一株抑制马铃薯立枯丝核病菌的枯草芽孢杆菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株枯草芽孢杆菌。
【背景技术】
[0002] 丝核菌是一类在自然界中广泛存在的真菌，在全世界的耕作、非耕作土壤中均有 分布，许多丝核菌很容易从染病植株及土壤中分离得到。丝核菌的寄主范围极广，可侵染43 科200余种植物。丝核菌是一种土传植物病原真菌，容易引起植物烂种、苗期猝倒。丝核菌 在土壤中的腐生竞争力强，存活时间长，被认为是最具破坏力的土传植物病原菌之一。丝核 菌在菌丝分枝发生点附近缢缩，分枝点附近形成隔膜，菌丝经常呈直角或锐角分枝。生物 防治主要是利用微生物之间的拮抗作用，选择对农作物不造成危害的微生物抑制病原菌的 生长。细菌、放线菌、真菌在植物病害生物防治中开发应用前景良好，生防菌剂的研宄及开 发有着重要的现实意义。微生物源农药是目前应用最广、发展最快、最有前途的一类生物农 药，是解决我国当前农业环境问题的主要突破口之一。
[0003] 黑龙江省是马铃薯种植之乡，近年来马铃薯种植面积不断扩大，马铃薯产业发展 迅猛。但是由于种薯生产者提供无病种薯的观念不强，用种者常将非种薯做种薯应用，品种 引进和调运过程中忽视检疫把关；甚至有的种植区域种薯生产地区，不注意轮作倒茬；还 有的在种植过程中对病害的防治措施落实的不认真，种种原因致使马铃薯病害日趋严重。 马铃薯立枯丝核病就是其中之一，该病发病普遍，发病率达5%以上，危害程度也在日趋加 重，不仅使产量降低20%，而且严重影响马铃薯品质，已成为马铃薯产业发展的一大障碍。
[0004] 病原菌立枯丝核菌是一种全世界大量农作物和野生寄主的病原物，其菌核在块茎 上或土壤里越冬，或菌丝体在土壤里的植株残体上越冬，第二年春季，当温度、湿度条件适 合时，菌核萌发侵入马铃薯幼芽、幼苗，特别是有伤口时侵入更多更快。在生长季节又可侵 入根、地下茎、匍匐茎、块茎。新块茎上形成的菌核，或在土壤里又越冬的菌核，下一年遇到 适宜的环境条件，又可发生侵染。总之，该病是种薯带病和土壤传播结合的病害，因此，给防 治带来不便。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一株枯草芽孢杆菌，可抑制马铃薯立枯丝核病菌，为马铃薯立枯丝核 病的生物防治奠定基础。
[0006] 本发明抑制马铃薯丝核病菌的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subti I is) PB12，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地 址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2015年3月11日，保藏编号为CGMCC No.10603。
[0007] 本发明枯草芽孢杆菌PB12革兰氏染色阳性，杆状，两端钝平，多数菌体串联成串， 呈不规则形状。产芽孢，30°C培养24h芽孢形成率达80%以上，芽孢端生，椭圆形，不膨大， 培养至48h，芽孢全部脱落。在NYDA固体培养基上的菌落呈乳白色，褶皱，边缘不整齐，菌落 中心凸起呈脊状，易挑起。
[0008] 本发明枯草芽孢杆菌PB12在50°C可以生长，pH5. 7可以生长，7% NaCl可以生长， 厌氧条件下不生长。发酵葡萄糖产酸不产气，接触酶反应阳性，淀粉水解呈阳性，VP试验呈 阳性，利用柠檬酸盐反应呈阳性，明胶液化反应呈阳性，石蕊牛奶还原胨化反应呈阳性，硝 酸盐反应呈阳性，甲基红反应呈阳性。
[0009] 本发明枯草芽孢杆菌PB 12可在NYD培养基上生长，最适生长温度为30 °C，最适pH 为7. 2~7. 5,转速150r/min。NYD培养基由牛肉浸膏8g、酵母膏5g、葡萄糖10g、琼脂15g 和蒸馏水1000 mL组成。
[0010] 本发明枯草芽孢杆菌PB12通过16S rDNA序列比对分析，与芽孢杆菌属有极高 的同源性，同源性为98%以上。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果 确定枯草芽孢杆菌PB12属于芽孢杆菌属（Bacillus Cohn)，为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)〇 toon] 平板抑菌实验和培养瓶抑菌实验表明，在固体培养和液体培养条件下，本发明枯 草芽孢杆菌PB12均具有较强的抑制马铃薯立枯丝核病菌菌丝生长的能力，而且随着培养 天数的增加，抑菌效果越明显。
[0012] 本发明枯草芽孢杆菌PB12,属于芽孢杆菌属（Bacillus Cohn)，保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，保藏日期为2015年3月11日，保藏编号为CGMCC No. 10603。
【附图说明】
[0013] 图1为固体培养时枯草芽孢杆菌PB12的拮抗作用；图2为液体培养时枯草芽孢杆 菌PB12的拮抗作用。
【具体实施方式】
[0014] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0015] 一：本实施方式抑制马铃薯丝核病菌的枯草芽孢杆菌为枯草芽 孢杆菌PB12,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地 址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2015年3月11日，保藏编号为 CGMCCNo. 10603〇
[0016] 本实施方式枯草芽孢杆菌PB12革兰氏染色阳性，杆状，两端钝平，多数菌体串联 成串，呈不规则形状。产芽孢，30°C培养24h芽孢形成率达80%以上，芽孢端生，椭圆形，不 膨大，培养至48h，芽孢全部脱落。在NYDA固体培养基上的菌落呈乳白色，褶皱，边缘不整 齐，菌落中心凸起呈脊状，易挑起。
[0017] 本实施方式枯草芽孢杆菌PB12在50°C可以生长，pH5. 7可以生长，7% NaCl可以 生长，厌氧条件下不生长。发酵葡萄糖产酸不产气，接触酶反应阳性，淀粉水解呈阳性，VP 试验呈阳性，利用柠檬酸盐反应呈阳性，明胶液化反应呈阳性，石蕊牛奶还原胨化反应呈阳 性，硝酸盐反应呈阳性，甲基红反应呈阳性。
[0018] 本实施方式枯草芽孢杆菌PB12可在NYD培养基上生长，最适生长温度为30°C，最 适pH为7. 2~7. 5,转速150r/min。NYD培养基由牛肉浸膏8g、酵母膏5g、葡萄糖10g、琼 月旨15g和蒸馏水1000 mL组成。
[0019] 本实施方式枯草芽孢杆菌PB12由呼兰区白奎镇庆平屯马铃薯田间感病区域的土 壤中分离得到。分离方法按以下步骤进行：一、以马铃薯丝核菌为靶标，取马铃薯田间感病 区域土壤10克，放于IOOmL带玻璃珠和无菌水的三角瓶中，震摇20分钟，使土样和水充分 混合，将细胞分散。二、利用梯度稀释法稀释至IO 3UO4UO5三个梯度，将该批次的浓缩液进 行梯度稀释涂布于NYDA培养基上，置于32°C培养箱内培养18h，挑选不同菌落形态的菌株 进行标号并分离培养；分离出的单个菌落接入装有NYD培养基（5mL)的试管中，于32°C， 150r/min培养18h。选择拮抗作用强、抑菌谱广的生防菌株进行纯化、保存。即为本实施方 式的枯草芽孢杆菌PB12。
[0020] 对分离筛选得到的枯草芽孢杆菌PB12进行分子鉴定，按以下步骤进行：提取菌株 的总DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后利用胶 回收试剂盒回收纯化PCR产物；之后，进行克隆、转化，筛选阳性克隆子菌落，经扩大培养后 测序。测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，与芽孢杆菌属（Bacillus Cohn)有极高的同源性，同源性为98%以上。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生 化鉴定结果确定枯草芽孢杆菌PB12属于芽孢杆菌属（Bacillus Cohn)，为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)〇
[0021] 为验证本实施方式枯草芽孢杆菌PB12的抑菌效果，进行以下实验：
[0022] 马铃薯丝核病菌生防菌株的拮抗作用：
[0023] (1)前期准备
[0024] 将枯草芽孢杆菌PB12挑取单菌落接种于装有NYD培养基的5mL试管中，于 30°C150r/min振荡器中培养24h。再以2%的接种量接种于装有NYD培养基的50mL三角 瓶中，于30°C 150r/min振荡器中培养24h待用。
[0025] 将马铃薯立枯丝核病菌（Rhizoctonia solani Kilhn)接于PDA平板至于28°C温箱 中进行培养，待菌丝长满培养皿。所述马铃薯立枯丝核病菌（Rhizoctonia solani Kilhn) 由黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研宄所提供。
[0026] (2)固体培养条件下的拮抗作用
[0027] 以马铃薯立枯丝核病菌为靶标对象，研宄枯草芽孢杆菌PB12的拮抗作用。首先将 枯草芽孢杆菌PB12进行梯度稀释（10倍、100倍），然后在PDA培养基平板上均匀涂满各稀 释度的菌液100 μ L (包括细菌原液、10倍稀释液、100倍稀释液）。晾干后每平板分别接入 直径为8mm的靶标病原菌菌饼，设未涂枯草芽孢杆菌ΡΒ12菌液的为对照，重复3次，于28°C 培养。每天对真菌生长情况进行观察，测量抑菌圈大小。
[0028] 抑菌率（％ )=(对照菌丝直径-处理菌丝直径）/对照菌丝直径X 100 %。
[0029] (3)液体培养条件下的拮抗作用
[0030] 以马铃薯立枯丝核病菌为靶标对象，研宄枯草芽孢杆菌PB12的拮抗作用。首先将 枯草芽孢杆菌PB12进行梯度稀释（10倍、100倍），然后在装有PDA液体培养基的50ml培 养瓶中以2%的接种量分别加入各稀释度的菌液ImL (包括细菌原液、10倍稀释液、100倍稀 释液）。再于每瓶中分别接入直径为8mm的靶标病原菌菌饼，设未接种枯草芽孢杆菌PB12 菌液的为对照，重复3次，于28°C恒温摇床培养。每天对真菌生长情况进行观察，当对照组 真菌生长情况较实验组非常明显时停止培养，将菌丝过滤，并称其干重。
[0031] 抑菌率（％) = (对照菌丝重量-处理菌丝重量）/对照菌丝重量X 100%。
[0032] 实验结果如下：
[0033] (1)固体培养条件下的拮抗作用
[0034] 通过平板抑菌实验，结果表明在固体培养条件下，PB12能较强的抑制丝核病菌菌 丝的生长，而且随着培养天数的增加，抑菌效果越明显（如图1和表1)。
[0035] 表1固体培养条件下枯草芽孢杆菌PB12的拮抗效果
[0036]
【主权项】
1. 一株抑制马铃薯立枯丝核病菌的枯草芽孢杆菌，其特征在于该菌株为枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)PB12,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏 地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2015年3月11日，保藏编号为CGMCC No.10603。
【专利摘要】一株抑制马铃薯立枯丝核病菌的枯草芽孢杆菌，涉及一株枯草芽孢杆菌。本发明提供一株枯草芽孢杆菌，可抑制马铃薯立枯丝核病菌，为马铃薯立枯丝核病的生物防治奠定基础。本发明抑制马铃薯丝核病菌的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌PB12，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年3月11日，保藏编号为CGMCC No.10603。本发明枯草芽孢杆菌PB12具有较强的抑制马铃薯立枯丝核病菌菌丝生长的能力，而且随着培养天数的增加，抑菌效果越明显。CGMCC No.1060320150311
【IPC分类】C12R1-125, C12N1-20
【公开号】CN104726384
【申请号】CN201510188051
【发明人】李晶, 曹旭, 刘宇帅, 陈静宇, 张淑梅, 孟立强, 姜威, 胡基华
【申请人】黑龙江省科学院微生物研究所
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年4月20日