M, dNTP 0.02mM, Taq DNA 聚合酶 0.5U。反应条件为:95°C，5min ；94°C，30s ；55 °C ,30s ；72°C，lmin, 30cycles ;最后72 °C，lOmin。反应完成后，琼脂糖凝胶电泳检测、分离PCR产物，割胶回收目的片段进行测序分析。将序列正NCBI上进行同源序列对比搜索(Nucleitide-Nucleitide Blast)，结果表明，该菌株16S rDNA与类芽孢杆菌Paenibacillus sp.的16S rDNA最为相似，具有99%的序列同源性。因此鉴定筛选得到的具有高纤维素酶活性的菌株WHl为类芽孢杆菌Paenibacillus。
[0026]将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏登记入册的编号为CCTCC NO:M 2014236，保藏日期为2014年5月29日。
[0027]对比例1:
[0028]取100 μ I的菌株WHl菌液加入到含有5ml的Dubois salt液体培养基(K2PO4 Ig/L，KC1 0.5g/L, MgSO4 0.5g/L，NaNO3 0.5g/L，FeSO4 0.0lg/L，pH 7.4)的试管中，在试管中加入一条7mm宽的Whatman —号滤纸为底物。设置含有相同菌液浓度的纤维素酶生产用纤维单胞菌(Cellulomonas xylanilytica)为阳性对照，相同菌液浓度的E.coli为阴性对照。28°C振荡培养5天后，取出静置10分钟后进行对比，加入菌株WHl的试管中滤纸被充分降解，培养液上清澄清。阳性对照上清浑浊，阴性对照滤纸完整。结果显示菌株WHl具有最尚的滤纸酶活性。
[0029]本发明所述的具有高纤维素酶活性的类芽孢杆菌菌株WHl与纤维素酶生产用纤维单胞菌(Cellulomonas xylanilytica)相比，降解纤维素酶的酶活显著提高，提高了49%。
[0030]对比例2:
[0031]将菌株WHl在含有I % CMC对Dubois salt液体培养基培养48小时后用于测定滤纸酶活性和CMC酶活性。
[0032]WHl 生长用的培养基是 Dubois salts media (K2PO4 lg/L, KCl 0.5g/L, MgSO4
0.5g/L, NaNO3 0.5g/L, FeSO4 0.0lg/L, pH 7.4)加 FP (I %，w/v) or CMC (I %，w/v).
[0033]滤纸酶活性定义为:在50°C，相应pH条件下，Imin水解滤纸纤维素底物产生出相当于I μπιο?葡萄糖的还原糖量为一个酶活力单位。滤纸酶活测定时选用的滤纸为Whatman一号滤纸，还原糖的检测使用DNS法。测定结果显示，在pH7.0的情况下菌株WHl培养液上清酶活为13.2±1.8U，细胞裂解液的酶活为13.8±0.5U。细胞裂解液的酶活比培养液上清酶活高4.5%。
[0034]CMC活性定义为，pH为7.0，反应温度50°C，以Imin水解CMC-Na底物产生I μ mo I的葡萄糖残基为I个酶活单位。结果显示，菌株WHl培养液上清CMC活性为25.7 ±4.2U，细胞裂解液的酶活为88.2± 10.8U。细胞裂解液的酶活是培养液上清酶活的3.43培。
[0035]本发明还提供一种所述具有高纤维素酶活性的类芽孢杆菌菌株WHl在制备纤维素降解制剂中的应用，该纤维素降解制剂可显著提高生物质材料转化效率，降低纤维素转化成本。
[0036]由此可见，本发明提供的具有高纤维素酶活性的类芽孢杆菌菌株WHl，从纸浆污泥中分离得到，具有更高的纤维素酶活性，能够广泛应用于食品工业、酿造业、造纸业、饲料工业、纺织工业和生物质转化，提高生物质材料转化效率，降低纤维素转化成本。
[0037]所属领域的普通技术人员应当理解:以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种具有高纤维素酶活性的菌株，其特征在于，所述菌株命名为类芽孢杆菌Paenibacillus sp.WH1，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏登记入册的编号为CCTCC N0:M2014236，保藏日期为2014年5月29日。
2.根据权利要求1所述的具有高纤维素酶活性的菌株，其特征在于，所述菌株从纸浆污泥中分离得到。
3.一种获得权利要求1所述的具有高纤维素酶活性的菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤: 将纸浆污泥溶解在磷酸缓冲液中，取上清液； 将所述上清液稀释后涂布接种于琼脂平板生长培养基R2A，选择直径中等，形态边缘整齐、中间凹陷，颜色呈灰白色的菌落； 将获得的菌落在LB培养基中培养，取培养后的菌液滴于羧甲基纤维素钠平板培养基中，以大肠杆菌为阴性对照，纤维素酶生产用纤维单胞菌为阳性对照，筛选获得比阳性对照具有更高纤维素酶活性的菌株，即为类芽孢杆菌Paenibacillus sp.WHl。
4.根据权利要求3所述的具有高纤维素酶活性的菌株的获得方法，其特征在于，所述琼脂平板生长培养基R2A含有:0.4-0.6g/L酵母提取物，0.4-0.6g/L蛋白胨，0.4-0.6g/L酪蛋白，0.4-0.6g/L葡萄糖，0.4-0.6g/L可溶性淀粉，0.2-0.4g/L磷酸氢二钾，0.4-0.6g/L七水硫酸镁，0.2-0.4g/L丙酮酸钠，10.0-20.0g/L琼脂糖。
5.根据权利要求1所述的具有高纤维素酶活性的菌株在制备纤维素降解制剂中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种具有高纤维素酶活性的菌株及其应用和和获得方法，所述菌株命名为类芽孢杆菌Paenibacillus sp.WH1，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏登记入册的编号为CCTCC NO:M 2014236，保藏日期为2014年5月29日。本发明提供的具有高纤维素酶活性的类芽孢杆菌菌株WH1，从纸浆污泥中分离得到，具有更高的纤维素酶活性，能够广泛应用于食品工业、酿造业、造纸业、饲料工业、纺织工业和生物质转化，提高生物质材料转化效率，降低纤维素转化成本。CCTCC NO: M201423620140529
【IPC分类】C12N1-20, C12R1-01
【公开号】CN104726385
【申请号】CN201510193369
【发明人】唐建
【申请人】湖南龙腾生物科技有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年4月22日