专利名称：草甘膦在水产养殖中的应用的制作方法
草甘膦在水产养殖中的应用发明背景发明领域本发明涉及分子生物学，更具体而言，涉及草甘膦在水产养殖中的应用。
背景技术：
草甘膦通常被认为是叶面施用的传导型除草剂，用来控制大多数海岸线植物生长和若干挺水杂草如睡莲(欧亚萍蓬草(Nupharluteum))和鳄鱼草(空心莲子草 (Alternanthera philoxeroides))。草甘膦从被处理的叶面转移到地下贮藏器官如根茎。 其通常在杂草开花或结果阶段施用时最有效。如果在施用的6小时内下雨，草甘膦的有效性会降低。因此，预计草甘膦在施用于水生环境时不具有效性。此外，权威机构如俄克拉荷马州合作推广服务(水生杂草管理，除草剂，SRAC-361,在httD //osufacts. okstate. edu 可找到)引用了浮游生物丝状轮藻(Chara)/丽藻(Nitella)对草甘膦的较差反应，提倡采用铜和铜复合物代替草甘膦控制藻类生长。因此，根据现有技术的说明，本文所述的包括草甘膦在水产养殖中应用的示例性实施方式具有新颖性和创造性。
发明内容
本发明提供控制在水生环境中生长的一定密度的藻类的方法。示例性方法包括对在水生环境中生长的一定密度的藻类施用有效量的草甘膦。所述藻类可包括微绿球藻属 (Nannochloropsis)和/或杜氏藻属(Dunaliella)。所述藻类还可包括微绿球藻属的草甘膦抗性株系。所述有效量可在水生环境中达到约为0. 1毫摩尔到0. 3毫摩尔的草甘膦浓度。 此外，所述水生环境可包括海水。可在将藻类接种到水生环境之前和/或之后向所述水生环境施用草甘膦。示例性产品可包括在包含有效量草甘膦的水生环境中培养的藻类微绿球藻属产生的生物质。替代性方法包括对在水生环境中生长的一定密度的藻类施用有效量的草丁膦。附图简要说明
图1显示就具体示例性微绿球藻培养物在施用草甘膦之前和之后的草甘膦浓度 (X轴)相对光密度测定值(Y轴)的图；图2显示就具体示例性杜氏藻培养物在施用草甘膦之前和之后的草甘膦浓度(X 轴)相对光密度测定值(Y轴)的图；图3显示就具体示例性微绿球藻培养物的氯化铵浓度(X轴)相对光密度测定值 (Y轴)的图；图4显示就具体示例性杜氏藻培养物的氯化铵浓度(X轴)相对光密度测定值(Y 轴)的图；图5显示就具体示例性杜氏藻培养物的氢氧化铵浓度(X轴)相对光密度测定值 (Y轴)的3
图6显示就具体示例性微绿球藻培养物的氢氧化铵浓度(X轴)相对光密度测定值(Y轴)的图；图7显示就具体示例性微绿球藻培养物在施用草丁膦之前和之后的草丁膦浓度 (X轴)相对光密度测定值(Y轴)的图；和图8显示控制水生环境中藻类密度的示例性方法的流程图。发明详述本发明提供控制在水生环境中生长的一定密度的藻类的方法。这样的方法可包括对所述密度的藻类施用有效量的草甘膦。所述藻类可包括微绿球藻属和/或杜氏藻属。所述藻类还可包括微绿球藻属的草甘膦抗性株系。所述有效量可在水生环境中达到约为0. 1 毫摩尔到0. 3毫摩尔的草甘膦浓度。可产生的示例性产物包括从在具有有效量草甘膦的水生环境中培养的微绿球藻产生的生物质。
图1显示就具体示例性微绿球藻培养物在施用草甘膦之前和之后的草甘膦浓度 (X轴)相对光密度测定值(Y轴)的图。如
图1所示，所述X轴显示水生环境中草甘膦的近似毫摩尔浓度。所述Y轴显示在水生环境中生长的藻类的近似平均光密度，所述光密度同时在680和750纳米波长测定。根据一种示例性方法，将三十(30)微升微绿球藻培养物引入海水配制的七(7)毫升F2培养基。将所述混合物在6孔板之间平均分配。加入各种浓度的草甘膦。用相同的微绿球藻培养物接种另一多孔板，但不用草甘膦处理该多孔板。约6天后，对各种草甘膦浓度各一式三份地同时在680和750纳米测定光密度。如
图1所示，草甘膦控制(抑制)微绿球藻的生长。在
图1所示示例性图的一点上，约0. 8毫摩尔草甘膦抑制约百分之五十(50% ) 的微绿球藻生长。图2显示就具体示例性杜氏藻培养物在施用草甘膦之前和之后的草甘膦浓度(X 轴)相对光密度测定值(Y轴)的图。如图2所示，所述X轴显示水生环境中草甘膦的近似毫摩尔浓度。所述Y轴显示在水生环境中生长的藻类的近似平均光密度，所述光密度同时在680和750纳米波长测定。根据一种示例性方法，将三十(30)微升杜氏藻培养物接种到海水配制的七(7)毫升F2培养基中。将所述混合物在6孔板之间平均分配。加入各种浓度的草甘膦。用相同的杜氏藻培养物接种另一多孔板，但不用草甘膦处理该多孔板。约6天后，对各种草甘膦浓度各一式三份地同时在680和750纳米测定光密度。如图2所示，草甘膦抑制杜氏藻的生长。浓度约为1.2毫摩尔的草甘膦抑制约百分之五十(50%)的杜氏藻生长。图3显示就具体示例性微绿球藻培养物的氯化铵浓度(X轴)相对光密度测定值 (Y轴)的图。如图3所示，所述X轴显示水生环境中氯化铵的近似毫摩尔浓度。所述Y轴显示在水生环境中生长的微绿球藻的近似平均光密度，所述光密度同时在680和750纳米波长测定。根据一种示例性方法，将三十(30)微升微绿球藻培养物接种到海水配制的七(7) 毫升F2培养基。将所述混合物在6孔板之间平均分配。加入各种浓度的氯化铵。用相同的微绿球藻培养物接种另一多孔板，但不用氯化铵处理该多孔板。约6天后，对各种氯化铵浓度各一式三份地同时在680和750纳米测定光密度。如图3所示，氯化铵不抑制微绿球藻的生长。因为可用氯化铵配制草甘膦，图3所示结果表明，升高的铵水平对微绿球藻的生长具有很小的有害作用或无有害作用。这些结果强有力地表明，草甘膦是本文所述和所示负责控制藻类培养物的活性成分。图4显示就具体示例性杜氏藻培养物的氯化铵浓度(X轴)相对光密度测定值(Y 轴)的图。如图4所示，所述X轴显示水生环境中氯化铵的近似毫摩尔浓度。所述Y轴显示在水生环境中生长的杜氏藻的近似平均光密度，所述光密度同时在680和750纳米波长测定。根据一种示例性方法，将三十(30)微升杜氏藻培养物接种到海水配制的七(7)毫升F2培养基。将所述混合物在6孔板之间平均分配。加入各种浓度的氯化铵。用相同的杜氏藻培养物接种另一多孔板，但不用氯化铵处理该多孔板。约6天后，对各种氯化铵浓度各一式三份地同时在680和750纳米测定光密度。如图4所示，氯化铵不抑制杜氏藻的生长。图4所示结果表明，升高的铵水平对杜氏藻的生长具有很小的有害作用或无有害作用。 这些结果强有力地表明，草甘膦是本文所述和所示负责控制藻类培养物的活性成分。图5显示就具体示例性杜氏藻培养物的氢氧化铵浓度(X轴)相对光密度测定值 (Y轴)的图。如图5所示，所述X轴显示水生环境中氢氧化铵的近似毫摩尔浓度。所述Y 轴显示在水生环境中生长的杜氏藻的近似平均光密度，所述光密度同时在680和750纳米波长测定。根据一种示例性方法，将三十(30)微升杜氏藻培养物接种到海水配制的七(7)毫升F2培养基。将所述混合物在6孔板之间平均分配。加入各种浓度的氢氧化铵。用相同的杜氏藻培养物接种另一多孔板，但不用氢氧化铵处理。约6天后，对各种氢氧化铵浓度各一式三份地同时在680和750纳米测定光密度。如图5所示，氢氧化铵不抑制杜氏藻的生长。因为可用氢氧化铵配制草甘膦，图5所示结果表明，升高的铵水平对杜氏藻的生长具有很小的有害作用或无有害作用。这些结果强有力地表明，草甘膦是本文所述和所示负责控制藻类培养物的活性成分。图6显示就具体示例性微绿球藻培养物的氢氧化铵浓度(X轴)相对光密度测定值(Y轴)的图。如图6所示，所述X轴显示水生环境中氢氧化铵的近似毫摩尔浓度。所述 Y轴显示在水生环境中生长的微绿球藻的近似平均光密度，所述光密度同时在680和750纳米波长测定。根据一种示例性方法，将三十(30)微升微绿球藻培养物接种到海水配制的七(7) 毫升F2培养基中。将所述混合物在6孔板之间平均分配。加入各种浓度的氢氧化铵。用相同的微绿球藻培养物接种另一多孔板，但不用氢氧化铵处理。约6天后，对各种氢氧化铵浓度各一式三份地同时在680和750纳米测定光密度。如图6所示，氢氧化铵不抑制微绿球藻的生长。因为可用氢氧化铵配制草甘膦，图6所示结果表明，升高的铵水平对微绿球藻的生长具有很小的有害作用或无有害作用。这些结果强有力地表明，草甘膦是本文所述和所示负责控制藻类培养物的活性成分。图7显示就具体示例性微绿球藻培养物在施用草丁膦之前和之后的草丁膦浓度 (X轴)相对光密度测定值(Y轴)的图。如图7所示，所述X轴显示水生环境中草丁膦的近似微摩浓度。所述Y轴显示在水生环境中生长的藻类的近似平均光密度，所述光密度同时在680和750纳米波长测定。根据一种示例性方法，将三十(30)微升微绿球藻培养物引入海水配制的七(7)毫
5升F2培养基中。将所述混合物在6孔板之间平均分配。加入各种浓度的草丁膦。用相同的微绿球藻培养物接种另一多孔板，但不用草丁膦处理这些孔板。约6天后，对各种草丁膦浓度各一式三份地同时在680和750纳米测定光密度。如图7所示，草丁膦控制(抑制)微绿球藻的生长。在图7所示示例性图的一点上，约25微摩草丁膦抑制约百分之五十(50%) 的微绿球藻生长。图8显示控制水生环境中藻类密度的示例性方法的流程图。在任选步骤805，在将生长的藻类培养物接种到水生环境之前向所述水生环境施用有效量的草甘膦。这样的步骤可视作预防性措施。根据一个示例性实施方式，施用有效量的草甘膦在水生环境中达到约0. 1毫摩尔到0. 3毫摩尔的草甘膦浓度。该步骤可在本文所述的步骤830以外进行或代替步骤830。根据一个替代性实施方式，在将生长的藻类培养物接种到水生环境之前向所述水生环境施用有效量的草丁膦。在步骤810，可将藻类培养物接种到水生环境。根据各个示例性实施方式，水生环境可以是开放池塘、封闭池塘和/或生物反应器。此外，藻类培养物可包含微绿球藻属和杜氏藻属的一种或多种株系和/或其草甘膦抗性株系。例如，水生环境可包含对草甘膦抑制作用具有抗性的一种或多种藻类株系，使加入草甘膦可协助保持单一藻类培养物。例如，具有草甘膦抗性的藻类株系可在特定浓度草甘膦的存在下存活，而缺乏草甘膦抗性的同一株系可能无法在相同浓度的草甘膦下存活。在一种这样的情况中，可通过用编码对草甘膦不敏感的蛋白质的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸(ESPS)合酶(5-end0pyruVylShikimate-3 phosphate (ESPS) synthase)基因转化藻类来产生草甘膦抗性株系。或者，可通过诱变藻类细胞之后用草甘膦进行选择来产生草甘膦抗性株系。根据各实施方式，可以加入初始小量的纯(基本不含不希望存在的污染生物)藻类培养物开始户外藻类培养。可在受控的环境，如实验室或封闭系统中产生这样的接种物。 可将所述接种物引入较大体积的可具有预定盐度的水中，所选盐度对所需藻类株系生长具有最佳效果并/或可能对竞争株系不具有最佳效果。一旦藻类培养物接种并生长到所需密度，根据一些实施方式，可将其移出(可用新的接种物开始新的培养)，或可根据指定的方案或比率将其稀释。在所述第一种情况中， 可以分批模式进行培养，可能需要进行频繁的再接种。在所述后一种情况中，可根据实际进行稀释的方式以连续或半连续方式进行培养。例如，假设所需稀释率为每天50 %，培养物稀释可通过若干技术中的一种或多种进行。培养物稀释可以恒定或可变的比率在全天(或全天的一部分)中连续进行。或者培养物稀释可以每天一次(即每天在短时间内移出50%的培养物，并用新的生长培养基代替)的半连续、每天两次(即每次移出25%的培养物，每天在不同的时间进行两次)的半连续或全天中任何其它所需频率的半连续方式进行。在一些实施方式中，培养物稀释可包括从生长系统中移出藻类培养培养基(无论是在开放池塘还是封闭的光生物反应器中)，并用新鲜培养基代替这部分，所述新鲜培养基可包含供藻类在两次连续稀释之间生长的足量的所有营养物质。如本文所述可单独加入所述营养物质。同样地，通过改变新鲜培养基的盐度，可将微藻培养物的盐度保持在指定范围内，其可对特定藻类株系具有最佳效果，并/或对竞争株系不具有最佳效果。根据一个替代性实施方式，藻类培养物可包含微绿球藻属和杜氏藻属的一种或多种株系和/或其草丁膦抗性株系。例如，水生环境可包含对草丁膦抑制作用具有抗性的一种或多种藻类株系，使加入草丁膦可协助保持单一藻类培养物。具有草丁膦抗性的藻类株系可在特定浓度草丁膦的存在下存活，而缺乏草丁膦抗性的同一株系可能无法在相同浓度的草丁膦下存活。可通过诱变藻类细胞之后用草丁膦进行选择来产生草丁膦抗性株系。在步骤820，使藻类培养物在水生环境中生长。根据各实施方式，藻类可以是生长可能需要光(天然或人工供给)以及营养物质的光合作用微生物。其它参数如温度、PH和盐度应在可接受的范围内。藻类生长通常需要的基本元素可包括碳、氮、磷、铁、硫和/或微量的若干其它元素，如镁、钾等。藻类可通过有丝分裂进行无性繁殖，或可通过形成配子进行有性繁殖。无性繁殖的世代时间可在几小时到几天之间变化。所需营养物质可包含于水中、随后在稀释水中提供或独立于稀释水提供，其浓度足以允许藻类生长并达到所需的最终密度。产生指定藻类密度所需的营养物质的量可由该营养物质的细胞限额确定。即通过由包含于营养物质中的所述元素组成的藻类干重的百分比确定。所述细胞限额的倒数称为该营养物质或元素的藻类生长势。例如，如果所需最终密度为1克/升，考虑的藻类株系在其生物质中包含10%氮(即细胞限额为0. 1)，则培养物中的氮原子初始浓度应至少为0. 1克/升。可对所有营养物质进行相同的计算以确定其在培养物中的初始浓度。可对用于藻类户外大量培养的任何系统进行优化以供藻类生长。环境光和温度可能无法控制。然而，培养系统内的光和温度可取决于实际采用的系统。例如，可通过改变混合强度和设备的光学深度调整藻类培养物可接触的时间平均光强度。在板形模块化光生物反应器中，后者可通过控制两个连续板之间的距离来进行。另一方面，开放池塘中的光学深度可计为池塘深度。类似地，封闭光生物反应器中的温度可通过间接热交换手段精确控制， 而在开放池塘中，温度控制可能有限，可通过调整培养物深度进行控制。根据各实施方式，初始培养基中的盐度可在1-60千分份数(ppt)之间变化。然而， 为保持微绿球藻在培养物中占优势，可选择15-35ppt的盐度。这可通过例如将2/3的盐度为35ppt的海水与1/3的淡水混合以获得23-24ppt的盐度来达到。可采用其它比率的海水和淡水以达到生长培养物中的所需盐度水平。可通过其它手段，如向淡水中加入所需量的盐来获得具有所需盐度的生长培养基。在2-10天后，根据光强度(如果采用开放池塘则绝缘)、温度和起始接种物大小， 微绿球藻培养物可达到生产操作密度。如果采用半连续或连续培养，可以20% -70%的日稀释率有规律地稀释微绿球藻培养物。因此，占整个体积20% -70%的培养物部分可被新水代替，所述新水可具有与用于接种的初始培养基相同的营养物质浓度，或营养物质可单独加入。新培养基的盐度可通过控制海水和淡水的比率(或通过向淡水加入所需量的盐或通过其它类似方法)来调整，以在稀释之后将培养物的盐度保持在15-35ppt范围内。例如，如果稀释之前的培养物盐度由于蒸发而增大到30ppt，所需稀释率为50%，则新培养基可能需要具有约20ppt的盐度以在稀释之后达到25ppt的盐度。这可通过人工或自动控制系统完成。在步骤830，对在水生环境中生长的藻类培养物施用有效量的草甘膦。根据一个示例性实施方式，施用有效量的草甘膦在水生环境中达到约0. 1毫摩尔到0. 3毫摩尔的草甘膦浓度。根据一些实施方式，如果在高于25ppt的盐度下培养微绿球藻，所述户外培养物很
7可能被最终竞争胜出微绿球藻的其它微生物侵入。然而，可通过施用有效量的草甘膦保持微绿球藻的优势地位。在较低的藻类浓度下，需要的草甘膦较少，在较高的藻类浓度下，需要的草甘膦可能较多。根据一个替代性实施方式，对在水生环境中生长的藻类培养物施用有效量的草丁膦。尽管本文描述了各个实施方式，但应理解，它们仅通过示例方式给出，并不构成限制。因此，优选实施方式的宽度和范围不应受任何所述示例性实施方式的限制。
权利要求
1.一种控制在水生环境中生长的一定密度的藻类的方法，所述方法包括对在水生环境中生长的所述密度的藻类施用有效量的草甘膦。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述藻类包括微绿球藻属。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述藻类包括杜氏藻属。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述藻类包括微绿球藻属的草甘膦抗性株系。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，施用所述有效量在水生环境中达到约0.1毫摩尔到0. 3毫摩尔的草甘膦浓度。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，施用所述有效量之前所述密度的藻类在约 750纳米波长测定的近似归一化光密度为1. 0。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水生环境包括海水。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水生环境包括淡水。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水生环境包括海水和淡水的混合物。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水生环境中草甘膦的有效量为约0.8 毫摩尔。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述有效量的草甘膦抑制约百分之五十的微绿球藻生长。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水生环境中草甘膦的有效量为约1.2毫摩尔。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述有效量的草甘膦抑制约百分之五十的杜氏藻生长。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水生环境在生物反应器中。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水生环境在开放池塘中。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水生环境在开放容器中。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水生环境在封闭容器中。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使所述密度的藻类恢复到在进行权利要求1所述方法之前观察到的光密度。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括通过将对草甘膦不敏感的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸(ESPQ合酶基因引入野生型微绿球藻来产生微绿球藻的草甘膦抗性株系。
20.一种产品，其包含在包含有效量草甘膦的水生环境中培养的藻类微绿球藻属产生的生物质。
21.—种控制在水生环境中生长的一定密度的藻类的方法，所述方法包括对在水生环境中生长的所述密度的藻类施用有效量的草丁膦。
全文摘要
本发明提供控制在水生环境中生长的一定密度的藻类的方法。示例性方法包括对在水生环境中生长的一定密度的藻类施用有效量的草甘膦。所述藻类可包括微绿球藻属(Nannochloropsis)和/或杜氏藻属(Dunaliella)。所述藻类还可包括微绿球藻属的草甘膦抗性株系。所述有效量可在水生环境中达到约为0.1毫摩尔到0.3毫摩尔的草甘膦浓度。此外，所述水生环境可包括海水。可在将藻类接种到水生环境之前和/或之后向所述水生环境施用草甘膦。替代性方法包括对在水生环境中生长的一定密度的藻类施用有效量的草丁膦。
文档编号A01N57/00GK102164492SQ200980138072
公开日2011年8月24日 申请日期2009年7月24日 优先权日2008年7月24日
发明者B·维克 申请人:奥罗拉藻类股份有限公司