专利名称：水产养殖用壳聚糖溶液剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及水产养殖领域，特别涉及一种水产养殖用壳聚糖溶液剂及其应用。
背景技术：
壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰化而得到的天然高分子材料，来源十分丰富，因为甲壳素是自然界中产量仅次于纤维素的天然产物且广泛存在于虾、蟹等甲壳动物外壳中。壳聚糖具有优良的生物相容性，可被溶菌酶溶解，可生物降解，其代谢产物无毒，以及抗菌、抗病毒特性，近年来在医药保健、食品保鲜、农业、化妆品、以及纺织品等领域得到广泛研究且具有良好的应用前景。通常的壳聚糖产品由于分子量高，其抗菌性能比较差，因此一般采用适当的方法将分子量降低以达到理想效果。低分子量壳聚糖还具有提高人体和动物免疫能力的功效。
在水产养殖领域，国内外的相关研究表明壳聚糖以及某些经过化学修饰的壳聚糖衍生物可以提高鱼的免疫能力，甚至部分治愈某些细菌性鱼病。在我国，甲壳素或壳聚糖作为一种极有潜力的饲料添加剂近年来被广泛研究并得到部分实际应用。刘兴国等采用单因子浓度梯度法研究壳聚糖对罗非鱼生长性能影响的试验中发现0.5％壳聚糖剂量组的饲料系数比对照组的饲料系数下降11.63％[刘兴国、宋理平.壳聚糖作为罗非鱼饲料添加剂的效果研究.渔业现代化，2004，(1)，40-41]。曹丹等也采用单因子浓度梯度法研究了壳聚糖对异育银鲫的生长、蛋白质合成及肌肉营养的影响，结果表明，1.0％壳聚糖组的相对增重率比对照组提高51.44％，饲料系数比对照组下降20.51％[曹丹，周洪琪.壳聚糖对异育银聊的生长、蛋白质台成及肌肉营养成分的影响。淡水渔业，2004，34(1)，6-9]。庄承纪等在研究壳聚糖对罗氏沼虾、斑节对虾苗生长和抗菌防病作用时发现浓度为100～200ppm壳聚糖对气单胞菌有明显抑制作用，100ppm壳聚糖也能明显抑制弧菌的繁殖[庄承继、刘劲科、杨清友等.壳多糖对罗氏沼虾、斑节对虾苗生长和抗菌防病作用研究。湛江海洋大学学报，1998，18(3)，29-34]。国内现采用粉末壳聚糖作为饲料添加剂。鱼类通过从饵料中摄取壳聚糖成份并吸收进入体内，固然能够起到一定的作用，达到部分预防鱼病的目的。
然而，在实际的水产养殖尤其是高密度养殖中，由于部分残留饲料以及水产动物的排泄物在水中分解会产生有毒物质，使水质透明度降低、水中有害病菌繁殖速度加快，不利于鱼、虾、蟹等水产动物的生长，并且容易爆发鱼病，因此在水产养殖中水质控制非常重要。为了控制鱼病的发生，通常使用抗生素药物抑制水体中病菌的繁殖。但是，抗生素药物的广泛使用容易使水产动物产生抗药性，而且体内残留的药物又会被人体吸收；甚至一些致癌药物如孔雀石绿作为水体消毒剂也被部分养殖户使用，严重威胁水产品的安全性。因此开发高效无毒的水产药物或水处理剂已经成为水产养殖研究领域的重要课题。目前市场上销售的较多的产品为双链季铵盐水溶液，虽然其杀菌效果比较好，但仍然不能生物降解，也不具有净化水质的功能。
发明内容
本发明的目的是解决上述现有技术中的问题，提供一种兼具有抗菌及絮凝效果、且稳定性好的水产养殖用壳聚糖溶液剂。
本发明的目的通过下列技术方案来实现一种水产养殖用壳聚糖溶液剂，其包括0.1～20％的活性成分壳聚糖，以及溶剂浓度为0.1～20％的酸溶液，该壳聚糖的分子量为2000～500000，脱乙酰度至少为70％；上述百分比均为占整个溶液剂的重量百分比。
常规壳聚糖的分子量很高，抗菌效果不明显。只有当分子量降低到一定程度时壳聚糖才具有理想的抗菌效果，但目前国际上对壳聚糖分子量大小对抗菌性能影响的报道有互相矛盾之处。降低壳聚糖分子量的方法可以采用化学降解(如H2O2)、射线辐照、酶分解等手段，目前市场上有此各种不同分子量的壳聚糖出售。本发明发现，对于水产养殖，选用壳聚糖的平均分子量范围在2千～50万之间才具有较佳的抗菌效果，如果平均分子量高于50万，抗菌效果比较差，而且只能在较低pH的水溶液中溶解；反之，如果平均分子量低于2000，虽然水溶性好，但可能反而容易促进细菌繁殖；更优选的分子量为5千～10万。本发明中的壳聚糖也可以由上述分子量范围内的两种或两种以上不同平均分子量的壳聚糖混合而成。另外，壳聚糖的脱乙酰度要求大于70％，如果脱乙酰度太低，水溶性差而且抗菌效果不理想。本发明壳聚糖溶液剂中壳聚糖的含量太低，如低于0.1％，则上述效果不明显；反之，大于20％，则不能溶解充分，或长时间放置稳定性差，可能会产生沉淀；本发明更优选的含量为3～10％。
众所周知，壳聚糖不溶于水，但可以溶解于较稀的酸性溶液，包括盐酸、硫酸、磷酸、醋酸、蚁酸、柠檬酸、丙酸、丁酸等无机酸和/或有机酸。由于残留的无机酸可能对水体或环境造成负面影响，因此本发明从环保角度来说，更优选有机酸；而酸的浓度太低，如低于0.1％，可能会影响壳聚糖的溶解，太高，如高于20％则大量游离酸和壳聚糖溶液一起喷洒于水面后可能引起水体的pH降低；该酸溶液的浓度更优选0.5～5％。
更佳地，本发明水产养殖用壳聚糖溶液剂还包括竹和/或木醋液。
所说的竹或木醋液是竹材或木材炭化时通过对挥发性的烟尘冷却所得到的液体再进一步经过提纯，去掉有焦油等成分之后得到的棕黄色液体。现市售产品中主要成分是水(占80％以上)，其次是醋酸、蚁酸(甲酸)，丁酸等酸类物质，占6％左右；此外还含有甲醇，丙醇，丙酮，多酚等200多种成分。其混合液pH值2.2-3.01，比重约1.02左右。竹/木醋液中的许多成分对细菌和霉菌具有杀菌作用，利用竹(木)醋液的杀菌功能以及纯天然、无毒、pH低等特点。在本发明中，发现竹(木)醋液为壳聚糖溶液的抗菌增强剂，将其与壳聚糖溶液共混，用于水产养殖，使其全部或至少部分替代鱼用抗生素药物。
其中，该竹和/或木醋液在溶液剂中的重量含量一般不超过50％；优选2～15％；更优选2～11％。
本发明壳聚糖溶液剂可以直接喷洒于水产养殖场的水面，能抑制水中有害病菌的繁殖，并具有絮凝和净化水产养殖用水环境的作用，提高了水的透明度，同时增强鱼、虾、蟹等水产动物的免疫力，预防或减少鱼病发生，促进其生长。因此，本发明的另一目的是提供上述水产养殖用壳聚糖溶液剂在制备水产药物或水产养殖用水处理剂中的应用。
由于壳聚糖不是合成的化学药物，不会使水产动物产生耐药性，而且壳聚糖没有生物毒性，配置成水溶液后使用方面，应用于水产养殖业可以提高水产品质量，达到绿色环保目的。另外，本发明壳聚糖溶液剂可以在常温下长期保存，即使长时间(6个月以上)放置也不产生沉淀，具有良好的物理化学稳定性；且安全性佳。
具体实施例方式
下面通过实施例来进一步说明本发明，而本发明并不受其限制。
实施例1将平均分子量为8万、脱乙酰度83％的壳聚糖5kg，醋酸2kg加入到90kg水中，搅拌溶解，待完全溶解后再加入3kg竹醋液，总共得到100kg含有壳聚糖和竹醋液的混合溶液。取该溶液按不同比例稀释后进行抗菌试验，实验对象为弧菌，培养条件为36℃，24小时，测得最低抑菌浓度(MIC)为300ppm(以壳聚糖计算)。
实施例2
将平均分子量为30万、脱乙酰度95％的壳聚糖5kg，醋酸5kg加入到85kg水中，搅拌溶解，待完全溶解后再加入5kg木醋液，总共得到100kg含有壳聚糖和木醋液的混合溶液。取该溶液按不同比例稀释后进行抗菌试验，实验对象为弧菌，培养条件为36℃，24小时。测得最低抑菌浓度(MIC)为250ppm(以壳聚糖计算)。
实施例3将分子量2-6万、脱乙酰度73％的壳聚糖5kg，醋酸2kg加入到93kg中溶解得到5wt％壳聚糖溶液。取该溶液100微克针对嗜水气单胞菌进行抑菌圈大小测定，测试条件为37℃，24小时，药敏纸片直径3.5cm。壳聚糖样品的平均抑菌圈直径为7.3mm，相同条件下抗生素药物的平均抑菌圈直径分别为氯霉素(30微克/片)，12.3mm；氟哌酸(10微克/片)，11.5mm；红霉素(15微克/片)，8.0mm。表明100微克5％的壳聚糖溶液对嗜水气单胞菌的抑菌能力与15微克/片的红霉素相当。
实施例4将分子量为40-50万、脱乙酰度92％的壳聚糖8kg，醋酸15kg加入到64kg水中，搅拌溶解，待完全溶解后再加入11kg木醋液，总共得到100kg含有壳聚糖和木醋液的混合溶液。取该溶液按不同比例稀释后进行抗菌试验，实验对象为大肠杆菌、弧菌、嗜水气单胞菌，培养条件为36℃，24小时，测得最低抑菌浓度(MIC)为分别为500ppm，350ppm和200ppm(以壳聚糖计算)。
实施例5将平均分子量分别为5000(脱乙酰度为70％)和10万(脱乙酰度为87％)的壳聚糖各5kg，醋酸5kg、柠檬酸2kg加入到83kg水中，搅拌溶解，总共得到100kg含有壳聚糖的溶液。取该溶液按不同比例稀释后进行抗菌试验，实验对象为大肠杆菌、弧菌、嗜水气单胞菌，培养条件为36℃，24小时，测得最低抑菌浓度(MIC)为分别为600ppm，400ppm和300ppm(以壳聚糖计算)。
实施例6将平均分子量4万、脱乙酰度80％的壳聚糖3kg、醋酸1kg、竹醋液2kg与水94kg配成本发明壳聚糖水溶液剂。
实施例7将平均分子量为10万、脱乙酰度80％的壳聚糖5kg、醋酸3kg、木醋液2kg加入到90kg水中，搅拌溶解，总共得到100kg含有壳聚糖的水溶液剂。
实施例8将平均分子量为8万、脱乙酰度83％的壳聚糖0.1kg、竹醋液50kg加入到49.9kg盐酸溶液中，搅拌溶解，使最终溶液中盐酸浓度为0.1wt％，总共得到100kg含有壳聚糖的水溶液剂。
实施例9将平均分子量为2000、脱乙酰度70％的壳聚糖20kg、蚁酸20kg加入到60kg水中，搅拌溶解，总共得到100kg含有壳聚糖的水溶液剂。
上述实施例中各种平均分子量和脱乙酰度的壳聚糖、竹醋液和木醋液、以及各种酸均为常规市售产品。
应用实施例1使用实施例3的壳聚糖溶液进行了临床急性毒性试验。采用半静态的鱼类急性毒性试验方法，pH值7.3-7.5，水温20℃。对平均体长15.0cm，平均体重48.3克的草鱼的96小时半数致死浓度——大于22000mg/kg体重(口服)；对平均体长4.8cm的南美白对虾48小时半数致死浓度——大于18000mg/kg(浸泡)。参照我国农药急性毒性的分级标准以及七级毒性分级标准证明样品实际无毒。
应用实施例2选择3口混合养殖的池塘(水面积4-6亩)进行试验。每隔10天分别向其中的两个塘口泼洒0.3ppm和2.0ppm(按照水面估算塘口中水的重量)实施例6的壳聚糖溶液，另一个塘口作为对照。60天后分别从3个塘口捕捞体长25-30cm的草鱼进行血细胞测试。
从鱼尾静脉取血，肝素抗凝。然后沿试管壁缓慢加到已加入5ml淋巴细胞分离液试管中，离心10min(2000转/min)，用吸管插到中间层即淋巴细胞悬液层吸出淋巴细胞悬液，离心10min(1500转/min)后弃上层清液，用含10％FBS1640培养液调细胞浓度为1×106/L。然后用3H-Tdr、14C-Ur、3H-缬氨酸掺入法测定本发明壳聚糖溶液剂对鱼血细中DNA、RNA、蛋白质增值功能的影响。鱼细胞悬液分装12瓶，每瓶2ml，分为对照组A和壳聚糖泼洒组B1(0.3ppm)、B2(2.0ppm)。测定结果(表1，表2)表明池塘养殖的泼洒壳聚糖组的鱼血细胞PHA和LPS刺激的DNA、RNA、蛋白质增值明显增强(P＜0.05和P＜0.01)。
表1.壳聚糖对鱼血细胞DNA和RNA增值功能的影响
n＝6*P＜0.05(vs A) ▲＜0.05(vs A，B1，)表2.壳聚糖对鱼血细胞蛋白质增值功能的影响
n＝6*P＜0.05(vs A)▲＜0.05(vs A，B1，)
应用实施例3选用实施例7，使用SC656型六联混凝实验仪在500mL烧杯中进行该壳聚糖溶液的絮凝性能试验。在不断搅拌的高岭土悬浊液中，加入同份量的壳聚糖溶液，先快速搅拌(200～240r/min)1min，再慢速搅拌(70～90r/min)5min，然后静置20min，取上层清液测定浊度，并计算浊度除去率。测得壳聚糖浓度为1.0ppm，0.5ppm和0.1ppm时对应的浊度除去率分别为60％，50％和45％。
应用实施例4选择河沟改建而成、面积为10亩的养殖试验池，水深1.2-1.5m，淤泥深80cm，在池中高密度放养扣蟹，并套放V期幼蟹、以及鲢鳙、草鳊和虾。5月上旬前保持浅水位，每7-10天加注一次新水，保持透明度在30cm左右，7月至8月保持最高水位并定期换水，保持透明度在30-40cm，9月份后逐步加大换水量及换水频率；每15-20天施用一次生石灰；6月上旬全池泼洒一次实施例7的壳聚糖溶液，用量为0.3ppm(以壳聚糖重量计)，以后每隔15-20天泼洒一次，用量为0.1ppm，9月底停止泼洒壳聚糖溶液，在6-9月间停止使用消毒剂。与对照组比较，河蟹颤抖病发病连续时间缩短3-5天，且发病期间河蟹日死量减少50％以上，混养的鲢鳙等鱼类也未曾发生暴发性出血病及其它病害。与往年比较，定期泼洒壳聚糖溶液后，水质有了明显改善，换水次数减少4次以上，换水量大为30％以上。
权利要求
1.一种水产养殖用壳聚糖溶液剂，其包括0.1～20％的活性成分壳聚糖，以及溶剂浓度为0.1～20％的酸溶液，该壳聚糖的分子量为2000～500000，脱乙酰度至少为70％；上述百分比均为重量百分比。
2.如权利要求1所述的壳聚糖溶液剂，其特征在于所述酸溶液为无机酸和/或有机酸。
3.如权利要求2所述的壳聚糖溶液剂，其特征在于该无机酸选自盐酸、磷酸和硫酸。
4.如权利要求2所述的壳聚糖溶液剂，其特征在于该有机酸选自蚁酸、醋酸和柠檬酸。
5.如权利要求1所述的壳聚糖溶液剂，其特征在于其包括3～10％的壳聚糖，该壳聚糖的分子量为5000～100000。
6.如权利要求1所述的壳聚糖溶液剂，其特征在于所述酸溶液的浓度为0.5～5％。
7.如权利要求1～6任一项所述的壳聚糖溶液剂，其特征在于其还包括竹和/或木醋液。
8.如权利要求7所述的壳聚糖溶液剂，其特征在于该竹和/或木醋液在溶液剂中的重量含量不超过50％。
9.如权利要求8所述的壳聚糖溶液剂，其特征在于该竹和/或木醋液在溶液剂中的重量含量为2～11％。
10.如权利要求1～6任一项所述的壳聚糖溶液剂在制备水产药物或水产养殖用水处理剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种水产养殖用壳聚糖溶液剂，其包括0.1～20％的活性成分壳聚糖，以及溶剂浓度为0.1～20％的酸溶液，该壳聚糖的分子量为2000～500000，脱乙酰度至少为70％。本发明壳聚糖溶液剂具有抗菌和促进水产动物生长的作用，可替代抗生素药物而避免产生抗药性，且还具有絮凝和净化水产养殖用水环境的作用；另外，本发明壳聚糖溶液剂稳定性佳、安全性好且使用方便。
文档编号C02F1/50GK1986438SQ20051011175
公开日2007年6月27日 申请日期2005年12月21日 优先权日2005年12月21日
发明者吴国忠, 龙德武 申请人:中国科学院上海应用物理研究所