本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种基于核糖核苷酸修饰引物的连接酶非依赖性基因克隆方法。
背景技术：
基因克隆技术的出现极大地促进了现代基因工程、蛋白质工程的发展。传统基因克隆技术涉及目标基因片段与质粒载体的限制性核酸内切酶消化、连接酶连接环化目标基因与质粒两步必不可少的操作。由于限制性核酸内切酶消化反应与dna连接酶反应，特别是限制性核酸内切酶消化反应，效率的高低直接决定着目标基因克隆能否成功。虽然利用碱性磷酸单酯酶除去线性化载体的5’磷酸基团，会大大提高阳性克隆百分比，但该操作异常繁琐，手法难于掌握，经常起不到应有作用。为了克服常规基因克隆方法的缺陷，开发了连接酶非依赖性克隆方法。其中基于t4dna聚合酶的连接酶非依赖性克隆方法是其中的一种方法（nucleicacidsresearch,vol.18,no.20p6069-6074），该方法通过在扩增目标基因的引物5’端添加一段特殊的碱基序列（一般为12-15个碱基），该段特殊碱基序列的3’端最后一个碱基是此段序列中唯一的一个该种碱基(例如dg)，在dctp的存在下目标基因与线性质粒载体与t4dna聚合酶一起温育，产生长的5’单链突出端，带有5’单链突出端的目标基因与线性质粒载体互补配对后，转化大肠杆菌修复目标基因与线性质粒载体间的缺口，完成目标基因的克隆。该方法操作缺点主要有：1）需要在目标基因与线性质粒载体的5’端引入一段特定的碱基序列，导致克隆的目标基因的两端附加了一段人为的碱基序列；2）引入的一段特定碱基序列有时较难设计，造成目标基因克隆困难。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有基因克隆技术的不足，提供一种新的连接酶非依赖性基因克隆方法，这种基因克隆技术不需要限制性核酸内切酶消化与连接酶反应，使得基因克隆操作简便、克隆效率与通量大大提高，可用于大规模基因克隆。
为了实现上述目的，在本发明中，用于扩增目标基因与质粒载体的引物片段（寡核苷酸片断）具有如下特征：引物5’端具有3-4个核糖核苷酸，核糖核苷酸间间隔4-6个脱氧核糖核苷酸；扩增目标基因的正向引物5’端至最后一个核糖核苷酸的连续碱基序列与扩增载体的反向引物5’端至最后一个核糖核苷酸的连续碱基序列互补配对，扩增目标基因的反向引物5’端至最后一个核糖核苷酸的连续碱基序列与扩增载体的正向引物5’端至最后一个核糖核苷酸的连续碱基序列互补配对；正向引物与反向引物扩增目标基因与质粒载体，扩增的dna片段5’端含有核糖核苷酸修饰。质粒载体pcr扩增产物经限制性内切核酸酶dpni消化环形质粒模板后；加入naoh至终浓度100mm，并95度热处理10分钟；然后加入等量hcl，中和加入的naoh。如此处理的dna片段会产生3’单链突出端（naoh热处理使dna片段在核糖核苷酸处发生断裂），3’单链突出端的长度为10-20个核苷酸。由于目标基因与质粒载体的3’突出端碱基序列互补配对，二者形成稳定的完全配对双链，不需要进行dna连接反应，可以直接转化大肠杆菌。转化后，大肠杆菌dna修复系统可以修复目标基因与质粒载体间的dna缺口，形成完整的含有目标基因的重组dna分子。
本发明的具体步骤如下：
1、设计合成用于扩增目标基因与质粒载体的引物序列。引物的序列特征是：（1）5’端具有3-4个核糖核苷酸，核糖核苷酸间间隔4-6个脱氧核糖核苷酸；（2）扩增目标基因的正向引物5’端至最后一个核糖核苷酸的连续碱基序列（5’端前10-20个碱基序列）与扩增载体的反向引物5’端至最后一个核糖核苷酸的连续碱基序列互补配对，扩增目标基因的反向引物5’端至最后一个核糖核苷酸的连续碱基序列与扩增载体的正向引物5’端至最后一个核糖核苷酸的连续碱基序列互补配对；（3）3’端下游碱基序列与待扩增dna片段两端碱基序列配对。
2、聚合酶链式反应（pcr）扩增目标基因与质粒载体线性化dna片段。将用于扩增dna片段（目标基因与质粒载体）的正向引物与反向引物、目标核酸模板分子（含目标基因的基因组dna或质粒载体dna）、高忠实度耐高温dna聚合酶（例如pfudna聚合酶）、4种脱氧核苷三磷酸（dntps）加入pcr反应缓冲液，进行反应。pcr条件同一般的液相聚合酶链式反应。
3、扩增的质粒载体线性化pcr产物中质粒模板的消除。用限制性核酸内切酶dpni（其特异性识别切割双链dna中a甲基化的gmatc序列）消化pcr产物中的质粒模板，由于质粒模板具有多处gmatc序列，dpni处理使得质粒模板变成很多段短的dna双链，这些短的dna双链转化大肠杆菌不能够产生克隆，从而消除了野生型质粒模板产生的假阳性克隆。
4、热碱处理扩增的目标基因与质粒载体线性化dna片段。100mmnaoh95度处理pcr产物5-10分钟，会使dna链在核糖核苷酸处发生断裂；由于核糖核苷酸间的脱氧核糖核苷酸数目为4-6个，因此在常温下4-6脱氧核糖核苷酸构成的短片断会与互补链分离，形成dna单链区。热碱处理后加入等量的hcl中和加入的naoh。因此热碱处理使得dna片段的两端产生长为10-20个核苷酸的3’突出端。
5、热碱处理的目标基因与质粒载体线性化dna片断间的杂交配对。将热碱处理的两种dna片断混合后，室温放置15分钟，使二者的3’突出端杂交配对，形成含目标基因的带缺口重组质粒。
6、含目标基因的带缺口重组质粒转化大肠杆菌。杂交混合物（该混合物中含有含目标基因的带缺口重组质粒）转化大肠杆菌感受态细胞，在固体培养基上37度培养过夜。在大肠杆菌的繁殖过程中，带缺口重组质粒中目标基因与质粒载体间的缺口会被修复，形成含目标基因的完整重组质粒。
7、含目标基因的完整重组质粒的鉴定。挑取单菌落，利用扩增目标基因的引物与taqdna聚合酶进行菌落pcr，鉴定含目标基因的完整重组质粒的阳性克隆。培养阳性克隆，并抽提含目标基因的完整重组质粒dna。
本发明与现有的基因克隆技术相比有显著的进步。主要优点如下：（1）含有目标基因的阳性克隆率高。由于采用pcr扩增质粒载体，消除了限制性核酸内切酶消化质粒造成的假阳性克隆（不含目标基因的质粒载体），从而极大地提高了阳性克隆比例。(2)操作通量大，适宜于多个目标基因同时克隆。基于核糖核苷酸修饰引物的连接酶非依赖性基因克隆方法在整个克隆过程中不需要任何酶，仅需热碱处理（形成长粘性末端），因此可以简单的扩大克隆通量，进行大规模基因克隆。（3）插入目标基因两端用于与载体互补的碱基序列随意。核糖核苷酸修饰的碱基配对规则与脱氧核糖核苷酸一样，使得3’突出端可以随意设计，大大方便了操作。（4）目标基因pcr扩增忠实性高。由于核糖核苷酸修饰不影响各种dna聚合酶催化的pcr反应，因此可以采用忠实性最高的pfudna聚合酶扩增目标基因，降低在pcr中引入突变的频率。此优点在构建目标基因（特别是长基因）的表达克隆中优势尤为明显，可以保证构建的表达载体能够表达出正确的重组蛋白。
本发明可用于基因克隆，基因片段拼接、目标基因定点突变等领域。目标基因与质粒载体无需限制性核酸内切酶消化，因此可以大大降低假阳性克隆（空质粒）百分比，提高目标基因克隆成功率。
附图说明
图1为本发明基于核糖核苷酸修饰引物的连接酶非依赖性基因克隆方法的原理图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例：
如图1所示，首先利用5’端具有3-4个核糖核苷酸的引物片段分别扩增目标基因与质粒载体，获得5’端具有3-4个核糖核苷酸的目标基因与线性化质粒载体的dna片段；然后利用热碱处理制备的dna分子，产生长10-20个核苷酸的3’单链突出端；由于目标基因与线性化质粒载体的3’单链突出端互补配对，二者混合杂交会形成含目标基因的带缺口重组质粒；该质粒转化大肠杆菌后，目标基因与质粒载体间的缺口会被大肠杆菌修复好，形成含目标基因的完整重组质粒，从而完成目标基因的克隆。
本发明一个实施例中的目标基因是衣原体内切核酸酶iv基因，要将其克隆到puc18载体，核糖核苷酸修饰存在于引物5’端第5、10、15位，具体实施步骤如下：
第一步，设计合成用于扩增衣原体内切核酸酶iv基因与puc18质粒的引物序列。4条引物分别为puc-18-u-f、puc-18-u-r、cpendoiv-f、cpendoiv-r。其中puc-18-u-f与puc-18-u-r用于扩增puc18质粒载体，cpendoiv-f、cpendoiv-r用于扩增衣原体内切核酸酶iv基因。4条引物碱基序列如下：
puc-18-u-f:5’catcaccaccattgagaagcttggcactggccgtc
puc-18-u-r:5’accaggccgctgctggaattcgtaatcatggtcatag
cpendoiv-f:5’cagcagcggcctggtcatatgaaagtacttcctcctccct
cpendoiv-r:5’tcaatggtggtgatgctaactatctctgttttttgaaaac
其中，小写字母代表核糖核苷酸修饰，大写字母代表脱氧核糖核苷酸，下划线碱基序列与扩增dna片断互补配对，5’端至最后一个核糖核苷酸的核苷酸为目标基因与线性化质粒载体互补配对区。引物可以自己利用dna合成仪合成或由各dna合成公司合成。
第二步，聚合酶链式反应（pcr）扩增衣原体内切核酸酶iv基因与线性化puc18质粒载体dna片段。pcr反应组成（50微升反应体积）：正向引物与反向引物，0.5μm；dna模板(100纳克衣原体基因组dna，或10纳克puc18质粒载体dna)；pfudna聚合酶，2.5个单位；dntps，200μm；1×pcr反应缓冲液。pcr反应条件：95℃×5分钟；（95℃×30秒，65℃×30秒，72℃×4分钟）×20个循环；72℃×10分钟。
第三步，dpni处理puc18质粒载体线性化pcr扩增产物。dpni特异性识别切割双链dna中a甲基化的gmatc序列，由于环状质粒模板具有多处gmatc序列，dpni处理把质粒模板变成很多段短的dna双链，这些短的dna双链转化大肠杆菌时不能够产生克隆，从而消除了野生型质粒模板产生的假阳性克隆。dpni处理按产品操作说明进行。
扩增的衣原体内切核酸酶iv基因碱基序列如下，其中省略号代表衣原体内切核酸酶iv基因中间的碱基序列，小写字母代表核糖核苷酸修饰：
5’cagcagcggcctggtcatatgaaagtacttcctcctccctc..............gtcgtcgccggaccagtatactttcatgaaggaggagggag............................gttttcaaaaaacagagatagttagcatcaccaccattga
..............caaaagttttttgtctctatcaatcgtagtggtggtaact5’
扩增的线性化puc18质粒载体碱基序列如下，其中省略号代表线性化puc18质粒载体中间的碱基序列，小写字母代表核糖核苷酸修饰：
5’catcaccaccattgagaagcttggcactggccgtcg...................
gtagtggtggtaactcttcgaaccgtgaccggcagc...................
.............ctatgaccatgattacgaattccagcagcggcctggt
.............gatactggtactaatgcttaaggtcgtcgccggacca5’
第四步，热碱处理衣原体内切核酸酶iv基因与puc18质粒载体的线性化pcr扩增片断。
将衣原体内切核酸酶iv基因与puc18质粒载体的线性化pcr扩增片断进行热碱处理，由于核糖核苷酸对热碱敏感，会在核糖核苷酸处断裂dna链，因此热碱处理可以产生长为15个核苷酸的3’突出端。热碱处理操作条件：向pcr产物中加入终浓度为100mm的naoh，95度处理5-10分钟；加入等量hcl中和加入的naoh。
热碱处理后的衣原体内切核酸酶iv基因碱基序列如下，其中省略号代表衣原体内切核酸酶iv基因中间的碱基序列：
5’catatgaaagtacttcctcctccctc..............
gtcgtcgccggaccagtatactttcatgaaggaggagggag............................gttttcaaaaaacagagatagttagcatcaccaccattga..............caaaagttttttgtctctatcaatc5’
热碱处理后的线性化puc18质粒载体碱基序列如下，其中省略号代表线性化puc18质粒载体中间的碱基序列：
5’gaagcttggcactggccgtcg...................
gtagtggtggtaactcttcgaaccgtgaccggcagc...................
.............ctatgaccatgattacgaattccagcagcggcctggt
.............gatactggtactaatgcttaag5’
第五步，热碱处理的衣原体内切核酸酶iv基因片段与puc18质粒载体线性化dna片断互补配对。将热碱处理的衣原体内切核酸酶iv基因片段与puc18质粒载体线性化dna片断等摩尔（各0.1个皮克摩尔）混合，室温或冰上放置15分钟，使二者3’突出端互补配对，形成插入了衣原体内切核酸酶iv基因的带缺口puc18重组质粒。
插入了衣原体内切核酸酶iv基因的带缺口puc18重组质粒碱基序列如下，其中省略号代表带缺口puc18重组质粒中间的碱基序列，符号_代表衣原体内切核酸酶iv基因与puc18质粒间的缺口：
..........ctatgaccatgattacgaattccagcagcggcctggt_catatgaaagtacttcctcctccctc
..........gatactggtactaatgcttaag_gtcgtcgccggaccagtatactttcatgaaggaggagggag
gttttcaaaaaacagagatagttagcatcaccaccattga_aagcttggcactggccgtcg..........
caaaagttttttgtctctatcaatc_gtagtggtggtaactttcgaaccgtgaccggcagc..........
第六步，含衣原体内切核酸酶iv基因的带缺口puc18重组质粒转化大肠杆菌。将第五步制备的插入了衣原体内切核酸酶iv基因的带缺口puc18重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞（氯化钙法制备的感受态细胞即可），转化后菌体涂布于含100微克/毫升氨苄青霉素的lb平板，于37度培养过夜。大肠杆菌的dna修复系统会修复好衣原体内切核酸酶iv基因与puc18质粒间的缺口，形成没有缺口的插入了衣原体内切核酸酶iv基因的完整puc18重组质粒。转化按标准操作进行。
第七步，含衣原体内切核酸酶iv基因的puc18重组质粒的鉴定。从第六步的平板上挑取单菌落，进行菌落pcr，鉴定含有衣原体内切核酸酶iv基因的单菌落，若能扩增出衣原体内切核酸酶iv基因的特异性dna条带，该菌落即为插入了衣原体内切核酸酶iv基因的puc18重组质粒的阳性克隆，培养阳性克隆并从中抽提重组质粒。菌落pcr组成（10微升反应体积）：衣原体内切核酸酶iv基因特异性引物，0.5μm；taqdna聚合酶，0.5单位；dntps，200μm；1×taq聚合酶反应缓冲液；单菌落菌体。反应条件：95℃×10分钟；（95℃×30秒，65℃×30秒，72℃×1分钟）×30个循环；72℃×5分钟。质粒抽提按标准操作进行。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。