框tpu1中含有启动子pamy-cryiii及淀粉酶分泌的信号肽序列spamyl，核苷酸序列如下：
atcgattgtttgagaaaagaagaagaccataaaaataccttgtctgtcatcagacagggt60
attttttatgctgtccagactgtccgctgtgtaaaaaaaaggaataaaggggggttgaca120
ttattttactgatatgtataatataatttgtataagaaaatggagtcgaaacgtaagatg180
aaaccttagataaaagtgctttttttgttgcaattgaagaattattaatgttaagcttaa240
ttaaagataatatctttgaattgtaacgcccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaat300
acgttatatagaaatatgtttgaaccttcttcagattacaaatatattcggacggactct360
acctcaaatgcttatctaactatagaatgacatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaa420
tataactaccaatgaacttgttcatgtgaattatcgctttatttaattttctcaattcaa480
tatataatatgccaatacattgttacaagtagaaattaagacacccttgatagccttact540
atacctaacatgatgtagtattaaatgaatatgtaaatatatttatgataagaagcgact600
tatttataatcattacatatttttctattggaatgattaagattccaatagaatagtgta660
taaattatttatcttgaaaggagggatgcctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatt720
tgcaccgtctaatggatttatgaaaaatcattttatcagtttgaaaattatgtattatgc780
ttacattccatcgtatcatccgtaaaggctggatgttccttcttgctttccttcttacag840
cttctcttttctgccctacaggccaacatgctaaagctgctgct884；
所述基因表达框tpu2中含有启动子pxyla-cryiii及来自几丁质酶分泌的信号肽序列spchit，核苷酸序列如下：
tagaatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattggaatagacatttattttg60
tatatgatgaaataaagttagtttattggataaacaaactaactttattaaggtagttga120
tggataaacttgttcacttaaatcaatcgaaacgtaagatgaaaccttagataaaagtgc180
tttttttgttgcaattgaagaattattaatgttaagcttaattaaagataatatctttga240
attgtaacgcccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaatacgttatatagaaatatgt300
ttgaaccttcttcagattacaaatatattcggacggactctacctcaaatgcttatctaa360
ctatagaatgacatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaatataactaccaatgaactt420
gttcatgtgaattatcgctttatttaattttctcaattcaatatataatatgccaataca480
ttgttacaagtagaaattaagacacccttgatagccttactatacctaacatgatgtagt540
attaaatgaatatgtaaatatatttatgataagaagcgacttatttataatcattacata600
tttttctattggaatgattaagattccaatagaatagtgtataaattatttatcttgaaa660
ggagggatgcctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatttgcaccgtctaatggattt720
atgaaaaatcattttatcagtttgaaaattatgtattatgcttatcaacaaatctaaaaa780
attcttcgttttctctttcatcttcgttatgatgctttctctttctttcgttaacggcga840
agttgctaaagctgct856。
本发明的有益效果是：与现有的菌株诱变或者分子生物学构建技术相比，本发明综合利用枯草芽孢杆菌表达系统的特点和优势，以基因设计结合基因合成的方式获取线性的人工dna片断；dna片断中含有分子生物学操作后期所需的抗性基因及重组序列，利用不同抗性基因的筛选，获得双拷贝的表达基因，再利用特异性重组，一次性地将抗性基因敲除；设计的表达元件中充分利用了rna稳定因子、高效分泌肽等元素，将重组枯草芽孢杆菌高分泌的优势尽量发挥出来；最终得到产普鲁兰酶的、无抗的重组枯草芽孢杆菌cnp2，该重组菌株经生物反应器发酵证实可以高产普鲁兰酶，发酵32h的酶活大于1000u/ml。
附图说明
图1为重组枯草芽孢杆菌的构建示意图；
图2为重组枯草芽孢杆菌cnp2的发酵酶活随发酵时间变化的示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1：重组枯草芽孢杆菌cnp2的构建
1.整合型dna的获得
普鲁兰酶表达的操纵子有两个，第一个pulb1包括人工串联启动子pamy-cryiii、密码子优化的淀粉酶分泌的信号肽序列spamyl以及密码子优化的普鲁兰酶编码基因pulb，pulb序列见seqidno.3，pulb1序列见seqidno.10；第二个pulb2包括人工串联启动子pxyla-cryiii、密码子优化的几丁质酶分泌的信号肽序列spchit以及密码子优化的普鲁兰酶编码基因pulb，pulb2序列见seqidno.11。
用于apre敲除的重组臂及红霉素抗性片段的基因表达框apr-erm-apr如seqidno.8所示，用于amye敲除的重组臂及卡那霉素抗性片段的基因表达框amy-kan-amy如seqidno.9所示。
把pulb1插入apr-erm-apr的psti和bamhi位点，通过人工合成的方式获得基因表达框tpu1，把pulb2插入amy-kan-amy的psti和bamhi位点，通过人工合成的方式获得基因表达框tpu2。tpu1和tpu2的序列分别见seqidno.4和seqidno.5。
2.重组枯草芽孢杆菌的构建
首先挑取a164单菌落于含有3ml液体lb培养基的试管中，37℃、200r/min过夜培养；然后取3ml过夜培养菌液转接到新鲜的40ml富集培养基中37℃、200r/min培养至od600=0.85-0.95，富集培养基的配方为lb+90g/l山梨醇；再将菌液冰水浴10min，然后5000g，5min，4℃离心后收集菌体；接着用30ml预冷的电转培养基，重新悬浮菌体，5000g离心5min，4℃离心去上清，如此操作3次，电转培养基的配方为10g/l葡萄糖+92.5g/l甘露醇+90g/l山梨醇；洗三次后，利用未完全除去的电转培养基将菌体重悬后，然后分装到1.5ml无菌离心管中，每管分装100μl，冰上操作；最后在100μl感受态细胞中加入2μg线性dna片段tpu1，冰上孵育2min，加入预冷的电转杯(1mm)中，设置电压2.5kv，电击一次；电击完毕取出杯子并立即加入500μl复苏培养基，37℃、200r/min培养，复苏培养基的组分为lb+90g/l山梨醇+70g/l甘露醇；复苏3h后，分别涂红霉素抗性板，37℃恒温箱过夜培养，其中，红霉素(erm)浓度为10μg/ml。
对筛选得到的转化子，采用菌落pcr的方式进行验证，所用的引物序列见下。
上游引物1p-f：cacccttgatagccttactatacctaac
下游引物1p-r：gatgttatcagaagggtaagaagg
反应体系如下：
pcr程序如下：
1)98℃，2min
2)98℃，30sec
3)52℃，30sec
4)72℃，30sec
5)循环从2)到4)，30次
6)72℃，5min
7)4℃，保存。
经验证为阳性的转化子命名为cnp1，然后采取上述相同的转化方法，用线性片段tpu2转化cnp1，红霉素和卡那霉素双抗性板筛选，其中，卡那霉素(kan)的浓度为10μg/ml。
对筛选得到的转化子，采用菌落pcr的方式进行验证，所用的引物序列见下。
上游引物2p-f：cggacggactctacctcaaatgc
下游引物2p-r：gcgttagaaacagcaggttgagc
反应体系如下：
反应程序和cnp1的验证方法一致。
经验证为阳性的转化子命名为cnp2ek，然后采用上述相同的方法，用cre酶表达质粒pmk4-cre转化cnp2ek，氯霉素抗性板筛选，其中，氯霉素(cm)的浓度为5μg/ml。
对于筛选得到的转化子，采用传代的方式丢失质粒pmk4-cre，取10μl菌液接种到新鲜的3ml液体lb培养基中，37℃、200r/min培养，每隔8h转接1次，总共转接5次，然后取培养液梯度稀释至106倍，涂lb平板，置于恒温培养箱37℃、200r/min培养；待长出新鲜菌落，分别印章至氯霉素、红霉素和卡那霉素平板进行抗性反筛。在3种抗性平板上均不能生长的菌，其在无抗lb平板上对应的菌落为消除质粒的菌株，为目的菌株。再对其进行菌落pcr验证，第一对引物为1p-f/1p-r，第二对引物为2p-f/2p-r。经验证均为阳性的菌株，命名为cnp2，为带有两份拷贝pulb的无抗的普鲁兰酶生产菌株。
实施例2：重组枯草芽孢杆菌cnp2的发酵产酶
以重组枯草芽孢杆菌cnp2为生产菌种，做摇瓶发酵：用接种环挑取重组枯草芽孢杆菌cnp2接种到装有25ml液体培养基的200ml挡板瓶中，37℃、200r/min进行发酵培养，其中，培养基的主要组分为玉米浆、麦芽糖浆、葡萄糖、酵母粉和无机盐离子等。发酵20h取样测定酶活，普鲁兰酶酶活测定方法为：取1.0ml的ph=4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制酶样或稀释样品（对照组为沸水浴灭活的样品），将其加到1.0ml0.5%的普鲁兰多糖溶液中，于60℃水浴锅中水浴30min，再加入3,5-二硝基水杨酸溶液（dns）3.0ml，沸水浴10min，取出后流水冷却，于550nm测吸光值。一个酶活力单位定义为：在上述反应条件下，每分钟分解普鲁兰多糖释放出1μmol葡萄糖所需的酶量。测得的摇瓶发酵20h的酶活力约为225u/ml。
采用上罐补料的方式进行发酵，在20l罐中，以流加麦芽糖浆和氨水控制发酵罐的ph在5.80左右，通风搅拌，溶氧控制为30%左右，还原糖控制为10g/l左右。取样并测定酶活，普鲁兰酶的活力随发酵时间变化曲线的结果如图例2所示。其中，在32h左右，酶活力超过1000u/ml。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
sequencelisting
<110>白银赛诺生物科技有限公司
<120>高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法
<130>
<160>12
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>108
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>spchit
<400>1
atgcttacattccatcgtatcatccgtaaaggctggatgttccttcttgctttccttctt60
acagcttctcttttctgccctacaggccaacatgctaaagctgctgct108
<210>2
<211>99
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>spamyl
<400>2
atgcttatcaacaaatctaaaaaattcttcgttttctctttcatcttcgttatgatgctt60
tctctttctttcgttaacggcgaagttgctaaagctgct99
<210>3
<211>2460
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>pulb
<400>3
caacctgctgtttctaacgcttaccttgatgcttctaaccaagttcttgttaaactttct60
caacctttcacacttggcgaaggctcttctggcttcacagttcatgatgatacagctaac120
aaagatatccctgttacatctgtttctgatgctaaccaagttacagctgttcttgctggc180
acattccaacatatcttcggcggctctgattgggctcctgataaccataacacacttctt240
aaaaaagttaactctaacctttaccaattctctggcaaccttcctgaaggcaactaccaa300
tacaaagttgctcttaacgattcttggaacaacccttcttacccttctgataacatcaac360
cttacagttcctgctggcggcgctcatgttacattctcttacatcccttctacacatgct420
gtttacgatacaatcaacaaccctaacgctgatcttcaagttgattcttctggcgttaaa480
acagatcttgttgctgttacacttggcgaaaaccctgatgtttctcatacactttctatc540
caaacagaagattaccaagctggccaagttatccctcgtaaagttcttgattcttctcaa600
tactactactctggcgatgatcttggcaacacatacacaaaaaacgctacaacattcaaa660
gtttgggctcctacatctacacaagttaacgttcttctttacaactctgctacaggcgct720
gttacaaaaacagttcctatgacagcttctggccatggcgtttgggaagctacagttaac780
caagatcttgaaaactggtactacatgtacgaagttacaggccaaggctctacacgtaca840
gctgttgatccttacgctacagctatcgctcctaacggcacacgtggcatgatcgttgat900
cttgctaaaacagatcctgctggctgggaatctgataaacatatcacacctaaaaacatc960
gaagatgaagttatctacgaaatggatgttcgtgatttctctatcgattctaactctggc1020
atgaaaaacaaaggcaaataccttgctcttacagaaaaaggcacaaaaggccctgataac1080
gttaaaacaggcgttgattctcttaaacaacttggcatcacacatgttcaacttcaacct1140
gttttcgctttcaactctgttaacgaaaacgatcctacacaatacaactggggctacgat1200
cctcgtaactacaacgttcctgaaggccaatacgctacaaacgctaacggcacaacacgt1260
atcaaagaattcaaagaaatggttctttctcttcatcaagatcatatcggcgttaacatg1320
gatgttgtttacaaccatacattcgctacacaaatctctgatttcgataaaatcgttcct1380
gaatactactaccgtacagatgatgctggcaactacacaaacggctctggcacaggcaac1440
gaaatcgctgctgaacgtcctatggttcaaaaattcatcatcgattctcttaaattctgg1500
gttaacgaataccatgttgatggcttccgtttcgatcttatggctcttcttggcaaagat1560
acaatgtctaaagctgctacacaacttcatgctatcgatcctggcatcgctctttacggc1620
gaaccttggacaggcggcacatctgctcttcctgctgatcaacttcttacaaaaggcgct1680
caaaaaggcatgggcgttgctgttttcaacgataaccttcgtaacggccttgatggctct1740
gttttcgattcttctgctcaaggcttcgctacaggcgctacaggccttacagatgctatc1800
aaaaacggcgttgaaggctctatcaacgatttcacagcttctcctggcgaaacaatcaac1860
tacgttacatctcatgataactacacactttgggataaaatcgctcaatctaaccctaac1920
gattctgaagctgatcgtatcaaaatggatgaacttgctcaagctatcgttatgacatct1980
caaggcatccctttcatgcaaggcggcgaagaaatgcttcgtacaaaaggcggcaacgat2040
aactcttacaacgctggcgatgttgttaacgaattcgattggtctcgtaaagctcaatac2100
cctgatgttttcaactactactctggccttatccatcttcgtcttgatcatcctgctttc2160
cgtatgacaacagctaacgaaatcaactctcatcttcaattccttaactctcctgaaaac2220
acagttgcttacgaactttctgatcatgctaacaaagatacatggggcaacatcgttgtt2280
atctacaaccctaacaaaacagctgaaacaatcaaccttccttctggcaaatgggaaatc2340
aacgctacatctggcaaagttggcgaatctacacttggccaagctgaaggctctgttcaa2400
gttcctggcatctctatgatgatccttcatcaagaagtttctccttctgatggcaaataa2460
<210>4
<211>5885
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>tpu1
<400>4
caaatgcgctgaatgcctatgttacaggaattggggccaataaacggattgtattgtggg60
atacgacgctgaacaaacttgacgattcagaaattctgtttattatgggccacgaaatgg120
gccattatgtcatgaagcacgtttacatcggtctggctggctatttgctcgtgtcgctcg180
ccggattttatgtcattgataagctttacaagcggacggttcgcctaacccgcagcatgt240
ttcatttagaagggcggcatgatcttgcggcacttccgctgttattgcttttgttttctg300
ttttgagctttgcggttacgcctttttctaatgctgtctcgcgttatcaggagaataagg360
ctgaccagtatgggatcgagttgacagagaacagagaagccgctgttaaaacgtttcagg420
atttggccgtgacggggctgagccaggttgatcctccggtgcttgtgaagattttcagag480
gcagccatccgtcgatcatggaacggattcaacatgcggagaaagaagagaatgcgccgg540
aacatcaggatgctgacaaataaaaagaagcaggtatggaggaacctgcttctttttact600
attattgtgcagctgcttgcctgcactgcagatcgattgtttgagaaaagaagaagacca660
taaaaataccttgtctgtcatcagacagggtattttttatgctgtccagactgtccgctg720
tgtaaaaaaaaggaataaaggggggttgacattattttactgatatgtataatataattt780
gtataagaaaatggagtcgaaacgtaagatgaaaccttagataaaagtgctttttttgtt840
gcaattgaagaattattaatgttaagcttaattaaagataatatctttgaattgtaacgc900
ccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaatacgttatatagaaatatgtttgaaccttc960
ttcagattacaaatatattcggacggactctacctcaaatgcttatctaactatagaatg1020
acatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaatataactaccaatgaacttgttcatgtga1080
attatcgctttatttaattttctcaattcaatatataatatgccaatacattgttacaag1140
tagaaattaagacacccttgatagccttactatacctaacatgatgtagtattaaatgaa1200
tatgtaaatatatttatgataagaagcgacttatttataatcattacatatttttctatt1260
ggaatgattaagattccaatagaatagtgtataaattatttatcttgaaaggagggatgc1320
ctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatttgcaccgtctaatggatttatgaaaaatc1380
attttatcagtttgaaaattatgtattatgcttacattccatcgtatcatccgtaaaggc1440
tggatgttccttcttgctttccttcttacagcttctcttttctgccctacaggccaacat1500
gctaaagctgctgctcaacctgctgtttctaacgcttaccttgatgcttctaaccaagtt1560
cttgttaaactttctcaacctttcacacttggcgaaggctcttctggcttcacagttcat1620
gatgatacagctaacaaagatatccctgttacatctgtttctgatgctaaccaagttaca1680
gctgttcttgctggcacattccaacatatcttcggcggctctgattgggctcctgataac1740
cataacacacttcttaaaaaagttaactctaacctttaccaattctctggcaaccttcct1800
gaaggcaactaccaatacaaagttgctcttaacgattcttggaacaacccttcttaccct1860
tctgataacatcaaccttacagttcctgctggcggcgctcatgttacattctcttacatc1920
ccttctacacatgctgtttacgatacaatcaacaaccctaacgctgatcttcaagttgat1980
tcttctggcgttaaaacagatcttgttgctgttacacttggcgaaaaccctgatgtttct2040
catacactttctatccaaacagaagattaccaagctggccaagttatccctcgtaaagtt2100
cttgattcttctcaatactactactctggcgatgatcttggcaacacatacacaaaaaac2160
gctacaacattcaaagtttgggctcctacatctacacaagttaacgttcttctttacaac2220
tctgctacaggcgctgttacaaaaacagttcctatgacagcttctggccatggcgtttgg2280
gaagctacagttaaccaagatcttgaaaactggtactacatgtacgaagttacaggccaa2340
ggctctacacgtacagctgttgatccttacgctacagctatcgctcctaacggcacacgt2400
ggcatgatcgttgatcttgctaaaacagatcctgctggctgggaatctgataaacatatc2460
acacctaaaaacatcgaagatgaagttatctacgaaatggatgttcgtgatttctctatc2520
gattctaactctggcatgaaaaacaaaggcaaataccttgctcttacagaaaaaggcaca2580
aaaggccctgataacgttaaaacaggcgttgattctcttaaacaacttggcatcacacat2640
gttcaacttcaacctgttttcgctttcaactctgttaacgaaaacgatcctacacaatac2700
aactggggctacgatcctcgtaactacaacgttcctgaaggccaatacgctacaaacgct2760
aacggcacaacacgtatcaaagaattcaaagaaatggttctttctcttcatcaagatcat2820
atcggcgttaacatggatgttgtttacaaccatacattcgctacacaaatctctgatttc2880
gataaaatcgttcctgaatactactaccgtacagatgatgctggcaactacacaaacggc2940
tctggcacaggcaacgaaatcgctgctgaacgtcctatggttcaaaaattcatcatcgat3000
tctcttaaattctgggttaacgaataccatgttgatggcttccgtttcgatcttatggct3060
cttcttggcaaagatacaatgtctaaagctgctacacaacttcatgctatcgatcctggc3120
atcgctctttacggcgaaccttggacaggcggcacatctgctcttcctgctgatcaactt3180
cttacaaaaggcgctcaaaaaggcatgggcgttgctgttttcaacgataaccttcgtaac3240
ggccttgatggctctgttttcgattcttctgctcaaggcttcgctacaggcgctacaggc3300
cttacagatgctatcaaaaacggcgttgaaggctctatcaacgatttcacagcttctcct3360
ggcgaaacaatcaactacgttacatctcatgataactacacactttgggataaaatcgct3420
caatctaaccctaacgattctgaagctgatcgtatcaaaatggatgaacttgctcaagct3480
atcgttatgacatctcaaggcatccctttcatgcaaggcggcgaagaaatgcttcgtaca3540
aaaggcggcaacgataactcttacaacgctggcgatgttgttaacgaattcgattggtct3600
cgtaaagctcaataccctgatgttttcaactactactctggccttatccatcttcgtctt3660
gatcatcctgctttccgtatgacaacagctaacgaaatcaactctcatcttcaattcctt3720
aactctcctgaaaacacagttgcttacgaactttctgatcatgctaacaaagatacatgg3780
ggcaacatcgttgttatctacaaccctaacaaaacagctgaaacaatcaaccttccttct3840
ggcaaatgggaaatcaacgctacatctggcaaagttggcgaatctacacttggccaagct3900
gaaggctctgttcaagttcctggcatctctatgatgatccttcatcaagaagtttctcct3960
tctgatggcaaataaagaagcaggttcctccatacctgcttctttttaaggatccaagct4020
tgcggccgctaccgttcgtatagcatacattatacgaagttatttaaaccgtgtgctcta4080
cgaccaaaactataaaacctttaagaactttctttttttacaagaaaaaagaaattagat4140
aaatctctcatatcttttattcaataatcgcatccgattgcagtataaatttaacgatca4200
ctcatcatgttcatatttatcagagctcgtgctataattatactaattttataaggagga4260
aaaaatatgggcatttttagtatttttgtaatcagcacagttcattatcaaccaaacaaa4320
aaataagtggttataatgaatcgttaataagcaaaattcatataaccaaattaaggaggg4380
aaataatgaacgagaaaaatataaaacacagtcaaaactttattacttcaaaacataata4440
tagataaaataatgacaaatataagattaaatgaacatgataatatctttgaaatcggct4500
caggaaaaggccattttacccttgaattagtaaagaggtgtaatttcgtaactgccattg4560
aaatagaccataaattatgcaaaactacagaaaataaacttgttgatcacgataatttcc4620
aagttttaaacaaggatatattgcagtttaaatttcctaaaaaccaatcctataaaatat4680
atggtaatataccttataacataagtacggatataatacgcaaaattgtttttgatagta4740
tagctaatgagatttatttaatcgtggaatacgggtttgctaaaagattattaaatacaa4800
aacgctcattggcattacttttaatggcagaagttgatatttctatattaagtatggttc4860
caagagaatattttcatcctaaacctaaagtgaatagctcacttatcagattaagtagaa4920
aaaaatcaagaatatcacacaaagataaacaaaagtataattatttcgttatgaaatggg4980
ttaacaaagaatacaagaaaatatttacaaaaaatcaatttaacaattccttaaaacatg5040
caggaattgacgatttaaacaatattagctttgaacaattcttatctcttttcaatagct5100
ataaattatttaataagtaagttaagggatgcataaactgcatcccttaacttgtttttc5160
gtgtgcctattttttgtgaattgattatcgatcttttgcgccatggataacttcgtatag5220
catacattatacgaacggtacatatgcccgggggtaccgaattccctgctggtcgccatt5280
ttggctctttaccctctccttttaaaaaaattcagagtagacttacttaaaagactattc5340
tgtgaatttattgtaatagatggaataatattttagtagacccatttttttgagatgatt5400
ttatctctatttaggtatatcatctctcgctatttccgtagagactcgaaataactattt5460
tcatacagaaaagaacgaaaatagacatgagtaaatgttcattatgctgaaatgtcatgc5520
ttttttaggttaaatgctcctgagtcccggcaaattcctgtcgaaaaaattcgttcaaat5580
gacctgcgtgtgcttccgtgagaacaatggatattatcgtgatattttttcaaagcatga5640
tgataaaagtattctgaaaaataaactttacagaaaagggatagaatgaaaaaattattg5700
agagggaggaagaaataagatgaacattcgccaagcaaagacatcagatgcggccgccat5760
tgcgccgctgtttaaccaatatcgggaattttatagacaggcatccgatttgcaaggggc5820
agaggcttttttgaaagctcgtttggaaaatcacgagtctgttattttgatagcagaaga5880
aaatg5885
<210>5
<211>6055
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>tpu2
<400>5
atgtttgcaaaacgattcaaaacctctttactgccgttattcgctggatttttattgctg60
tttcatttggttctggcaggaccggcggctgcgagtgctgaaacggcgaacaaatcgaat120
gagcttacagcaccgtcgatcaaaagcggaaccattcttcatgcatggaattggtcgttc180
aatacgttaaaacacaatatgaaggatattcatgatgcaggatatacagccattcagaca240
tctccgattaaccaagtaaaggaagggaatcaaggagataaaagcatgtcgaactggtac300
tggctgtatcagccgacatcgtatcaaattggcaaccgttacttaggtactgaacaagaa360
tttaaagaaatgtgtgcagccgctgaagaatatggcataaaggtcattgttgacgcggtc420
atcaatcataccaccagtgattatgccgcgatttccaatgaggttaagagtattccaaac480
tggacacatggaaacacacaaattaaaaactggtctgatcgcctgcactgcatagaatct540
aatattataactaaattttctaaaaaaaacattggaatagacatttattttgtatatgat600
gaaataaagttagtttattggataaacaaactaactttattaaggtagttgatggataaa660
cttgttcacttaaatcaatcgaaacgtaagatgaaaccttagataaaagtgctttttttg720
ttgcaattgaagaattattaatgttaagcttaattaaagataatatctttgaattgtaac780
gcccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaatacgttatatagaaatatgtttgaacct840
tcttcagattacaaatatattcggacggactctacctcaaatgcttatctaactatagaa900
tgacatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaatataactaccaatgaacttgttcatgt960
gaattatcgctttatttaattttctcaattcaatatataatatgccaatacattgttaca1020
agtagaaattaagacacccttgatagccttactatacctaacatgatgtagtattaaatg1080
aatatgtaaatatatttatgataagaagcgacttatttataatcattacatatttttcta1140
ttggaatgattaagattccaatagaatagtgtataaattatttatcttgaaaggagggat1200
gcctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatttgcaccgtctaatggatttatgaaaaa1260
tcattttatcagtttgaaaattatgtattatgcttatcaacaaatctaaaaaattcttcg1320
ttttctctttcatcttcgttatgatgctttctctttctttcgttaacggcgaagttgcta1380
aagctgctcaacctgctgtttctaacgcttaccttgatgcttctaaccaagttcttgtta1440
aactttctcaacctttcacacttggcgaaggctcttctggcttcacagttcatgatgata1500
cagctaacaaagatatccctgttacatctgtttctgatgctaaccaagttacagctgttc1560
ttgctggcacattccaacatatcttcggcggctctgattgggctcctgataaccataaca1620
cacttcttaaaaaagttaactctaacctttaccaattctctggcaaccttcctgaaggca1680
actaccaatacaaagttgctcttaacgattcttggaacaacccttcttacccttctgata1740
acatcaaccttacagttcctgctggcggcgctcatgttacattctcttacatcccttcta1800
cacatgctgtttacgatacaatcaacaaccctaacgctgatcttcaagttgattcttctg1860
gcgttaaaacagatcttgttgctgttacacttggcgaaaaccctgatgtttctcatacac1920
tttctatccaaacagaagattaccaagctggccaagttatccctcgtaaagttcttgatt1980
cttctcaatactactactctggcgatgatcttggcaacacatacacaaaaaacgctacaa2040
cattcaaagtttgggctcctacatctacacaagttaacgttcttctttacaactctgcta2100
caggcgctgttacaaaaacagttcctatgacagcttctggccatggcgtttgggaagcta2160
cagttaaccaagatcttgaaaactggtactacatgtacgaagttacaggccaaggctcta2220
cacgtacagctgttgatccttacgctacagctatcgctcctaacggcacacgtggcatga2280
tcgttgatcttgctaaaacagatcctgctggctgggaatctgataaacatatcacaccta2340
aaaacatcgaagatgaagttatctacgaaatggatgttcgtgatttctctatcgattcta2400
actctggcatgaaaaacaaaggcaaataccttgctcttacagaaaaaggcacaaaaggcc2460
ctgataacgttaaaacaggcgttgattctcttaaacaacttggcatcacacatgttcaac2520
ttcaacctgttttcgctttcaactctgttaacgaaaacgatcctacacaatacaactggg2580
gctacgatcctcgtaactacaacgttcctgaaggccaatacgctacaaacgctaacggca2640
caacacgtatcaaagaattcaaagaaatggttctttctcttcatcaagatcatatcggcg2700
ttaacatggatgttgtttacaaccatacattcgctacacaaatctctgatttcgataaaa2760
tcgttcctgaatactactaccgtacagatgatgctggcaactacacaaacggctctggca2820
caggcaacgaaatcgctgctgaacgtcctatggttcaaaaattcatcatcgattctctta2880
aattctgggttaacgaataccatgttgatggcttccgtttcgatcttatggctcttcttg2940
gcaaagatacaatgtctaaagctgctacacaacttcatgctatcgatcctggcatcgctc3000
tttacggcgaaccttggacaggcggcacatctgctcttcctgctgatcaacttcttacaa3060
aaggcgctcaaaaaggcatgggcgttgctgttttcaacgataaccttcgtaacggccttg3120
atggctctgttttcgattcttctgctcaaggcttcgctacaggcgctacaggccttacag3180
atgctatcaaaaacggcgttgaaggctctatcaacgatttcacagcttctcctggcgaaa3240
caatcaactacgttacatctcatgataactacacactttgggataaaatcgctcaatcta3300
accctaacgattctgaagctgatcgtatcaaaatggatgaacttgctcaagctatcgtta3360
tgacatctcaaggcatccctttcatgcaaggcggcgaagaaatgcttcgtacaaaaggcg3420
gcaacgataactcttacaacgctggcgatgttgttaacgaattcgattggtctcgtaaag3480
ctcaataccctgatgttttcaactactactctggccttatccatcttcgtcttgatcatc3540
ctgctttccgtatgacaacagctaacgaaatcaactctcatcttcaattccttaactctc3600
ctgaaaacacagttgcttacgaactttctgatcatgctaacaaagatacatggggcaaca3660
tcgttgttatctacaaccctaacaaaacagctgaaacaatcaaccttccttctggcaaat3720
gggaaatcaacgctacatctggcaaagttggcgaatctacacttggccaagctgaaggct3780
ctgttcaagttcctggcatctctatgatgatccttcatcaagaagtttctccttctgatg3840
gcaaataaagaagcaggttcctccatacctgcttctttttaagggatccaagcttgcggc3900
cgctaccgttcgtatagcatacattatacgaagttatcgggccagtttgttgaagattag3960
atgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagttattaatagct4020
gaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaaagcaaatctaaaattatctga4080
aaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagagaagaaagaatgaagat4140
tgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgttaaggctattgg4200
tgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggccctattcggatattgagatgatgtg4260
tgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatggacaaccggtgagtggaaggt4320
ggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcaggtggaatcaga4380
ttggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgattcaggtggata4440
cttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttccacgatgcgat4500
ttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgtaatattcgtgt4560
gcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtacaggtagcaatggcaggtgccat4620
gttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgagcgcttcggtcttaactgaagc4680
agttaagcaatcagatcttccttcaggttatgaccatctgtgccagttcgtaatgtctgg4740
tcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgctagagaatttctggaatgggattca4800
ggagtggacagaacgacacggatatatagtggatgtgtcaaaacgcataccattttgaac4860
gatgacctctaataattgttaatcatgttggttacgtatttattaacttctcctagtatt4920
agtaattatcatggctgtcatcccgggataacttcgtatagcatacattatacgaacggt4980
acatatgcccgggggtaccgaattccctgctggtcgccattttggctcgacatggatgag5040
cgatgatgatatccgtttaggctgggcggtgatagcttctcgttcaggcagtacgcctct5100
tttcttttccagacctgagggaggcggaaatggtgtgaggttcccggggaaaagccaaat5160
aggcgatcgcgggagtgctttatttgaagatcaggctatcactgcggtcaatagatttca5220
caatgtgatggctggacagcctgaggaactctcgaacccgaatggaaacaaccagatatt5280
tatgaatcagcgcggctcacatggcgttgtgctggcaaatgcaggttcatcctctgtctc5340
tatcaatacggcaacaaaattgcctgatggcaggtatgacaataaagctggagcgggttc5400
atttcaagtgaacgatggtaaactgacaggcacgatcaatgccaggtctgtagctgtgct5460
ttatcctgatgatattgcaaaagcgcctcatgttttccttgagaattacaaaacaggtgt5520
aacacattctttcaatgatcaactgacgattaccttgcgtgcagatgcgaatacaacaaa5580
agccgtttatcaaatcaataatggaccagacgacaggcgtttaaggatggagatcaattc5640
acaatcggaaaaggagatccaatttggcaaaacatacaccatcatgttaaaaggaacgaa5700
cagtgatggtgtaacgaggaccgagaaatacagttttgttaaaagagatccagcgtcggc5760
caaaaccatcggctatcaaaatccgaatcattggagccaggtaaatgcttatatctataa5820
acatgatgggagccgagtaattgaattgaccggatcttggcctggaaaaccaatgactaa5880
aaatgcagacggaatttacacgctgacgctgcctgcggacacggatacaaccaacgcaaa5940
agtgatttttaataatggcagcgcccaagtgcccggtcagaatcagcctggctttgatta6000
cgtgctaaatggtttatataatgactcgggcttaagcggttctcttccccattga6055
<210>6
<211>884
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>pamy-cryiii-spamyl
<400>6
atcgattgtttgagaaaagaagaagaccataaaaataccttgtctgtcatcagacagggt60
attttttatgctgtccagactgtccgctgtgtaaaaaaaaggaataaaggggggttgaca120
ttattttactgatatgtataatataatttgtataagaaaatggagtcgaaacgtaagatg180
aaaccttagataaaagtgctttttttgttgcaattgaagaattattaatgttaagcttaa240
ttaaagataatatctttgaattgtaacgcccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaat300
acgttatatagaaatatgtttgaaccttcttcagattacaaatatattcggacggactct360
acctcaaatgcttatctaactatagaatgacatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaa420
tataactaccaatgaacttgttcatgtgaattatcgctttatttaattttctcaattcaa480
tatataatatgccaatacattgttacaagtagaaattaagacacccttgatagccttact540
atacctaacatgatgtagtattaaatgaatatgtaaatatatttatgataagaagcgact600
tatttataatcattacatatttttctattggaatgattaagattccaatagaatagtgta660
taaattatttatcttgaaaggagggatgcctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatt720
tgcaccgtctaatggatttatgaaaaatcattttatcagtttgaaaattatgtattatgc780
ttacattccatcgtatcatccgtaaaggctggatgttccttcttgctttccttcttacag840
cttctcttttctgccctacaggccaacatgctaaagctgctgct884
<210>7
<211>856
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>pxyla-cryiii-spchit
<400>7
tagaatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattggaatagacatttattttg60
tatatgatgaaataaagttagtttattggataaacaaactaactttattaaggtagttga120
tggataaacttgttcacttaaatcaatcgaaacgtaagatgaaaccttagataaaagtgc180
tttttttgttgcaattgaagaattattaatgttaagcttaattaaagataatatctttga240
attgtaacgcccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaatacgttatatagaaatatgt300
ttgaaccttcttcagattacaaatatattcggacggactctacctcaaatgcttatctaa360
ctatagaatgacatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaatataactaccaatgaactt420
gttcatgtgaattatcgctttatttaattttctcaattcaatatataatatgccaataca480
ttgttacaagtagaaattaagacacccttgatagccttactatacctaacatgatgtagt540
attaaatgaatatgtaaatatatttatgataagaagcgacttatttataatcattacata600
tttttctattggaatgattaagattccaatagaatagtgtataaattatttatcttgaaa660
ggagggatgcctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatttgcaccgtctaatggattt720
atgaaaaatcattttatcagtttgaaaattatgtattatgcttatcaacaaatctaaaaa780
attcttcgttttctctttcatcttcgttatgatgctttctctttctttcgttaacggcga840
agttgctaaagctgct856
<210>8
<211>2507
<212>dna
<213>敲除apre基因的同源片段
<400>8
caaatgcgctgaatgcctatgttacaggaattggggccaataaacggattgtattgtggg60
atacgacgctgaacaaacttgacgattcagaaattctgtttattatgggccacgaaatgg120
gccattatgtcatgaagcacgtttacatcggtctggctggctatttgctcgtgtcgctcg180
ccggattttatgtcattgataagctttacaagcggacggttcgcctaacccgcagcatgt240
ttcatttagaagggcggcatgatcttgcggcacttccgctgttattgcttttgttttctg300
ttttgagctttgcggttacgcctttttctaatgctgtctcgcgttatcaggagaataagg360
ctgaccagtatgggatcgagttgacagagaacagagaagccgctgttaaaacgtttcagg420
atttggccgtgacggggctgagccaggttgatcctccggtgcttgtgaagattttcagag480
gcagccatccgtcgatcatggaacggattcaacatgcggagaaagaagagaatgcgccgg540
aacatcaggatgctgacaaataaaaagaagcaggtatggaggaacctgcttctttttact600
attattgtgcagctgcttgcctgcactgcagggatccaagcttgcggccgctaccgttcg660
tatagcatacattatacgaagttatttaaaccgtgtgctctacgaccaaaactataaaac720
ctttaagaactttctttttttacaagaaaaaagaaattagataaatctctcatatctttt780
attcaataatcgcatccgattgcagtataaatttaacgatcactcatcatgttcatattt840
atcagagctcgtgctataattatactaattttataaggaggaaaaaatatgggcattttt900
agtatttttgtaatcagcacagttcattatcaaccaaacaaaaaataagtggttataatg960
aatcgttaataagcaaaattcatataaccaaattaaggagggaaataatgaacgagaaaa1020
atataaaacacagtcaaaactttattacttcaaaacataatatagataaaataatgacaa1080
atataagattaaatgaacatgataatatctttgaaatcggctcaggaaaaggccatttta1140
cccttgaattagtaaagaggtgtaatttcgtaactgccattgaaatagaccataaattat1200
gcaaaactacagaaaataaacttgttgatcacgataatttccaagttttaaacaaggata1260
tattgcagtttaaatttcctaaaaaccaatcctataaaatatatggtaatataccttata1320
acataagtacggatataatacgcaaaattgtttttgatagtatagctaatgagatttatt1380
taatcgtggaatacgggtttgctaaaagattattaaatacaaaacgctcattggcattac1440
ttttaatggcagaagttgatatttctatattaagtatggttccaagagaatattttcatc1500
ctaaacctaaagtgaatagctcacttatcagattaagtagaaaaaaatcaagaatatcac1560
acaaagataaacaaaagtataattatttcgttatgaaatgggttaacaaagaatacaaga1620
aaatatttacaaaaaatcaatttaacaattccttaaaacatgcaggaattgacgatttaa1680
acaatattagctttgaacaattcttatctcttttcaatagctataaattatttaataagt1740
aagttaagggatgcataaactgcatcccttaacttgtttttcgtgtgcctattttttgtg1800
aattgattatcgatcttttgcgccatggataacttcgtatagcatacattatacgaacgg1860
tacatatgcccgggggtaccgaattccctgctggtcgccattttggctctttaccctctc1920
cttttaaaaaaattcagagtagacttacttaaaagactattctgtgaatttattgtaata1980
gatggaataatattttagtagacccatttttttgagatgattttatctctatttaggtat2040
atcatctctcgctatttccgtagagactcgaaataactattttcatacagaaaagaacga2100
aaatagacatgagtaaatgttcattatgctgaaatgtcatgcttttttaggttaaatgct2160
cctgagtcccggcaaattcctgtcgaaaaaattcgttcaaatgacctgcgtgtgcttccg2220
tgagaacaatggatattatcgtgatattttttcaaagcatgatgataaaagtattctgaa2280
aaataaactttacagaaaagggatagaatgaaaaaattattgagagggaggaagaaataa2340
gatgaacattcgccaagcaaagacatcagatgcggccgccattgcgccgctgtttaacca2400
atatcgggaattttatagacaggcatccgatttgcaaggggcagaggcttttttgaaagc2460
tcgtttggaaaatcacgagtctgttattttgatagcagaagaaaatg2507
<210>9
<211>2705
<212>dna
<213>敲除amye基因的同源片段
<400>9
atgtttgcaaaacgattcaaaacctctttactgccgttattcgctggatttttattgctg60
tttcatttggttctggcaggaccggcggctgcgagtgctgaaacggcgaacaaatcgaat120
gagcttacagcaccgtcgatcaaaagcggaaccattcttcatgcatggaattggtcgttc180
aatacgttaaaacacaatatgaaggatattcatgatgcaggatatacagccattcagaca240
tctccgattaaccaagtaaaggaagggaatcaaggagataaaagcatgtcgaactggtac300
tggctgtatcagccgacatcgtatcaaattggcaaccgttacttaggtactgaacaagaa360
tttaaagaaatgtgtgcagccgctgaagaatatggcataaaggtcattgttgacgcggtc420
atcaatcataccaccagtgattatgccgcgatttccaatgaggttaagagtattccaaac480
tggacacatggaaacacacaaattaaaaactggtctgatcgcctgcactgcagggatcca540
agcttgcggccgctaccgttcgtatagcatacattatacgaagttatcgggccagtttgt600
tgaagattagatgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagtt660
attaatagctgaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaaagcaaatctaa720
aattatctgaaaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagagaagaaa780
gaatgaagattgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgtta840
aggctattggtgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggccctattcggatattg900
agatgatgtgtgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatggacaaccggtg960
agtggaaggtggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcagg1020
tggaatcagattggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgatt1080
caggtggatacttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttcc1140
acgatgcgatttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgta1200
atattcgtgtgcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtacaggtagcaatgg1260
caggtgccatgttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgagcgcttcggtct1320
taactgaagcagttaagcaatcagatcttccttcaggttatgaccatctgtgccagttcg1380
taatgtctggtcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgctagagaatttctgga1440
atgggattcaggagtggacagaacgacacggatatatagtggatgtgtcaaaacgcatac1500
cattttgaacgatgacctctaataattgttaatcatgttggttacgtatttattaacttc1560
tcctagtattagtaattatcatggctgtcatcccgggataacttcgtatagcatacatta1620
tacgaacggtacatatgcccgggggtaccgaattccctgctggtcgccattttggctcga1680
catggatgagcgatgatgatatccgtttaggctgggcggtgatagcttctcgttcaggca1740
gtacgcctcttttcttttccagacctgagggaggcggaaatggtgtgaggttcccgggga1800
aaagccaaataggcgatcgcgggagtgctttatttgaagatcaggctatcactgcggtca1860
atagatttcacaatgtgatggctggacagcctgaggaactctcgaacccgaatggaaaca1920
accagatatttatgaatcagcgcggctcacatggcgttgtgctggcaaatgcaggttcat1980
cctctgtctctatcaatacggcaacaaaattgcctgatggcaggtatgacaataaagctg2040
gagcgggttcatttcaagtgaacgatggtaaactgacaggcacgatcaatgccaggtctg2100
tagctgtgctttatcctgatgatattgcaaaagcgcctcatgttttccttgagaattaca2160
aaacaggtgtaacacattctttcaatgatcaactgacgattaccttgcgtgcagatgcga2220
atacaacaaaagccgtttatcaaatcaataatggaccagacgacaggcgtttaaggatgg2280
agatcaattcacaatcggaaaaggagatccaatttggcaaaacatacaccatcatgttaa2340
aaggaacgaacagtgatggtgtaacgaggaccgagaaatacagttttgttaaaagagatc2400
cagcgtcggccaaaaccatcggctatcaaaatccgaatcattggagccaggtaaatgctt2460
atatctataaacatgatgggagccgagtaattgaattgaccggatcttggcctggaaaac2520
caatgactaaaaatgcagacggaatttacacgctgacgctgcctgcggacacggatacaa2580
ccaacgcaaaagtgatttttaataatggcagcgcccaagtgcccggtcagaatcagcctg2640
gctttgattacgtgctaaatggtttatataatgactcgggcttaagcggttctcttcccc2700
attga2705
<210>10
<211>3378
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>pulb1
<400>10
atcgattgtttgagaaaagaagaagaccataaaaataccttgtctgtcatcagacagggt60
attttttatgctgtccagactgtccgctgtgtaaaaaaaaggaataaaggggggttgaca120
ttattttactgatatgtataatataatttgtataagaaaatggagtcgaaacgtaagatg180
aaaccttagataaaagtgctttttttgttgcaattgaagaattattaatgttaagcttaa240
ttaaagataatatctttgaattgtaacgcccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaat300
acgttatatagaaatatgtttgaaccttcttcagattacaaatatattcggacggactct360
acctcaaatgcttatctaactatagaatgacatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaa420
tataactaccaatgaacttgttcatgtgaattatcgctttatttaattttctcaattcaa480
tatataatatgccaatacattgttacaagtagaaattaagacacccttgatagccttact540
atacctaacatgatgtagtattaaatgaatatgtaaatatatttatgataagaagcgact600
tatttataatcattacatatttttctattggaatgattaagattccaatagaatagtgta660
taaattatttatcttgaaaggagggatgcctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatt720
tgcaccgtctaatggatttatgaaaaatcattttatcagtttgaaaattatgtattatgc780
ttacattccatcgtatcatccgtaaaggctggatgttccttcttgctttccttcttacag840
cttctcttttctgccctacaggccaacatgctaaagctgctgctcaacctgctgtttcta900
acgcttaccttgatgcttctaaccaagttcttgttaaactttctcaacctttcacacttg960
gcgaaggctcttctggcttcacagttcatgatgatacagctaacaaagatatccctgtta1020
catctgtttctgatgctaaccaagttacagctgttcttgctggcacattccaacatatct1080
tcggcggctctgattgggctcctgataaccataacacacttcttaaaaaagttaactcta1140
acctttaccaattctctggcaaccttcctgaaggcaactaccaatacaaagttgctctta1200
acgattcttggaacaacccttcttacccttctgataacatcaaccttacagttcctgctg1260
gcggcgctcatgttacattctcttacatcccttctacacatgctgtttacgatacaatca1320
acaaccctaacgctgatcttcaagttgattcttctggcgttaaaacagatcttgttgctg1380
ttacacttggcgaaaaccctgatgtttctcatacactttctatccaaacagaagattacc1440
aagctggccaagttatccctcgtaaagttcttgattcttctcaatactactactctggcg1500
atgatcttggcaacacatacacaaaaaacgctacaacattcaaagtttgggctcctacat1560
ctacacaagttaacgttcttctttacaactctgctacaggcgctgttacaaaaacagttc1620
ctatgacagcttctggccatggcgtttgggaagctacagttaaccaagatcttgaaaact1680
ggtactacatgtacgaagttacaggccaaggctctacacgtacagctgttgatccttacg1740
ctacagctatcgctcctaacggcacacgtggcatgatcgttgatcttgctaaaacagatc1800
ctgctggctgggaatctgataaacatatcacacctaaaaacatcgaagatgaagttatct1860
acgaaatggatgttcgtgatttctctatcgattctaactctggcatgaaaaacaaaggca1920
aataccttgctcttacagaaaaaggcacaaaaggccctgataacgttaaaacaggcgttg1980
attctcttaaacaacttggcatcacacatgttcaacttcaacctgttttcgctttcaact2040
ctgttaacgaaaacgatcctacacaatacaactggggctacgatcctcgtaactacaacg2100
ttcctgaaggccaatacgctacaaacgctaacggcacaacacgtatcaaagaattcaaag2160
aaatggttctttctcttcatcaagatcatatcggcgttaacatggatgttgtttacaacc2220
atacattcgctacacaaatctctgatttcgataaaatcgttcctgaatactactaccgta2280
cagatgatgctggcaactacacaaacggctctggcacaggcaacgaaatcgctgctgaac2340
gtcctatggttcaaaaattcatcatcgattctcttaaattctgggttaacgaataccatg2400
ttgatggcttccgtttcgatcttatggctcttcttggcaaagatacaatgtctaaagctg2460
ctacacaacttcatgctatcgatcctggcatcgctctttacggcgaaccttggacaggcg2520
gcacatctgctcttcctgctgatcaacttcttacaaaaggcgctcaaaaaggcatgggcg2580
ttgctgttttcaacgataaccttcgtaacggccttgatggctctgttttcgattcttctg2640
ctcaaggcttcgctacaggcgctacaggccttacagatgctatcaaaaacggcgttgaag2700
gctctatcaacgatttcacagcttctcctggcgaaacaatcaactacgttacatctcatg2760
ataactacacactttgggataaaatcgctcaatctaaccctaacgattctgaagctgatc2820
gtatcaaaatggatgaacttgctcaagctatcgttatgacatctcaaggcatccctttca2880
tgcaaggcggcgaagaaatgcttcgtacaaaaggcggcaacgataactcttacaacgctg2940
gcgatgttgttaacgaattcgattggtctcgtaaagctcaataccctgatgttttcaact3000
actactctggccttatccatcttcgtcttgatcatcctgctttccgtatgacaacagcta3060
acgaaatcaactctcatcttcaattccttaactctcctgaaaacacagttgcttacgaac3120
tttctgatcatgctaacaaagatacatggggcaacatcgttgttatctacaaccctaaca3180
aaacagctgaaacaatcaaccttccttctggcaaatgggaaatcaacgctacatctggca3240
aagttggcgaatctacacttggccaagctgaaggctctgttcaagttcctggcatctcta3300
tgatgatccttcatcaagaagtttctccttctgatggcaaataaagaagcaggttcctcc3360
atacctgcttctttttaa3378
<210>11
<211>3350
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>pulb2
<400>11
tagaatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattggaatagacatttattttg60
tatatgatgaaataaagttagtttattggataaacaaactaactttattaaggtagttga120
tggataaacttgttcacttaaatcaatcgaaacgtaagatgaaaccttagataaaagtgc180
tttttttgttgcaattgaagaattattaatgttaagcttaattaaagataatatctttga240
attgtaacgcccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaatacgttatatagaaatatgt300
ttgaaccttcttcagattacaaatatattcggacggactctacctcaaatgcttatctaa360
ctatagaatgacatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaatataactaccaatgaactt420
gttcatgtgaattatcgctttatttaattttctcaattcaatatataatatgccaataca480
ttgttacaagtagaaattaagacacccttgatagccttactatacctaacatgatgtagt540
attaaatgaatatgtaaatatatttatgataagaagcgacttatttataatcattacata600
tttttctattggaatgattaagattccaatagaatagtgtataaattatttatcttgaaa660
ggagggatgcctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatttgcaccgtctaatggattt720
atgaaaaatcattttatcagtttgaaaattatgtattatgcttatcaacaaatctaaaaa780
attcttcgttttctctttcatcttcgttatgatgctttctctttctttcgttaacggcga840
agttgctaaagctgctcaacctgctgtttctaacgcttaccttgatgcttctaaccaagt900
tcttgttaaactttctcaacctttcacacttggcgaaggctcttctggcttcacagttca960
tgatgatacagctaacaaagatatccctgttacatctgtttctgatgctaaccaagttac1020
agctgttcttgctggcacattccaacatatcttcggcggctctgattgggctcctgataa1080
ccataacacacttcttaaaaaagttaactctaacctttaccaattctctggcaaccttcc1140
tgaaggcaactaccaatacaaagttgctcttaacgattcttggaacaacccttcttaccc1200
ttctgataacatcaaccttacagttcctgctggcggcgctcatgttacattctcttacat1260
cccttctacacatgctgtttacgatacaatcaacaaccctaacgctgatcttcaagttga1320
ttcttctggcgttaaaacagatcttgttgctgttacacttggcgaaaaccctgatgtttc1380
tcatacactttctatccaaacagaagattaccaagctggccaagttatccctcgtaaagt1440
tcttgattcttctcaatactactactctggcgatgatcttggcaacacatacacaaaaaa1500
cgctacaacattcaaagtttgggctcctacatctacacaagttaacgttcttctttacaa1560
ctctgctacaggcgctgttacaaaaacagttcctatgacagcttctggccatggcgtttg1620
ggaagctacagttaaccaagatcttgaaaactggtactacatgtacgaagttacaggcca1680
aggctctacacgtacagctgttgatccttacgctacagctatcgctcctaacggcacacg1740
tggcatgatcgttgatcttgctaaaacagatcctgctggctgggaatctgataaacatat1800
cacacctaaaaacatcgaagatgaagttatctacgaaatggatgttcgtgatttctctat1860
cgattctaactctggcatgaaaaacaaaggcaaataccttgctcttacagaaaaaggcac1920
aaaaggccctgataacgttaaaacaggcgttgattctcttaaacaacttggcatcacaca1980
tgttcaacttcaacctgttttcgctttcaactctgttaacgaaaacgatcctacacaata2040
caactggggctacgatcctcgtaactacaacgttcctgaaggccaatacgctacaaacgc2100
taacggcacaacacgtatcaaagaattcaaagaaatggttctttctcttcatcaagatca2160
tatcggcgttaacatggatgttgtttacaaccatacattcgctacacaaatctctgattt2220
cgataaaatcgttcctgaatactactaccgtacagatgatgctggcaactacacaaacgg2280
ctctggcacaggcaacgaaatcgctgctgaacgtcctatggttcaaaaattcatcatcga2340
ttctcttaaattctgggttaacgaataccatgttgatggcttccgtttcgatcttatggc2400
tcttcttggcaaagatacaatgtctaaagctgctacacaacttcatgctatcgatcctgg2460
catcgctctttacggcgaaccttggacaggcggcacatctgctcttcctgctgatcaact2520
tcttacaaaaggcgctcaaaaaggcatgggcgttgctgttttcaacgataaccttcgtaa2580
cggccttgatggctctgttttcgattcttctgctcaaggcttcgctacaggcgctacagg2640
ccttacagatgctatcaaaaacggcgttgaaggctctatcaacgatttcacagcttctcc2700
tggcgaaacaatcaactacgttacatctcatgataactacacactttgggataaaatcgc2760
tcaatctaaccctaacgattctgaagctgatcgtatcaaaatggatgaacttgctcaagc2820
tatcgttatgacatctcaaggcatccctttcatgcaaggcggcgaagaaatgcttcgtac2880
aaaaggcggcaacgataactcttacaacgctggcgatgttgttaacgaattcgattggtc2940
tcgtaaagctcaataccctgatgttttcaactactactctggccttatccatcttcgtct3000
tgatcatcctgctttccgtatgacaacagctaacgaaatcaactctcatcttcaattcct3060
taactctcctgaaaacacagttgcttacgaactttctgatcatgctaacaaagatacatg3120
gggcaacatcgttgttatctacaaccctaacaaaacagctgaaacaatcaaccttccttc3180
tggcaaatgggaaatcaacgctacatctggcaaagttggcgaatctacacttggccaagc3240
tgaaggctctgttcaagttcctggcatctctatgatgatccttcatcaagaagtttctcc3300
ttctgatggcaaataaagaagcaggttcctccatacctgcttctttttaa3350
<210>12
<211>6932
<212>dna
<213>artificial
<220>
<223>pmk4-cre
<400>12
gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggca60
cgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagct120
cactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaat180
tgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgg240
ctgcaggtcgacggatccccgggaattctacacagcccagtccagactattcggcactga300
aattatgggtgaagtggtcaagacctcactaggcaccttaaaaatagcgcaccctgaaga360
agatttatttgaggtagcccttgcctacctagcttccaagaaagatatcctaacagcaca420
agagcggaaagatgttttgttctacatccagaacaacctctgctaaaattcctgaaaaat480
tttgcaaaaagttgttgactttatctacaaggtgtggcataatgtgtggaattgtgagcg540
gataacaattaagcttaaggaggaagcaggtatgtccaatttactgaccgtacaccaaaa600
tttgcctgcattaccggtcgatgcaacgagtgatgaggttcgcaagaacctgatggacat660
gttcagggatcgccaggcgttttctgagcatacctggaaaatgcttctgtccgtttgccg720
gtcgtgggcggcatggtgcaagttgaataaccggaaatggtttcccgcagaacctgaaga780
tgttcgcgattatcttctatatcttcaggcgcgcggtctggcagtaaaaactatccagca840
acatttgggccagctaaacatgcttcatcgtcggtccgggctgccacgaccaagtgacag900
caatgctgtttcactggttatgcggcggatccgaaaagaaaacgttgatgccggtgaacg960
tgcaaaacaggctctagcgttcgaacgcactgatttcgaccaggttcgttcactcatgga1020
aaatagcgatcgctgccaggatatacgtaatctggcatttctggggattgcttataacac1080
cctgttacgtatagccgaaattgccaggatcagggttaaagatatctcacgtactgacgg1140
tgggagaatgttaatccatattggcagaacgaaaacgctggttagcaccgcaggtgtaga1200
gaaggcacttagcctgggggtaactaaactggtcgagcgatggatttccgtctctggtgt1260
agctgatgatccgaataactacctgttttgccgggtcagaaaaaatggtgttgccgcgcc1320
atctgccaccagccagctatcaactcgcgccctggaagggatttttgaagcaactcatcg1380
attgatttacggcgctaaggatgactctggtcagagatacctggcctggtctggacacag1440
tgcccgtgtcggagccgcgcgagatatggcccgcgctggagtttcaataccggagatcat1500
gcaagctggtggctggaccaatgtaaatattgtcatgaactatatccgtaacctggatag1560
tgaaacaggggcaatggtgcgcctgctggaagatggcgattaggcatgcgaattcactgg1620
ccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttg1680
cagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgccctt1740
cccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgc1800
atctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccg1860
catagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtc1920
tgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcaga1980
ggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttt2040
tataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaa2100
atgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctca2160
tgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattc2220
aacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctc2280
acccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggtt2340
acatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgtt2400
ttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacg2460
ccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtact2520
caccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctg2580
ccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccga2640
aggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttggg2700
aaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaa2760
tggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaac2820
aattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttc2880
cggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatca2940
ttgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacgggga3000
gtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgatta3060
agcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttc3120
atttttaatttaaaaggatctaggtgaagatccatatccttctttttctgaaccgacttc3180
tcctttttcgcttctttattccaattgctttattgacgttgagcctcggaacccttaaca3240
atcccaaaacttgtcgaatggtcggcttaatagctcacgctatgccgacattcgtctgca3300
agtttagttaagggttcttctcaacgcacaataaattttctcggcataaatgcgtggtct3360
aatttttatttttaataaccttgatagcaaaaaatgccattccaatacaaaaccacatac3420
ctataatcgataaccacataacagtcataaaaccactcctttttaacaaactttatcaca3480
agaaatatttaaattttaaatgcctttattttgaattttaaggggcattttaaagattta3540
ggggtaaatcatatagttttatgcctaaaaacctacagaagcttttaaaaagcaaatatg3600
agccaaataaatatattctaattctacaaacaaaaatttgagcaaattcagtgtcgattt3660
tttaagacactgcccagttacatgcaaattaaaattttcatgattttttatagttcctaa3720
cagggttaaaatttgtataacgaaagtataatgtttatataacgttagtataataaagca3780
ttttaacattatacttttgataatcgtttatcgtcgtcatcacaataacttttaaaatac3840
tcgtgcataattcaacagctgacctcccaataactacatggtgttatcgggaggtcagct3900
gttagcacttatattttgttattgttcttcctcgatttcgtctatcattttgtgattaat3960
ttctcttttttcttgttctgttaagtcataaagttcactagctaaatactctttttgttt4020
ccaaatataaaaaatttgatagatatattcggttggatcaatttcttttaagtaatctaa4080
atccccattttttaatttctttttagcctctttaaataatcctgaataaactaatacctg4140
tttacctttaagtgatttataaaatgcatcaaagactttttgatttattaaataatcact4200
atctttaccagaatacttagccatttcatataattctttattattattttgtcttatttt4260
ttgaacttgaacttgtgttatttctgaaatgcccgttacatcacgccataaatctaacca4320
ttcttgttggctaatataatatcttttatctgtgaaatacgatttatttactgcaattaa4380
cacatgaaaatgaggattataatcatctctttttttattatatgtaatctctaacttacg4440
aacatatccctttataacactacctactttttttctctttataagttttctaaaagaatt4500
attataacgttttatttcattttctaattcatcactcattacattaggtgtagtcaaagt4560
taaaaagataaactcctttttctcttgctgcttaatatattgcatcatcaaagataaacc4620
caatgcatcttttctagcttttctccaagcacagacaggacaaaatcgatttttacaaga4680
attagctttatataatttctgtttttctaaagttttatcagctacaaaagacagaaatgt4740
attgcaatcttcaactaaatccatttgattctctccaatatgacgtttaataaatttctg4800
aaatacttgatttctttgttttttctcagtatacttttccatgttataacacataaaaac4860
aacttagttttcacaaactatgacaataaaaaaagttgctttttcccctttctatgtatg4920
ttttttactagtcatttaaaacgatacattaataggtacgaaaaagcaactttttttgcg4980
cttaaaaccagtcataccaataacttaagggtaactagcctcgccggcaatagttaccct5040
tattatcaagataagaaagaaaaggatttttcgctacgctcaaatcctttaaaaaaacac5100
aaaagaccacattttttaatgtggtcttttattcttcaactaaagcacccattagttcaa5160
caaacgaaaattggataaagtgggatatttttaaaatatatatttatgttacagtaatat5220
tgacttttaaaaaaggattgattctaatgaagaaagcagacaagtaagcctcctaaattc5280
actttagataaaaatttaggaggcatatcaaatgaactttaataaaattgatttagacaa5340
ttggaagagaaaagagatatttaatcattatttgaaccaacaaacgacttttagtataac5400
cacagaaattgatattagtgttttataccgaaacataaaacaagaaggatataaatttta5460
ccctgcatttattttcttagtgacaagggtgataaactcaaatacagcttttagaactgg5520
ttacaatagcgacggagagttaggttattgggataagttagagccactttatacaatttt5580
tgatggtgtatctaaaacattctctggtatttggactcctgtaaagaatgacttcaaaga5640
gttttatgatttatacctttctgatgtagagaaatataatggttcggggaaattgtttcc5700
caaaacacctatacctgaaaatgctttttctctttctattattccatggacttcatttac5760
tgggtttaacttaaatatcaataataatagtaattaccttctacccattattacagcagg5820
aaaattcattaataaaggtaattcaatatatttaccgctatctttacaggtacatcattc5880
tgtttgtgatggttatcatgcaggattgtttatgaactctattcaggaattgtcagatag5940
gcctaatgactggcttttataatatgagataatgccgactgtactttttacagtcggttt6000
tctaatgtcactaacctgccccgttagttgaagaaggtttttatattacagctccagatc6060
taggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttc6120
cactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctg6180
cgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccg6240
gatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagatacca6300
aatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccg6360
cctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcg6420
tgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctga6480
acggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatac6540
ctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtat6600
ccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcc6660
tggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtga6720
tgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttc6780
ctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtg6840
gataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgag6900
cgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaaga6932
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！